2型糖尿病患者血清磷脂DHA與炎癥因子相關(guān)性研究

傅晶蕾　褚晨吟　周國忠　樓大鈞

[摘要] 目的 研究2型糖尿病患者血清磷脂DHA與炎癥因子核因子-κB（NF-κB）、干擾素-γ（IFN-γ）是否具有相關(guān)性。 方法 選取2019年10月至2021年1月期間浙江省紹興市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的2型糖尿病患者53例（T2DM組）和2020年11～12月浙江省紹興市人民醫(yī)院體檢中心健康者51例（NC組），用高效氣相色譜法測定血清磷脂DHA，流式細(xì)胞儀檢測NF-κB及IFN-γ水平。比較兩組的血清磷脂DHA、NF-κB及IFN-γ水平，分析血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ的相關(guān)性。結(jié)果 T2DM組NF-κB表達(dá)水平明顯高于NC組[5.79（4.21，9.02）% vs. 1.81（1.26，4.18）%，P<0.01]。T2DM組IFN-γ濃度明顯高于NC組[11.94（9.61，15.67）pg/ml vs. 7.51（6.37，9.48）pg/ml，P<0.01]。T2DM組血清磷脂DHA水平明顯低于NC組[（4.57±1.30）% vs. （6.51±1.28）%]，P<0.01）。Spearman相關(guān)性分析示血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。 結(jié)論 2型糖尿病患者血清磷脂DHA與健康者存在差異，血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ呈負(fù)相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 2型糖尿病;二十二碳六烯酸;核因子-κB;干擾素-γ

[中圖分類號(hào)] R587.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2022）15-0122-04

Correlation between serum phospholipid DHA and inflammatory factors in patients with type 2 diabetes mellitus

FU Jinglei CHU Chenyin ?ZHOU Guozhong LOU Dajun

1.Department of Endocrinology，Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University，Shaoxing 312000，China;2.College of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310011，China;3.Department of Clinical Laboratory， Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000，China

[Abstract] Objective To investigate the correlations between serum phospholipid DHA and inflammatory factors of nuclear factor-κB （NF-κB） and interferon-γ （IFN-γ） in patients with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 53 patients with type 2 diabetes mellitus （the T2DM group） who were admitted to the Department of Secretion and Metabolism of Shaoxing People′s Hospital from October 2019 to January 2021 and 51 healthy subjects （the NC group） who were admitted to the Physical Examination Center of Shaoxing People′s Hospital from November to December 2020 were selected. Serum phospholipid DHA was determined by the high-performance gas chromatography and NF-κB and IFN-γ levels were determined by the flow cytometry.Serum phospholipid DHA， NF-κB and IFN-γ levels were compared between the two groups，and the correlations between serum phospholipid DHA and NF-κB and IFN-γ were analyzed. Results The expression level of NF-κB in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group[5.79（4.21， 9.02） % vs. 1.81 （1.26， 4.18） %， P<0.01]. The IFN-γ concentration in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group [11.94 （9.61， 15.67）pg/ml vs. 7.51 （6.37， 9.48） pg/ml，P<0.01]. The serum phospholipid DHA level in the T2DM group was significantly lower than that in the NC group [（4.57±1.30） % vs. （6.51±1.28） %，P<0.01]. The Spearman correlation analysis showed that serum phospholipid DHA was negatively correlated with NF-κB and IFN-γ（r=-0.294，-0.302，P<0.01）. Conclusion Serum phospholipid DHA of type 2 diabetes mellitus patients is different from that of healthy subjects， and serum phospholipid DHA is negatively correlated with NF-κB and IFN-γ.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus （T2DM）; Docosahexaenoic acid （DHA）; Nuclear factor-κB （NF-κB）; Interferon-γ （IFN-γ）

