箭葉淫羊藿提取物活性成分、抗氧化及酶抑制活性分析

王秦軍，王翠萍，劉建欣，陳 琛,

（1.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院/陜西省資源生物重點實驗室/陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心/秦巴生物資源與生態(tài)環(huán)境省部共建國家重點實驗室（培育），陜西漢中 723000；2.漢中天然谷生物科技有限公司，陜西漢中 723000）

淫羊藿（Epimedium brevicornuMaxim.）是我國名貴滋補中藥材之一，是保健食品原料之一，民間常用其根葉制作保健酒、保健茶及藥膳等保健品[1]。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味辛、甘、溫，主補腎陽、祛風(fēng)濕。臨床常用其治療陽痿遺精、風(fēng)濕及痙攣等病狀[2-3]。臨床上，淫羊藿在骨質(zhì)疏松癥、乳腺疾病及生殖系統(tǒng)疾病治療方面有良好的療效[4]。黃酮類化合物是淫羊藿主要的藥理成分，主要有淫羊藿苷、淫羊藿素、朝藿定、淫羊藿次苷等[5]?；瘜W(xué)研究表明，淫羊藿中分離出黃酮、多糖、精油、植物甾醇、酚酸和生物堿等260多種成分[6]。淫羊藿的多種成分，易受到產(chǎn)地、加工方式等多重因素影響，影響臨床藥效。藥典記錄的淫羊藿品種有朝鮮淫羊藿、心葉淫羊藿、巫山淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿。箭葉淫羊藿為淫羊藿屬分布最廣的品種，其最早被藥典收錄且被歷版藥典收載[7-9]。

現(xiàn)代生活方式的改變及人口老齡化使肥胖、糖尿病、高血壓及阿爾茨海默癥等發(fā)病率急速增加，中草藥提取物能夠預(yù)防或治療以上疾病。脂肪酶抑制劑可以降低膳食脂肪的水解，降低人體吸收脂肪效率，以此緩解肥胖及高脂血癥等癥狀。膽堿酯酶抑制劑可以抑制膽堿酯酶與乙/丁酰膽堿結(jié)合，從而調(diào)節(jié)老年癡呆患者的中樞神經(jīng)膽堿功能；酪氨酸酶是已知唯一與黑色素合成相關(guān)的酶，與人類的色素障礙性疾病、黑色素瘤、白化病和老年癡呆等疾病的發(fā)生與治療有直接關(guān)聯(lián)[10-12]。淫羊藿的多種藥理活性使其成為熱點研究對象。譚莉等[13]和席曉志等[14]分別優(yōu)化了淫羊藿葉多糖及淫羊藿的提取工藝，并對其抗氧化活性進行了評價；張運輝等[15]研究了淫羊藿治療阿爾茲海默癥的作用靶點及通路，明確了其作用機制；Wang等[16]的研究結(jié)果顯示淫羊藿苷可作為治療黑色素瘤輔助治療劑；同時，Wang等[17]研究了去甲基淫羊藿苷對脂肪生成的影響及其體外潛在機制。前人對于淫羊藿的研究報道較多，但主要集中于對其提取物及黃酮類成分進行定量分析、體外抗氧化能力評價及體內(nèi)作用機理探究，有關(guān)于淫羊藿對脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰膽堿酯酶體外抑制未見相關(guān)報道。高通量體外評價具有簡便、快速、高效的特點，廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的初步篩選，評價效果可作為開發(fā)膳食補充劑和功能性食品的參考[18]。通過研究并建立體外淫羊藿對脂肪酶、酪氨酸酶、膽堿酯酶抑制活性和抗氧化活性，為擴大淫羊藿的應(yīng)用范圍和綜合開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

因此，本實驗測定了淫羊藿提取物中總多酚、總黃酮、總多糖、原花青素及淫羊藿苷、朝藿定A-C及寶藿苷I等含量；并通過對DPPH·、·OH、ABTS+·清除率評價了淫羊藿體外抗氧化活性；利用脂肪酶、酪氨酸酶及兩種膽堿酯酶對淫羊藿體外酶抑制活性進行分析評價，為其綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

箭葉淫羊藿 產(chǎn)地四川廣元，陰干，干品由漢中市天然谷生物科技股份有限公司提供；蘆丁（≥95%）、原花青素（≥97%）、胰脂肪酶（400 U）、奧利司他（≥95%）、石杉堿甲（98%） 索萊寶公司；4-甲基傘形酮油酸酯 Sigma公司；左旋多巴（99%）、ACHE（500 U）、BCHE（500 U） 上海源葉生物有限公司；酪氨酸酶（2.5 kU）、曲酸（99%）、碘化乙酰膽堿（ATCI）、硫代丁酰碘化膽堿（BTCI） 阿拉丁公司；其他試劑均為分析級。

