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    偽狂犬病毒在BHK-21懸浮細胞中的增殖特性

    2022-06-12 01:20:07陳麗倪敏舒徐悅鮑熹惲君雯馮磊郭美錦
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:狂犬病毒谷氨酰胺滴度

    陳麗 倪敏舒 徐悅 鮑熹 惲君雯 馮磊 郭美錦

    摘要:為考察BHK-21懸浮細胞增殖偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)工藝參數(shù)及病毒增殖過程中代謝動力學(xué),將PRV接種于BHK-21懸浮細胞,考察接毒時細胞密度、病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)及收毒時間對病毒效價的影響,測定培養(yǎng)過程中葡萄糖(Gluc)、乳酸(Lac)和谷氨酰胺(Gln)濃度,計算病毒增殖過程中各參數(shù)代謝速率。結(jié)果顯示,將MOI為0.01 的PRV病毒接種BHK-21懸浮細胞,其病毒滴度在42 h達最高8.5 lgTCID50/mL。代謝參數(shù)檢測結(jié)果表明,BHK-21細胞在接毒36 h后細胞開始出現(xiàn)死亡。PRV在BHK-21懸浮細胞中的增殖特性為偽狂犬病毒的規(guī)?;囵B(yǎng)及疫苗開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:BHK-21細胞;偽狂犬病毒;懸浮培養(yǎng);細胞代謝特性

    中圖分類號:S852.65+5 ??文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2022)10-0166-05

    偽狂犬病是一種由偽狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)誘發(fā)的急性傳染病[1-2]。該病具有傳播速度快、病死率高、病原體頑固等特點[3-4]。世界范圍內(nèi)已有幾十個地區(qū)報道過該病,約有35種動物可感染此病,豬是主要的病毒儲存宿主和傳染源[5]。中國自從在1947年第一次發(fā)現(xiàn)該病,現(xiàn)已擴展到多個地區(qū),給我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來沉重的經(jīng)濟損失,并且該病具有不斷蔓延的趨勢[6-7]。防治和消滅PRV的主要手段是接種疫苗[8-9]。目前,國內(nèi)的偽狂犬病疫苗生產(chǎn)工藝沿用傳統(tǒng)技術(shù),采用Vero、BHK-21 等貼壁細胞培養(yǎng),其操作要求高、工藝復(fù)雜、病毒效價不穩(wěn)定,實際應(yīng)用有限[10]。因此,建立高效的病毒懸浮培養(yǎng)體系尤為重要[11]。幼地倉鼠腎細胞(baby hamster kidney,BHK-21)可進行體外增殖PRV,是PRV增殖的最優(yōu)宿主細胞之一[12-13]。利用生物反應(yīng)器連續(xù)懸浮生產(chǎn)具有操作簡單、易放大、易控制、產(chǎn)品純度高、穩(wěn)定性好等特點[14-15],可提高病毒制備效率。因此,反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)是當(dāng)今生物醫(yī)藥、獸用醫(yī)藥行業(yè)的核心技術(shù)。

    本研究以偽狂犬病毒為對象,對其在BHK-21懸浮細胞上的生長、代謝及PRV增殖能力進行研究,建立了最佳病毒培養(yǎng)工藝,以期為大規(guī)模工業(yè)制備偽狂犬病疫苗奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞及毒株

    BHK-21細胞、BHK-21懸浮細胞和PRV毒種,均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物免疫工程研究所提供。

    1.2 主要試劑及設(shè)備

    DMEM 培養(yǎng)基,新生牛血清(newborn calf serum,NBS),購自Gibco公司;懸浮培養(yǎng)基,購自內(nèi)蒙古金源康公司;二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);生物反應(yīng)器(Applikon);-80 ℃超低溫冰箱(Thermo);倒置顯微鏡(OLYMPUS);二氧化碳搖床等。

    1.3 不同細胞密度接毒對病毒滴度影響

    調(diào)整BHK-21懸浮細胞密度為0.5×106、1.0×106、2.0×106、3.0×106 cells/mL,按MOI 0.01接毒PRV,置于37 ℃、5.0% 二氧化碳搖床中 170 r/min 培養(yǎng),分別在接毒后24 h和48 h取樣,測定病毒滴度。

    1.4 不同MOI和收毒時間對病毒滴度影響

    調(diào)整BHK-21懸浮細胞密度為1×106 cells/mL,分別接種MOI為0.0 001、0.001、0.01、0.1 PRV,置于37 ℃、5.0% 二氧化碳搖床中170 r/min培養(yǎng),分別在接毒后不同時間取樣,測定病毒滴度。

