色譜分析技術(shù)在法醫(yī)毒物領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展*

李珊，王瀟逸，張雅楠，萬(wàn)梓莘，王元鳳，3**

（1.西南政法大學(xué)，重慶 401120；2.中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)研究院，北京 100191；3.公安部法庭毒物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；4.國(guó)家毒品實(shí)驗(yàn)室北京分中心，北京 100101）

毒物毒品不僅會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重危害，也會(huì)對(duì)社會(huì)造成極其不良的影響，是一個(gè)十分重要的社會(huì)不穩(wěn)定因素。全球范圍內(nèi)，每年都會(huì)有大量的中毒案例報(bào)告[1-4]。根據(jù)我國(guó)藥物管制部門相關(guān)報(bào)告數(shù)據(jù)顯示，2020 年我國(guó)出現(xiàn)了大約64 000 起毒品案件，涉及427 000 名吸毒人員[5]。隨著合成技術(shù)的不斷發(fā)展，新型毒品更新速度極快。各國(guó)政府進(jìn)行管控[6]。我國(guó)政府除了對(duì)傳統(tǒng)毒品、合成毒品等進(jìn)行管控外，近年來(lái)還逐步加強(qiáng)了對(duì)新精神活性物質(zhì)的管控。

在增強(qiáng)管控的同時(shí)，毒物毒品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析技術(shù)也隨著毒品更新?lián)Q代不斷發(fā)展。與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)毒物毒品檢驗(yàn)技術(shù)研究起步較晚，但近年來(lái)發(fā)展迅速。20 世紀(jì)80 年代前，我國(guó)毒物毒品檢驗(yàn)多采用薄層色譜檢驗(yàn)（TCL）結(jié)晶法、紅外光譜法（IR）、紫外線（UV）檢驗(yàn)及化學(xué)顯色法等。隨著1980 年國(guó)際交流的日益加強(qiáng)GC/MS 引入我國(guó)，我國(guó)的毒物毒品檢驗(yàn)工作進(jìn)入了新階段，此后，隨著二級(jí)質(zhì)譜、離子色譜的相繼引入，我國(guó)毒物毒品檢驗(yàn)工作進(jìn)入了快速發(fā)展期[7]。色譜分析法作為一種重要的分析技術(shù)，具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)前已被廣泛地應(yīng)用在法庭科學(xué)毒物與毒品的檢測(cè)過(guò)程。

1 色譜分析技術(shù)的原理方法與應(yīng)用特點(diǎn)

1.1 發(fā)展過(guò)程

人類對(duì)色譜法的使用始于1903 年，俄國(guó)植物學(xué)家Mikhail S.Tswett 使用柱吸附色譜技術(shù)對(duì)植物色素進(jìn)行了定性定量分離，并成功闡述了此方法的作用原理[8]。在此基礎(chǔ)上，美國(guó)學(xué)者Palmer LS等[9]進(jìn)行了應(yīng)用并在其專題報(bào)告中涉及大量色譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果。20 世紀(jì)30 年代，柱色譜分離技術(shù)開(kāi)始被逐漸應(yīng)用，將不同種類的有機(jī)化合物進(jìn)行了有效的分離并純化。自80 年代始，現(xiàn)代色譜分析開(kāi)始進(jìn)入嶄新的發(fā)展階段，能夠?qū)?fù)雜體系中的各種組分、化學(xué)性質(zhì)相近的元素及化合物進(jìn)行分析，且科學(xué)家們提出了許多保留模型[10，11]。

1.2 主要原理

色譜法又稱層析法，在分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域都具有非常廣泛的應(yīng)用，其主要是利用樣品與固定相和流動(dòng)相之間分配、吸附或交換等作用力的差異。當(dāng)兩相發(fā)生相對(duì)移動(dòng)時(shí)，各種待測(cè)物質(zhì)在兩相間經(jīng)過(guò)多次平衡而實(shí)現(xiàn)相互分離的目的。

1.3 分類方法

色譜法的分類有很多種，按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可得到不同原理的色譜方法。各種方法之間既存在差異也存在一定的交集。

