增齡相關(guān)肌少性肥胖的生物信息學(xué)分析

付婉瑞，古再麗努爾·卡德?tīng)?，馮穎

復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科，上海 200040

全球人口老齡化正在加劇。據(jù)聯(lián)合國(guó)《世界人口展望（2019）》報(bào)告，預(yù)計(jì)2050年，全球65 歲以上和80歲以上人口將分別占總?cè)丝诘?6%和5%；而中國(guó)65歲以上人口接近總?cè)丝诘?0%。老年人數(shù)量的急劇增加，使增齡相關(guān)健康問(wèn)題得到了越來(lái)越多的關(guān)注，包括因增齡相引起的身體成分變化，如骨量和肌肉量下降、脂肪量增加等。肌肉減少癥（Sarcopenia），簡(jiǎn)稱“肌少癥”，是指與年齡相關(guān)的肌肉質(zhì)量和力量下降，可能合并軀體功能的衰退［1］。據(jù)報(bào)道，在全球60 ～70歲人群中，肌少癥的患病率為5%～13%，而80 歲及以上人群中，患病率可增至50%［2］。相較于老年人骨骼肌質(zhì)量的增齡性下降，有研究發(fā)現(xiàn)，75 歲前體重和體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）通常表現(xiàn)為增加，且多在穩(wěn)定一段時(shí)間后才開(kāi)始下降［3］，這是因?yàn)楣趋兰≠|(zhì)量的下降常伴隨著脂肪量的增加，超重和肥胖可掩蓋肌少癥的早期變化［4］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，肌少癥和肥胖具有多種重疊的病因和反饋機(jī)制，且二者間具有協(xié)同作用［5］。由此，肌少性肥胖（Sarcopenic Obesity，SO）用以描述肌少癥與肥胖共存的狀態(tài)［6］。目前，SO的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未達(dá)成共識(shí)，故其流行病學(xué)尚不清楚；雖有多項(xiàng)SO 患病率的調(diào)研［7］，但患病率估計(jì)值存在較多差異，從0%至41%，多見(jiàn)于老年人群。眾所周知，肌少癥患者發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)可顯著增加，包括跌倒、殘疾、住院和死亡；而肌少癥在肥胖患者中最容易被忽視，SO 發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)更大；但肌少癥和肥胖都存在一定的可逆性，及早診治可大大降低發(fā)生不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)。

SO 的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，造成了治療上的困難。尋找同時(shí)調(diào)控增齡、肌少癥與肥胖的靶點(diǎn)途徑，可使治療事半功倍。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)多組分子生物信息數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，旨在探討SO 的發(fā)病機(jī)制與可能的治療靶點(diǎn)，為增齡相關(guān)SO 的診斷和治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

本研究分別以“Aging”、“Sarcopenia”、“Obesity”在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene）、 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.genecards.org）、 Disgenet 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.disgenet.org／）、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／www.omim.org／）進(jìn)行檢索，將結(jié)果分別進(jìn)行匯總、去重，即得到該疾病的靶點(diǎn)基因，將以上三部分結(jié)果取交集之后便獲得Aging-Sarcopenia-Obesity 共同的靶點(diǎn)基因。

1．2 方法

1．2．1 靶點(diǎn)基因功能注釋及通路富集分析本研究將靶點(diǎn)基因輸入DAVID 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)（2021 Update） （ https：／ ／david.ncifcrf.gov／home.jsp）在線工具進(jìn)行分析，并進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的富集分析，結(jié)果篩選以P＜0.01、 FDR ＜0.01 同時(shí)通路富集基因數(shù)＞3 為標(biāo)準(zhǔn)，GO 富集分析分為三個(gè)方面，分別是：分子功能（Molecular Function，MF）、生物學(xué)過(guò)程（Biological Process，BP） 和細(xì)胞組分（Cell Component，CC）。