    1.5 營養(yǎng)物、代謝物檢測及代謝速率計算

    BHK-21細胞比生長速率μ(h-1)計算公式:

    μ=1t·lnCtC0。(1)

    式中:t為時間,h;Ct為在時間t時活細胞的密度,個/mL;C0為初始活細胞密度,個/mL。

    采用Nova 400生化分析儀測出葡萄糖、谷氨酰胺及乳酸濃度。葡萄糖比消耗速率(qGlu)、谷氨酰胺比消耗速率(qGln)、乳酸比生成速率(qLac),乳酸對葡萄糖消耗的得率系數(shù)(YLac/Glu)分別按公式 (2)~(4)進行計算:

    qGlu或qGln=1x·dSdt;(2)

    qLac=1x·dPdt;(3)

    YLax/Glu=-dPdS。(4)

    式中:X為活細胞密度,106個/mL;t為時間,h;S為葡萄糖濃度或谷氨酰胺濃度,mmol/L;P為乳酸濃度,mmol/L。

    攝氧率[OUR,mmol/(L·h)]及比耗氧速率[SOUR,mmol/(g·h)]測定:以進氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程[16-17],計算OUR和SOUR:

    OUR=FinVCO2in-C惰in·CO2in1-(CO2out+CCO2out·f;(5)

    f=273273+Tin·Pin·11+h×10-5;(6)

    SOUR=OURX。(7)

    式中:Fin表示進氣流量,min;V表示反應(yīng)器細胞總體積,L;C惰in表示進氣中惰性氣體質(zhì)量分率;CO2in表示進氣中O2質(zhì)量分率;CCO2in表示進氣中CO2質(zhì)量分率;CO2out表示排氣中O2質(zhì)量分率;CCO2out表示排氣中CO2質(zhì)量分率;Tin表示進氣溫度 ℃;Pin表示進氣壓強,Pa;h表示進氣相對濕度,%;X表示活細胞密度,106個/mL。

    1.6 PRV在BHK-21懸浮細胞中增殖培養(yǎng)方法

    溶氧(DO)電極和pH標定完后,與1 L罐體一起用121 ℃高壓滅菌40 min,BHK-21懸浮細胞以初始細胞密度為5×105 cells/mL,DO為50%,pH值為7.2,攪拌速度為150 r/min,培養(yǎng)溫度為37 ℃ 進行培養(yǎng)。細胞密度達4×106 cells/mL后分配至4個平行生物反應(yīng)器中,不同時間取樣細胞計數(shù),測定病毒效價以及葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺等濃度。

    1.7 病毒滴度的測定

    含10%牛血清正常培養(yǎng)的BHK-21細胞在96孔板上長至單層時,棄上清,接入10倍連續(xù)梯度稀釋的病毒樣品,每孔加入100 μL,病毒稀釋液采用含2%牛血清DMEM培養(yǎng)基,設(shè)正常細胞對照僅加維持液100 μL;放置于37 ℃、5.0% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察接毒后細胞與空白對照細胞形態(tài),連續(xù)觀察4~5 d直至細胞病變不再增加,記錄最終結(jié)果,按Reed-Muench兩氏法計算病毒滴度,結(jié)果以lg TCID50/mL表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同細胞密度接毒對病毒滴度的影響

    BHK-21不同細胞密度增殖PRV病毒滴度結(jié)果見圖1。由圖1可知,MOI為0.01時,PRV在BHK-21細胞密度分別為0.5×106 和3×106 cells/mL接毒時 48 h 病毒滴度明顯低于1×106 和2×106 cells/mL接毒時滴度,1×106 cells/mL細胞密度接毒時病毒滴度最高。從培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)時間與產(chǎn)品效價綜合考慮,降低接毒時細胞密度可節(jié)約培養(yǎng)基用量和細胞培養(yǎng)時間,降低疫苗生產(chǎn)成本,因此生產(chǎn)中最佳接毒細胞密度為1×106 cells/mL。

    2.2 不同MOI和收毒時間對病毒滴度的影響

    不同MOI接種BHK-21懸浮細胞后的病毒增殖滴度結(jié)果見圖2。由圖2可知,PRV在BHK-21細胞中增殖速度較快,即使MOI為0.000 1時,24 h病毒滴度仍能達6.0 lgTCID50/mL以上,MOI為0.01和0.001時最高病毒滴度在42 h和46 h無明顯差異,均達8.5 lgTCID50/mL,優(yōu)于其他病毒接毒指數(shù)。因此,以MOI為0.01接毒42 h后收獲最佳。