1.3.1 按兩相狀態(tài)分類

按照固定相和流動(dòng)相的狀態(tài)可將色譜法分為四類：氣固色譜法、氣液色譜法、液固色譜法和液液色譜法。氣相色譜法和液相色譜法的主要分析對(duì)象分別為揮發(fā)性有機(jī)物和可以溶于水或有機(jī)溶劑的各類物質(zhì)。氣固色譜指流動(dòng)相是氣體，固定相是固體物質(zhì)的色譜分離方法。活性炭、硅膠等均可用作固定相。氣液色譜指流動(dòng)相是氣體，固定相是液體的色譜分離方法。例如在惰性材料硅藻土涂上一層角鯊?fù)椋梢苑蛛x及測(cè)定純乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烷等雜質(zhì)。在液固色譜法中，固定相是表面具有多孔特性的固體微粒吸附劑，如氧化鋁、硅膠等，能夠通過(guò)表面的吸附中心對(duì)溶質(zhì)分子和流動(dòng)相分子進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)吸附，達(dá)到吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡。液液色譜固定相包括惰性載體及涂漬在惰性載體的固定液。

1.3.2 按色譜分離機(jī)理分類

按照色譜法分離所依據(jù)的物化性質(zhì)不同，可將其分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜法等。吸附色譜法以固定相為吸附劑，利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力的差異進(jìn)行色譜分離和分析。根據(jù)使用流動(dòng)相的不同，可分為氣固吸附色譜法和液固吸附色譜法。分配色譜法則是利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離和分析的，可細(xì)分為液液分配色譜法和氣液色譜法。離子交換色譜法是用一種能交換離子的材料作為固定相，從而實(shí)現(xiàn)分離離子性化合物的色譜方法。此類方法可以用于無(wú)機(jī)離子、各類核酸衍生物或氨基酸的分離。凝膠色譜法是利用凝膠對(duì)不同大小組分產(chǎn)生不同滯留作用而實(shí)現(xiàn)分離的一種方法，主要用于較大分子的分離。

1.3.3 按固定相性質(zhì)分類

按固定相的幾何形式可以把色譜方法分為柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法。柱色譜法主要有填充柱色譜法和毛細(xì)管柱色譜法。填充柱色譜法是將固定相裝入色譜柱中，毛細(xì)管柱色譜法是將固定相涂在毛細(xì)管內(nèi)壁上。紙色譜法是將紙作為載體、以紙纖維吸附的水分或其他物質(zhì)為固定相，樣品從紙的一端開(kāi)始，用流動(dòng)相將不同組分進(jìn)行分離及分析的方法。薄層色譜法是將吸附劑均勻鋪展在玻璃或塑料板上形成薄層，在薄層上進(jìn)行分離的一種方法，可細(xì)分為吸附法、分配法及離子交換法等。

2 色譜分析技術(shù)在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

2.1 應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

法醫(yī)毒物領(lǐng)域?qū)⑸V法用來(lái)定性或定量檢測(cè)混合物中各種組分的性質(zhì)及含量。案件中檢材的數(shù)量及含量可能非常少，色譜技術(shù)的使用降低了對(duì)檢材用量的要求，一次分析過(guò)程通常只需微升量級(jí)即可。在分析過(guò)程中，色譜分析技術(shù)具有較高的分離效率，色譜柱可用來(lái)同時(shí)分離并定量幾十或上百種性質(zhì)相近的化合物。通過(guò)將各類組分的分離和分析過(guò)程合二為一，提高了整個(gè)檢測(cè)分析過(guò)程的效率，一般可在幾分鐘至幾十分鐘的時(shí)間內(nèi)完成復(fù)雜樣品的分析工作。色譜法具有較高的檢測(cè)靈敏度。隨著信號(hào)處理技術(shù)的不斷發(fā)展和檢測(cè)器的不斷升級(jí)，色譜可以檢測(cè)到10-9g 級(jí)的微量物質(zhì)，如前期將檢材進(jìn)一步處理，則可達(dá)到更低的檢測(cè)限。除此之外，色譜分析技術(shù)的選擇性良好，根據(jù)研究目的選擇合適的分離模式和檢測(cè)方法，可以有效篩選出目標(biāo)物質(zhì)，將其他各類干擾物進(jìn)行排除。

2.2 常用方法

目前應(yīng)用較多的色譜分析技術(shù)有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。研究人員根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的或樣品性質(zhì)來(lái)選擇合適的方法進(jìn)行分析。