1．2．2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵基因的獲取本研究將靶點(diǎn)基因輸入STRINGv11.5 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／cn.string-db.org／）分析基因調(diào)控的蛋白質(zhì)相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI），將最低互作分值設(shè)置為置信度＞0.9（最高置信度），并且隱藏獨(dú)立靶點(diǎn)。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件v3.7.1 進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)可視化分析，再利用Cytohubba 插件計(jì)算各基因的節(jié)點(diǎn)值，保留節(jié)點(diǎn)值≥12 的結(jié)果，然后使用MCODE 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)模塊分析。

1．2．3 預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因相關(guān)miRNAs 本研究使用ToppGene 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／ ／toppgene.cchmc.org／）檢索靶向所有共同靶點(diǎn)基因的miRNAs。參數(shù)設(shè)定：（1）Correction：FDR；（2） P-Value cut off：0.05；（3）GeneLimts：1≤n≤2 000；（4）Source：miRTarbase。

2 結(jié)果

2．1 共同靶點(diǎn)基因的獲取

使用“Aging”、“Sarcopenia”、“Obesity”作為關(guān)鍵詞，物種選擇為“9606”（Homo Sapiens，智人）進(jìn)行搜索，在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到1 033、54、2 056 個(gè)結(jié)果，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到26 415、266、9 227個(gè)結(jié)果，在Disgenet 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到1、164、2 821 個(gè)結(jié)果、在OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到364、8、317 個(gè)結(jié)果；將各部分的靶點(diǎn)基因進(jìn)行匯總，去重，分別得到26 400、1 279、9 745 個(gè)結(jié)果；將各部分匯總結(jié)果取交集，得到984 個(gè)共同調(diào)節(jié)Aging-Sarcopenia-Obesity 的靶點(diǎn)基因，使用jvenn（http：／ ／jvenn.toulouse.inra.fr／app／example.html）進(jìn)行結(jié)果可視化。見(jiàn)圖1。

圖1 Aging-Sarcopenia-Obesity 共同靶點(diǎn)基因的韋恩圖

2．2 對(duì)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 分析

利用DAVID 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)（2021 Update）對(duì)靶點(diǎn)基因分別進(jìn)行GO 和pathway 分析。結(jié)果如圖2 所示，GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，靶基因的分子功能主要涉及蛋白結(jié)合等；生物學(xué)過(guò)程主要涉及增齡、藥物應(yīng)答以及缺氧應(yīng)答等；細(xì)胞組分主要定位在胞漿、外泌體和細(xì)胞外等，KEGG 分析顯示，靶點(diǎn)基因主要與腫瘤、PI3K-Akt 信號(hào)通路、腫瘤miRNAs 等通路有關(guān)。

圖2 GO 和KEGG 分析

2．3 對(duì)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)模塊分析

本研究的PPI 分析共得到725 個(gè)蛋白6 854 對(duì)關(guān)系（圖3）。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件并用Cytohubba插件計(jì)算出各基因的節(jié)點(diǎn)值（Degree），篩選得到節(jié)點(diǎn)值≥12 的基因357 個(gè)（圖4）。其中，TP53、EP300、STAT3等基因的節(jié)點(diǎn)值最大，說(shuō)明其在該網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用。此外，使用MCODE 插件構(gòu)建及篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的子網(wǎng)絡(luò)模塊。結(jié)果顯示，顯著性最高的4 個(gè)模塊為IL-6/STAT3、TP53、RELA（NF-κB 家族成員之一）、EP300網(wǎng)絡(luò)（圖5，score 得分越高，代表該子網(wǎng)絡(luò)模塊的作用越關(guān)鍵），各模塊中的基因名稱見(jiàn)表1。

圖5 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中的子網(wǎng)絡(luò)模塊

表1 子網(wǎng)絡(luò)模塊的分析結(jié)果

2．4 對(duì)共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行miRNAs 預(yù)測(cè)分析

使用ToppGene 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNAs 的結(jié)果見(jiàn)表2（僅列出P值最小的前10 個(gè)結(jié)果）。本研究結(jié)果顯示miR-26b-5p、 miR-155-5p、 miR-34a-5p 等miRNAs 最有可能影響增齡相關(guān)肌少性肥胖的疾病進(jìn)程。