目前認(rèn)為核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[1]、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）[2]等炎癥因子與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)病機(jī)制之間有著密切的聯(lián)系。在糖尿病疾病進(jìn)程中膳食脂肪酸也起到重要作用，尤其是n-3多不飽和脂肪酸，可以一定程度上改善進(jìn)行性胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、降低炎癥反應(yīng)，對疾病發(fā)展具相對程度的保護(hù)作用。在前期研究中，筆者發(fā)現(xiàn)n-3多不飽和脂肪酸可以起到降低血清高敏C-反應(yīng)蛋白水平的作用，從而減輕T2DM炎癥反應(yīng)[3]。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在n-3多不飽和脂肪酸中有著重要地位。在外周血中，DHA與磷脂結(jié)合形成磷脂脂肪酸，能夠顯示出體內(nèi)n-3多不飽和脂肪酸的攝入情況[4]。因此，本研究通過測定外周血血清磷脂DHA和炎癥因子NF-κB、IFN-γ，分析血清磷脂DHA與炎癥因子NF-κB、IFN-γ表達(dá)間的相關(guān)性，以提供T2DM相關(guān)膳食指導(dǎo)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年1月期間浙江省紹興市人民醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的T2DM患者53例（T2DM組），年齡18～70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①參照1999年WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)，納入研究對象的患者均達(dá)到了糖尿病診斷要求[5];②經(jīng)治療的藥物（如降高血壓藥）穩(wěn)定超過3個(gè)月以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：①目前仍在使用各類降糖藥物進(jìn)行治療，但不包括正在使用外胰島素或胰島素增敏劑等;②既往無阿司匹林，維生素A、E、C的服用史，或使用過各類抗氧化藥物;③無合并急性并發(fā)癥，未罹患惡性腫瘤，處于妊娠期，或患血液系統(tǒng)疾病，肝腎功能不全。選取51例（NC組）于2020年11～12月來自浙江省紹興市人民醫(yī)院體檢中心健康者，年齡20～65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象OGTT試驗(yàn)排除糖尿病[5];②均無明確的心臟、肝臟、肺部及腎臟等疾病，伴有急、慢性進(jìn)行性感染，惡性腫瘤等情況;③均無糖尿病、高血壓家族史。本研究中，向各研究對象說明實(shí)驗(yàn)情況，獲得知情同意且相關(guān)材料提交后經(jīng)由筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：20211203150 0000348155）。

1.2 體格檢查

由專業(yè)人員測量實(shí)驗(yàn)人員的身高、體重、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），并計(jì)算出相應(yīng)的體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）。

1.3 血生化檢測

研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下（過夜禁食10～12 h）抽取適量的靜脈血，從中測量糖化血紅蛋白（HbA1c）含量，獲得FPG、FINS等生化指標(biāo)數(shù)據(jù)。采用G8糖化血紅蛋白測定儀（日本東曹公司）來測定HbA1c、AU5800全自動(dòng)生化分析儀（美國貝克曼公司）測定FPG、I2000發(fā)光儀（美國雅培公司）測定FINS。

1.4 NF-κB的測定

研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血。2 h內(nèi)加入2 ml Ficoll細(xì)胞分離液（美國GE Healthcare公司），設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為2000 r/min，離心時(shí)間10 min后吸取單核細(xì)胞層，加入10 μl CD14抗體（鼠抗人），在2～8℃冰箱內(nèi)孵育約30 min，隨后3000 r/min離心，時(shí)間為5 min，洗滌離心后去上清液，隨后加入細(xì)胞破膜劑，轉(zhuǎn)速和時(shí)間同前，離心洗滌去上清后加入10 μl NF-κB抗體（鼠抗人），在2～8℃冰箱內(nèi)孵育約40～50 min，最后洗滌離心后得到的樣本加入PBS固定液，使用Navios流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）進(jìn)行檢測，儲(chǔ)存并以 Cell Quest 軟件系統(tǒng)分析結(jié)果。所使用到的NF-κB檢測試劑從美國BD公司采購，在執(zhí)行相關(guān)使用操作時(shí)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程和操作說明書。

1.5 IFN-γ的測定

研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血，2 h內(nèi)在3000 r/min的離心速度下離心10 min，分離血清，從血清中抽取適量用作研究，另取適量標(biāo)準(zhǔn)品，分別向其中加入表面包被有IFN-γ的熒光強(qiáng)度的捕獲微球和帶有PE熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合體，形成雙抗夾心復(fù)合物，再由Navios流式細(xì)胞儀分析測定樣本中的細(xì)胞因子成分及其含量。所使用到的IFN-γ檢測試劑從美國BD公司購置，在執(zhí)行相關(guān)使用操作時(shí)，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程和操作說明書。

1.6 血清磷脂DHA測定

研究對象空腹?fàn)顟B(tài)下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血，2 h內(nèi)在3000 r/min的離心速度下離心10 min，分離血清，從血清中提取適量總脂用作研究，經(jīng)萃取后，使用薄層色譜法將磷脂脂肪酸分離出來，而后經(jīng)甲酯化處理的磷脂脂肪酸注入高效氣相色譜儀中進(jìn)行分析，并采集相關(guān)譜圖，通過N2010色譜工作站處理后得到最終的分析結(jié)果。最后，在將標(biāo)準(zhǔn)品與其對照對照定性，獲得峰面積數(shù)據(jù)（面積歸一化法），從而得到其含量的分布。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用χ檢驗(yàn)，計(jì)量資料如果屬于正態(tài)分布，則以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，否則以中位數(shù)（四位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示。在進(jìn)行組間檢驗(yàn)時(shí)，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)法。最后再利用Spearman分析得到DHA與NF-κB、IFN-γ的相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T2DM組和NC組臨床指標(biāo)及生化特征比較