2.2.1 薄層色譜法

薄層色譜法是法醫(yī)毒物領(lǐng)域中一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)驗(yàn)人員將待測(cè)樣品在固定相薄層上，待其展開(kāi)后，將其色譜圖與對(duì)照物質(zhì)的色譜圖中的比移值對(duì)比，可以實(shí)現(xiàn)定性或定量分析，可用于有效分離脂肪酸、氨基酸及生物堿等多種物質(zhì)。薄層色譜法具有操作方便、顯色容易、展開(kāi)速率快等優(yōu)勢(shì)，但不適用于定量分析，對(duì)生物高分子的分離效果不理想。王鴻飛等[12]利用薄層色譜掃描發(fā)對(duì)毒駕現(xiàn)場(chǎng)的常見(jiàn)毒品進(jìn)行了分析，選用復(fù)方甘草片作為含嗎啡、可待因的混合物進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示復(fù)方甘草片成分實(shí)現(xiàn)了有效分離且不會(huì)造成組間干擾，顯色效果也不錯(cuò)。[13]。陳學(xué)國(guó)等[14]針對(duì)“浴鹽”中的主要成分甲卡西酮類涉及藥物MDPV 通過(guò)薄層色譜法進(jìn)行了檢測(cè)，采用鋁-二氧化硅基質(zhì)薄層色譜板，乙酸乙酯-甲醇-25%的氨水（85∶10∶5）為展開(kāi)劑，在254 nm 的紫外光照射下，斑點(diǎn)呈現(xiàn)為亮黃色，通過(guò)茚三酮顯色劑顯色，斑點(diǎn)變?yōu)樗{(lán)色。表1 歸納整理了部分薄層色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用。

表1 薄層色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

2.2.2 氣相色譜法

氣相色譜法是法醫(yī)毒物領(lǐng)域中一項(xiàng)主要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)將氦氣或者氬氣作為載氣，將混合物注入裝有固定相的色譜柱中，從而實(shí)現(xiàn)不同組分分離的一種方法。近年來(lái)，氣相色譜法快速發(fā)展，被國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。氣相色譜法的分離效率高，一根色譜柱可以分離多種性質(zhì)類型的復(fù)雜樣品，分析速度快。還具有高靈敏度和高選擇性等多個(gè)優(yōu)勢(shì)。氣相色譜法適用于揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性好的物質(zhì)，對(duì)于其他物質(zhì)的分離分析能力一般。目前在法醫(yī)毒物領(lǐng)域，用于氣相色譜和氣質(zhì)聯(lián)用色譜分離及檢測(cè)的檢材包括體外毒品和生物檢材中的毒品及其代謝產(chǎn)物。表2 歸納整理了部分近年來(lái)氣相色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用。

表2 氣相色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

2.2.3 液相色譜法

液相色譜法是法醫(yī)毒物領(lǐng)域中一項(xiàng)實(shí)用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。與氣相色譜法相比，高效液相色譜法可應(yīng)用在熱不穩(wěn)定、高沸點(diǎn)、離子型物質(zhì)中，具有分離效能高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快等多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，但其采購(gòu)成本及日常維護(hù)成本較高。隨著毒物毒品種類的不斷增多，氣相色譜法已無(wú)法繼續(xù)滿足檢材定量的需求。液相色譜法因具有更高的靈敏度，可以顯著降低其最低檢測(cè)限、更強(qiáng)的適用性而被研究人員們廣泛使用，有效提高了檢材中的毒品檢出率。表3 歸納整理了部分近年來(lái)液相色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用。