表2 miRNA 的預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

衰老的九大特征之一便是細(xì)胞衰老，代表著細(xì)胞增殖（生長(zhǎng)）的不可逆終止，同時(shí)伴隨多種表型變化，如釋放許多生物活性分子：促炎細(xì)胞因子，趨化因子，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，血管生成因子，蛋白酶，生物活性脂質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)成分和基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinases，MMP），統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP）［7-9］。在衰老過(guò)程中，脂肪炎癥導(dǎo)致脂肪重新分布到腹腔內(nèi)區(qū)域（內(nèi)臟脂肪）和浸潤(rùn)到骨骼肌，脂質(zhì)及其衍生物在肌肉細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間積聚，誘導(dǎo)線粒體功能障礙，干擾脂肪酸的β 氧化，增強(qiáng)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產(chǎn)生，導(dǎo)致脂質(zhì)毒性和胰島素抵抗，進(jìn)一步增強(qiáng)促炎細(xì)胞因子的分泌。反過(guò)來(lái)，肌肉分泌的細(xì)胞因子可能會(huì)加劇脂肪組織萎縮，維持慢性低度炎癥，并導(dǎo)致局部高脂血癥，胰島素抵抗和全身性炎癥的惡性循環(huán)，從而促進(jìn)SO 的發(fā)展［10］。到目前為止，盡管有大量的研究探討骨骼肌與脂肪的關(guān)系，SO 發(fā)病機(jī)制仍未闡述清楚。

近年來(lái)，由于高通量生物技術(shù)的快速發(fā)展，從分子水平到臨床層面產(chǎn)生的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)呈爆發(fā)增長(zhǎng)，伴隨而來(lái)的還有數(shù)以千計(jì)的生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)。這些數(shù)據(jù)庫(kù)基本可以分為一次數(shù)據(jù)庫(kù)和二次數(shù)據(jù)庫(kù)兩類，一次數(shù)據(jù)庫(kù)主要?dú)w類整理了實(shí)驗(yàn)室的原始數(shù)據(jù)，而二次數(shù)據(jù)庫(kù)主要依照特定物種、特定目的收集整理數(shù)據(jù)，其專業(yè)性更強(qiáng)，操作門(mén)檻更低，可以幫助更多的非計(jì)算機(jī)專業(yè)的研究者進(jìn)行生物信息學(xué)分析。目前，以生信分析為目的構(gòu)建的數(shù)據(jù)整合平臺(tái)層出不窮，使生信分析變得更加簡(jiǎn)便，為解讀基因信息、探究疾病機(jī)制、進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)提供了巨大幫助，促進(jìn)了當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)和生物信息學(xué)的蓬勃發(fā)展。例如，DAVID 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)是最常用最權(quán)威的基因功能注釋工具之一，用于分析基因背后的生物學(xué)意義； STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)是擁有蛋白質(zhì)相互作用信息最大的數(shù)據(jù)庫(kù)之一。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)，探討增齡相關(guān)性肌少癥和肥胖可能的共同發(fā)病機(jī)制。通過(guò)查詢四大數(shù)據(jù)庫(kù)，本研究共找到984 個(gè)調(diào)節(jié)增齡、肌少癥、肥胖的靶基因。分析結(jié)果顯示，增齡相關(guān)的細(xì)胞間通訊改變?cè)赟O 中發(fā)揮重要作用。

P53，由TP53 基因編碼的蛋白，是眾所周知的“基因組守護(hù)者”，可以通過(guò)幾種不同的翻譯后修飾機(jī)制（磷酸化、甲基化、乙酰化等）在細(xì)胞衰老中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EP300 基因編碼的P300 蛋白，是最廣為人知的與P53 乙?；嚓P(guān)的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶之一。P53 和P300 在肌細(xì)胞行使正常功能中不可或缺，同時(shí)參與調(diào)節(jié)脂肪酸降解、脂質(zhì)合成以及脂肪分化［11-14］。最新研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TP53 基因發(fā)生G 等位基因突變時(shí)，SO 患病風(fēng)險(xiǎn)增加［15］。