    2.3 PRV接毒后細胞存活率變化

    BHK-21懸浮細胞以MOI為0.01接毒PRV,在整個細胞生長增殖過程中,每24 h進行取樣。由圖3可知,PRV病毒增殖過程中細胞存活率(viability)結(jié)果表明,PRV感染36 h前對照細胞和接毒細胞存活率差異不顯著,均維持在95% 以上,這可能是由于在初始階段病毒還未大量增殖裂解。接毒42 h后細胞存活率急劇下降,說明大量病毒已經(jīng)釋放到胞外。

    2.4 PRV增殖過程中代謝分析

    攝氧速率(oxygen uptake rate,OUR)及比耗氧速率(specific oxygen uptake rate,SOUR)可以反映細胞的耗氧能力及生理狀態(tài),由圖4、圖5可知,OUR和SOUR在接毒后12 h前保持較高的水平,說明細胞依然處于高速生長代謝狀態(tài),而接毒后24~36 h 2組細胞耗氧能力略有下降,36 h OUR和SOUR明顯下降,說明細胞開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

    病毒增殖后通過對胞外游離氨基酸的測定,由圖6可知,發(fā)現(xiàn)天冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸濃度隨時間逐漸降低,而甘氨酸和脯氨酸則上升,說明在病毒增殖過程中對不同氨基酸有不同需求,可根據(jù)代謝分析對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。由接毒細胞和對照細胞各代謝參數(shù)結(jié)果(表1)可知,接毒后BHK-21細胞μ、qgluc及qGln明顯低于對照組細胞,而qLac結(jié)果與對照組相當(dāng),表現(xiàn)為YLac/Glu系數(shù)升高,這可能是接毒后,在葡萄糖代謝過程中,僅有部分糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸進入三羧酸循環(huán) 進而導(dǎo)致丙酮酸在細胞質(zhì)中積累,并通過乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為乳酸[18-19]。

    3 結(jié)論與討論

    本研究考察了BHK-21懸浮細胞增殖偽狂犬病毒工藝參數(shù)及病毒增殖過程中代謝速率變化。病毒增殖過程中受到諸多因素影響,如病毒接毒時細胞密度、MOI、收毒時間、培養(yǎng)液組成及pH值等[20],結(jié)果顯示,BHK-21接毒時細胞密度為1×106病毒滴度略高于2×106 cells/mL,隨著MOI增加病毒最佳收毒時間逐漸縮短,從接毒量與產(chǎn)品效價綜合考慮,用MOI為0.01接毒42 h收毒最佳。因此,該病毒最佳接毒時細胞密度為1×106 cells/mL,MOI指數(shù)為0.01,收毒時間為42 h左右。MOI低于相關(guān)文獻[21],可能是由于本研究采用懸浮BHK-21細胞進行接毒培養(yǎng),增殖能力優(yōu)于貼壁細胞。

    細胞的攝氧率(OUR)直接反映了細胞代謝底物碳源(如葡萄糖)能量的生理狀況 而比耗氧速率(SOUR)反映單位細胞消耗氧的快慢速率,它主要與細胞所利用的碳源還原度及細胞內(nèi)代謝途徑有關(guān)[22-24]。在大規(guī)模培養(yǎng)過程中,OUR可作為活細胞密度等參數(shù)的“預(yù)警”指標[25]。本研究中PRV接毒后36 h,OUR不斷下降表明細胞耗氧減少,表明BHK-21細胞開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

    在許多情況下,體外培養(yǎng)細胞的新陳代謝可能會發(fā)生變化,包括營養(yǎng)濃度的變化、培養(yǎng)形式的變化、代謝產(chǎn)物的累積和環(huán)境的改變等[26-27]。葡萄糖和谷氨酰胺是細胞培養(yǎng)基中的主要碳源和能源,葡萄糖可以采用糖酵解途徑為細胞供應(yīng)物質(zhì)和能量,進而產(chǎn)生乳酸,僅僅有少部分進入磷酸戊糖途徑和三羧酸循環(huán)(TCA)[28-29]。本研究PRV接毒后乳酸對葡萄糖的得率系數(shù)升高(表1),說明接毒后很多葡萄糖采用糖酵解方式為細胞提供碳源和能源,從而引起氨基酸代謝通量發(fā)生改變(圖6)。本研究獲得BHK-21懸浮細胞增殖PRV的最佳培養(yǎng)條件,為獲得偽狂犬病毒的規(guī)?;囵B(yǎng)及疫苗開發(fā)提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

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