表3 液相色譜法在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

2.3 適用對(duì)象

2.3.1 體外疑似毒品

體外毒品主要是在公安偵查部門繳獲后進(jìn)行相應(yīng)的研究。甲基苯丙胺（Methamaphetamine，MA）是目前國(guó)內(nèi)外濫用程度最高的新型毒品之一，作為一種合成毒品，其主要成分是苯丙胺化合物，具有中樞神經(jīng)興奮和致幻等效果，屬于聯(lián)合國(guó)精神藥品公約管制的一類物質(zhì)[28]。夏久智[29]建立了一種快速分析疑似毒品中甲基苯丙胺含量的方法，將氣相色譜儀與FID 檢測(cè)器聯(lián)合使用，結(jié)果顯示此方法可用于疑似毒品中的甲基苯丙胺檢測(cè)，在0.01～0.5 mg/ml 濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。于雷等[30]使用GC/MS 對(duì)其中對(duì)“卡痛”檢材中的O-去甲基曲馬多、帽柱木堿、鉤藤堿等主要成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明檢材中O-去甲基曲馬多濃度為24.5 mg/ml，其線性關(guān)系良好（r2=0.9993），檢測(cè)限為0.1 μg/ml，回收率為99.6%～105.2%（n=5），日內(nèi)和日間精密度均小于6.41%。除了傳統(tǒng)毒品和合成類毒品外，近年來(lái)隨著市場(chǎng)上新精神活性物質(zhì)的大量出現(xiàn)，相應(yīng)體外檢測(cè)研究也日益增多。錢振華等[31]用GC-MS、超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF MS）和紅外光譜法對(duì)中國(guó)首次繳獲的未知芬太尼類物質(zhì)進(jìn)行定性檢驗(yàn)，其將未知樣品均勻研磨后，用甲醇配制成1 mg/ml 的溶液，超聲離心后取上清液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示當(dāng)保留時(shí)間為13.5 min 時(shí)，未知組分的質(zhì)譜碎片主要特征離子峰經(jīng)NIST 譜庫(kù)檢索確定為卡芬太尼。何天宇等[32]通過(guò)建立氟胺酮的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法，利用GC/MS 成功地對(duì)氟胺酮進(jìn)行了定性分析，結(jié)果顯示該方法檢測(cè)的氟胺酮最低檢出限是10 μg/ml，且在0.2～1.0 mg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 生物檢材中的毒品及代謝物檢測(cè)

法醫(yī)毒物實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)的生物檢材包括血液、尿液及毛發(fā)。每種生物檢材都具有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。血液是毒物毒品檢測(cè)中較常用的一種檢材，血液中含有較高濃度的毒品及代謝物。但血液的抽取過(guò)程復(fù)雜，且容易對(duì)操作人員造成一定的安全隱患。血液的檢測(cè)時(shí)限一般在3 天左右，如果檢測(cè)不及時(shí)，血液中存在的乙醇等易揮發(fā)性物質(zhì)含量容易發(fā)生較大程度的改變，導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果。孟品佳等[33]建立了血液中嗎啡類毒品的GC/MS檢測(cè)方法，以V（CHCl3）∶V（異丙醇）∶V（正庚烷） =50∶17∶33 為萃取溶劑，并通過(guò)MSTFA衍生，結(jié)果顯示嗎啡、6-單乙酰嗎啡、可待因的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，血液檢測(cè)的最低濃度可達(dá)到5 ng/ml，定量范圍為10～1000 ng/ml。毒品在體內(nèi)完成代謝后一般通過(guò)尿液排出，當(dāng)吸毒嫌疑人吸食毒品短時(shí)間內(nèi)可從其尿液中檢測(cè)到相對(duì)含量較高的毒品原體及體內(nèi)代謝產(chǎn)物。但是尿液檢材中毒品的檢出時(shí)限較短，一般在1 周內(nèi)，容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。此外，因尿液檢材的采集涉及隱私，需吸毒嫌疑人獨(dú)自采集，就容易出現(xiàn)稀釋、替換或者污染的風(fēng)險(xiǎn)。彭山珊等[34]建立了尿液中甲基苯丙胺、MDMA、氯胺酮等6 種常見(jiàn)毒品檢測(cè)方法并對(duì)各種毒品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果顯示保留時(shí)間越長(zhǎng)的毒品，保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間的偏差越小，濃度越大，離子比率偏差越趨于穩(wěn)定。

與尿液和血液檢材相比，毛發(fā)在穩(wěn)定性、判斷吸毒人員數(shù)月內(nèi)的吸毒情況等方面更具有優(yōu)勢(shì)，且其生長(zhǎng)周期有一定的規(guī)律。有關(guān)研究表明[36]，頭發(fā)的生長(zhǎng)周期為0.6～1.4 cm/月[35]。國(guó)際毛發(fā)檢測(cè)協(xié)會(huì)建議，毛發(fā)的生長(zhǎng)周期應(yīng)為1 cm/月。但需要注意的是，染發(fā)、燙發(fā)等外部手段干預(yù)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。孟品佳等[37]通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比了兩類毒品濫用者毛發(fā)的特點(diǎn)，海洛因吸食人員的毛發(fā)使用甲醇超聲的方式處理，調(diào)整pH 值后進(jìn)行液相萃取，萃取物揮干后衍生化處理并GC/MS 分析；而甲基苯丙胺吸食者的毛發(fā)堿性消解后，采用小體積萃取，隨后進(jìn)行衍生化處理并GC/MS 分析，檢測(cè)結(jié)果顯示阿片類毒品的最低檢出限均低于3 μg/g，4 種苯丙胺類毒品的最低檢出限為0.05 μg/g。