P53 和P300 除直接調(diào)控細(xì)胞的增殖分化與代謝外，還參與調(diào)節(jié)SASP?？偹苤准?xì)胞介素6（Interleukin-6，IL-6）是SASP 主要成分之一，它在正常衰老過(guò)程中的表達(dá)增加，是衰老的加速器。IL-6 表達(dá)受到核因子Kappa B（Nuclear Factor-KappaB，NF-κB）調(diào)控，而NF-κB 和P53 通路之間的相互拮抗，P300 可以通過(guò)NF-κB 促進(jìn)IL-6 轉(zhuǎn)錄［16-17］。IL-6 可以通過(guò)JAK／ STAT3 途徑調(diào)控衰老，其主要機(jī)制包括與P53 和P21 的啟動(dòng)子結(jié)合，以及與其他途徑（如P300 -CBP、NF-κB）相互作用［18-19］。最新研究表明，IL-6／STAT3通路可以促使白色脂肪組織產(chǎn)熱增加和脂肪分解的上調(diào)，而抑制該途徑可抑制前脂肪細(xì)胞的SASP 以及SASP 在體外誘導(dǎo)的脂肪組織炎癥［20-21］。IL-6 在骨骼肌蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中具有雙向作用。全身性IL-6的急性增加會(huì)促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)和肥大，但其持續(xù)升高（如癌癥或糖尿病）會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮［22-23］。已有研究報(bào)道，SO 患者比正常人以及僅為肌少癥的患者具有更高的IL-6 水平［24］。

MiRNAs，非編碼的短小的RNA，可以經(jīng)由細(xì)胞分泌到血液循環(huán)中，介導(dǎo)細(xì)胞間和組織器官間的信息傳遞。據(jù)報(bào)道［25］，衰老會(huì)改變肌肉中的miRNAs 水平，這些變化可能對(duì)肌肉的質(zhì)量和數(shù)量產(chǎn)生不利影響。來(lái)自嚙齒類動(dòng)物的研究證據(jù)表明，脂肪衍生的miRNAs 可通過(guò)外泌體運(yùn)輸?shù)礁鞣N宿主細(xì)胞，包括肌細(xì)胞，肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；同樣，骨骼肌衍生的miRNAs可被脂肪組織吸收［25］。miRNAs 的這種串?dāng)_機(jī)制使得其成為增齡相關(guān)肌少性肥胖的潛在治療靶點(diǎn)。本研究預(yù)測(cè)miR-26b-5p、 miR-155-5p、 miR-34a-5p 等miRNAs 在增齡相關(guān)肌少性肥胖發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，而已有研究表明，miR-26b 是脂肪生成所必需的，它可以通過(guò)靶向ADAM 金屬肽酶結(jié)構(gòu)域17（ADAM Metallopeptidase Domain 17，ADAM17）增加脂質(zhì)積累［26］，通過(guò)靶向磷酸酶和張力蛋白同源物（Phosphatase and Tensin Homolog，PTEN）誘導(dǎo)細(xì)胞分化［27］。一項(xiàng)對(duì)老年肌少癥患者血漿的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-155 含量降低［28］?？偟膩?lái)說(shuō)，miRNAs 分別在肥胖、肌少癥領(lǐng)域有初步的探索，但仍缺乏足夠的證據(jù)闡明其機(jī)制，在增齡相關(guān)肌少性肥胖中更需要進(jìn)一步的研究。

生活方式干預(yù)是預(yù)防和治療增齡相關(guān)SO 的有效基本策略，適宜的有氧運(yùn)動(dòng)、抗阻訓(xùn)練聯(lián)合膳食調(diào)整可明顯改善老年SO 患者的身體功能。骨骼肌和脂肪間的通訊改變無(wú)疑在其中起著重要作用，但調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)P53、 P300、 IL-6／STAT3 通路、 miR-26b-5p 等miRNAs 以及它們參與的SASP 調(diào)節(jié)可能在增齡相關(guān)SO 發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，為進(jìn)一步解析及診療增齡相關(guān)SO 提供了線索。由于本研究是運(yùn)用數(shù)據(jù)庫(kù)及生物信息學(xué)分析手段進(jìn)行的探索性工作，研究結(jié)果仍需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。