兩組的年齡、性別方面都具有匹配性，兩組FINS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩組的BMI、SBP、DBP、FBG、HbA1c、NF-κB、IFN-γ比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.01），且T2DM組要高于NC組;兩組的血清磷脂DHA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且NC組血清磷脂DHA要高于T2DM組（P<0.001）。見表1。

2.2 血清磷脂DHA與炎癥因子相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。見表2。

3 討論

炎癥因子在IR及胰腺β細(xì)胞損傷中起十分重要作用。NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，常見于單核細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）信號(hào)通路出現(xiàn)被異常激活的情況后，NF-κB轉(zhuǎn)變成激活狀態(tài)，并移位至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、降低利用和攝取葡萄糖的效率，導(dǎo)致機(jī)體IR形成[6-7]。IFN-γ是由活化T細(xì)胞產(chǎn)生，是具有細(xì)胞毒作用的細(xì)胞因子。在T2DM患者中，胰腺β細(xì)胞上Ⅰ類主要組織相容性復(fù)合體（major histo-compatibility complex，MHC）抗原分子表達(dá)異常，增加胰腺β細(xì)胞對細(xì)胞毒性T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的敏感度，易發(fā)生免疫性β細(xì)胞損傷[8]。此外，IFN-γ可以使跨膜蛋白TLR2和TLR4表達(dá)增加，影響炎癥信號(hào)傳導(dǎo)，刺激產(chǎn)生炎癥因子，加劇胰島素抵抗惡化[9]。本研究結(jié)果顯示，炎癥因子NF-κB、IFN-γ在T2DM患者中顯著增高，表明NF-κB、IFN-γ可能在T2DM疾病炎癥反應(yīng)中起著重要作用。

DHA是一種重要的n-3多不飽和脂肪酸。在機(jī)體內(nèi)，胰島素調(diào)節(jié)作用受損主要表現(xiàn)在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成和基因表達(dá)方面，許多研究表明DHA與IR有密切聯(lián)系[10]。Wei等[11]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可以通過作用于 G蛋白偶聯(lián)受體120和過氧化物酶體增殖激活物受體γ進(jìn)行調(diào)節(jié)，激活胰島素信號(hào)傳遞通路，使得葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表達(dá)效率提高，起到改善IR的作用。相關(guān)研究表明，DHA可以通過改變細(xì)胞膜上磷脂成分變化，從而影響脂質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路[12]，尤其抑制NF-κB信號(hào)通路在降低炎癥因子水平和減少胰腺β細(xì)胞凋亡方面起到重要作用[13-14]。DHA還可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子抑制Th1細(xì)胞分化來減少IFN-γ分泌，減輕細(xì)胞毒作用，減少靶細(xì)胞的免疫性損傷[15-16]。當(dāng)膳食攝入多不飽和脂肪酸發(fā)生改變時(shí)體內(nèi)炎癥因子水平也會(huì)相應(yīng)變化。KolobaricN等[17]在一項(xiàng)隨機(jī)研究中發(fā)現(xiàn)，添加n-3多不飽和脂肪酸的飲食可以影響受試者體內(nèi)脂質(zhì)介質(zhì)改變以及T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子水平，最終抑制炎癥反應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源性補(bǔ)充DHA后，可以使細(xì)胞膜磷脂中n-3 PUFAs比例增加，通過抑制細(xì)胞中磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）來降低花生四烯酸衍生物和炎性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生水平[18-19]。DHA作為人體自身不能合成的必需多不飽和脂肪酸，其獲取途徑主要是飲食攝取。目前許多研究支持其具有抗炎特性，并且具有降低糖尿病患病風(fēng)險(xiǎn)的可能性[20]。本研究中發(fā)現(xiàn)，T2DM患者血清磷脂DHA偏低，表明n-3多不飽和酸攝入相對不足、機(jī)體抗炎能力相對減弱，而長期的炎癥刺激可能會(huì)加劇IR惡化。因此在T2DM患者膳食中增加DHA攝入可能可以降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，在一定程度上改善疾病的發(fā)展。

綜上所述，NF-κB、IFN-γ可能是糖尿病發(fā)病過程中重要的炎癥因子。T2DM患者存在膳食n-3不飽和脂肪酸攝入不合理、抗炎能力下降的情況，而外源性攝入DHA有可能降低炎癥反應(yīng)，最終減緩疾病進(jìn)程。但本研究還存在一定的不足，需增加更多研究樣本數(shù)量，今后還需開展臨床或基礎(chǔ)研究進(jìn)一步增加可行性。

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（收稿日期：2021-09-22）