3 色譜分析技術(shù)在法醫(yī)毒物領(lǐng)域的趨勢(shì)與展望

3.1 多技術(shù)聯(lián)用

每種分析方法都具有各自的優(yōu)勢(shì)和局限。隨著新型化合物種類的不斷增多，結(jié)構(gòu)種類的逐漸復(fù)雜，單一一種分析技術(shù)已不能達(dá)到準(zhǔn)確分析的要求。此時(shí)，聯(lián)用技術(shù)和儀器應(yīng)運(yùn)而生。色譜法與其他分析方法的聯(lián)用，能夠取長(zhǎng)補(bǔ)短，有效提高物質(zhì)分析的靈敏度、速度及鑒別能力，已逐漸發(fā)展成為現(xiàn)代分析化學(xué)的重要發(fā)展方向。目前，無(wú)論是在國(guó)外還是國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室中，各種色譜技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合使用已成為主流。常見(jiàn)的色譜聯(lián)用技術(shù)包括色譜-色譜聯(lián)用、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和色譜-光譜聯(lián)用等。色譜-色譜聯(lián)用又稱為多維色譜，是多種不同類型的色譜共同使用，能夠有效提高色譜的分辨能力，但難于分辨未知物。色譜-質(zhì)譜和色譜-光譜則能彌補(bǔ)這一不足，可以分析多組分混合物中的未知組分，快速、精準(zhǔn)地得到分析結(jié)果，判定目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)和分子量。常用的色譜-質(zhì)譜和色譜光譜包括GC-MS、GC-FTIR、LC-MS、LC-NMR 等。Gicquel T 等[38]研 究 中 使用LC-MS/MS 方法對(duì)生物檢材中的氟胺酮進(jìn)行了定性檢驗(yàn)，另使用LC-HRMS 和NMR 對(duì)三種粉末樣品進(jìn)行定性定量檢驗(yàn)，結(jié)果顯示毛發(fā)檢材中的氟胺酮檢出限已能達(dá)到pg 級(jí)。

3.2 新技術(shù)發(fā)展

色譜技術(shù)是近現(xiàn)代儀器分析的一個(gè)重要研究領(lǐng)域，自首次使用至今，色譜分析技術(shù)的發(fā)展已日趨成熟，但技術(shù)層面和應(yīng)用層面的研究及探索卻從未止步。固定相和流動(dòng)相作為色譜技術(shù)中的核心組成部分，對(duì)于它們的研究和創(chuàng)新不斷擴(kuò)充著色譜法的應(yīng)用領(lǐng)域，如使用手性固定相可有效分離并檢測(cè)手性化學(xué)物等。第四代色譜填料的整體柱技術(shù)近年來(lái)已成為液相色譜發(fā)展的熱點(diǎn)，整體柱是將填料單體、引發(fā)劑、制孔劑等混合后原位聚合或固化在管中形成的多孔結(jié)構(gòu)柱體，多孔結(jié)構(gòu)使得整體柱有很好的通透性，有效降低了柱壓，提高了柱效和重現(xiàn)性，能夠?qū)崿F(xiàn)待測(cè)物的快速分離分析。此外，檢測(cè)器如何能更靈敏地捕捉有效信號(hào)也是研究人員探索的一個(gè)方向，半導(dǎo)體激光熒光檢測(cè)器等新型檢測(cè)器的逐漸普及有效提高了檢測(cè)器的靈敏度。

3.3 檢測(cè)方法及流程的完善

法醫(yī)毒物領(lǐng)域的鑒定工作多按照司法鑒定標(biāo)準(zhǔn)或技術(shù)規(guī)范進(jìn)行，標(biāo)準(zhǔn)中會(huì)對(duì)檢材的前處理和分析方法進(jìn)行大概描述，但多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)中僅涉及了色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)分析方法和流程的具體選用流程和使用條件尚無(wú)詳細(xì)明確的規(guī)范性規(guī)定，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)人員或同領(lǐng)域內(nèi)其他相關(guān)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇。隨著色譜分析技術(shù)的不斷深入研究和廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的檢測(cè)分析技術(shù)難關(guān)被突破。相信在今后的發(fā)展中，建立獨(dú)立的色譜分析技術(shù)使用標(biāo)準(zhǔn)或技術(shù)規(guī)范，不斷完善法醫(yī)毒物檢測(cè)分析方法和流程會(huì)是一個(gè)重要的發(fā)展趨勢(shì)。