I-Series LC-2030高效液相色譜儀 株式會社島津制作所；酶標儀 美國BioTek公司；ME104E電子天平 上海博特勒-托科多儀器有限公司；723型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淫羊藿提取物制備 稱取淫羊藿粉末，加入70%乙醇（料液比=1:7）回流提取3次，提取液過濾，HPD-100大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，用蒸餾水清洗至無醇味裝柱，將提取液上樣（上樣量:樹脂量=1:2），30 ℃下用70%乙醇以3 BV/h洗脫2 h，收集洗脫液[19]。真空干燥得到干燥的淫羊藿提取物，備用。取1000 mg凍干粉末，用蒸餾水定容至50 mL容量瓶中，超聲30 min，10000 r/min離心5 min，收集上清液。

1.2.2 總多酚含量測定 參考Aktumsek等[20]的方法，反應(yīng)體系稍作修改。取150 μL沒食子酸溶液（0～100 μg/mL），分別加入450 μL蒸餾水和550 μL福林酚試劑，避光3 min，加入2.5 mL Na2CO3溶液，40 ℃水浴15 min，于760 nm處測定吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標曲，其標準方程為Y=0.0039X+0.0586，R2=0.9994。

1.2.3 總黃酮含量測定 參考Xi等[21]的方法，并略作修改。取100 μL蘆丁溶液（0～100 μg/mL），加入50 μL 5% NaNO2反應(yīng)6 min，加入50 μL 10%硝酸鋁反應(yīng)6 min，再加入1 mol/L氫氧化鈉500 μL，避光10 min，于510 nm處測定其吸光度值，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=0.0010X+0.0402，R2=0.9997。

1.2.4 多糖含量測定 參考陳琛等[22]的方法，并略作修改。取1 mL葡萄糖溶液（0～100 μg/mL），加入1 mL 6%苯酚和5 mL濃硫酸，混勻，靜置10 min，30 ℃水浴10 min。于490 nm處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，其線性回歸方程為Y=0.0031X+0.0905，R2=0.9995。

1.2.5 原花青素含量測定 參考石磊等[23]的方法，并稍作修改。取150 μL原花青素溶液（1～5 mg/mL），加入500 μL 5%香草醛溶液及10%鹽酸混合液，30 ℃水浴15 min，于500 nm處測定吸光值，以原花青素濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標曲，其回歸方程為Y=0.0456X+0.0413，R2=0.9991。

1.2.6 黃酮類成分含量測定 采用LC-2030高效液相色譜儀進行含量測定，色譜條件[24]：分析柱為Weich Xtimate? C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A：乙腈，流動相B：水。檢測波長分別為270 nm，進樣10 μL，流速0.7 mL/min，檢測溫度30 ℃。梯度洗脫條件：0～3 min，80% D；3～9 min，80%～70%D；9～25 min，70% D。每個樣品平行三次。

1.2.7 抗氧化活性評價

1.2.7.1 清除DPPH·能力 參考Chen等[25]的方法，反應(yīng)體系稍作修改。取50 μL不同濃度樣液，加入150 μL DPPH（0.14 mg/mL）溶液，避光30 min。在517 nm處測定其吸光度。VC為陽性對照。根據(jù)以下等式計算自由基清除率（%）：

式中：Ai為樣液組OD值；Ai0以等體積水代替DPPH溶液，測定所得吸光度為樣液背景吸光度OD值；Aj用等體積水代替樣品溶液測定吸光度所得OD值。

1.2.7.2 清除·OH能力 參照Zhao等[26]的方法，反應(yīng)體系略作修改。取50 μL不同濃度樣液，加入50 μL FeSO4（9 mmol/mL）及50 μL水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/mL），再加入50 μL H2O2溶液（1.5 mg/mL），避光30 min，于510 nm處測定吸光度。以VC為陽性對照，清除率計算公式為：

式中：Ai為樣液組OD值；Ai0用蒸餾水代替H2O2溶液，測定所得吸光度為樣液背景吸光度OD值；Aj為空白組OD值，即用等體積水代替樣品溶液測定的吸光度值。

1.2.7.3 清除ABTS+·能力 參考Rozi等[27]的方法，并稍作修改。取1.5 mL ABTS溶液（6 mmol/mL）與50 μL不同濃度樣液混合，25 ℃下水浴40 min，在734 nm下測定吸光度。以VC為陽性對照。清除率計算公式如下：

式中：Ai為樣液組OD值；Ai0以等體積水代替ABTS溶液，測定所得吸光度為樣液背景吸光度OD值；Aj用等體積水代替樣品溶液測定吸光度作為空白組OD值。

1.2.8 酶抑制活性評價

1.2.8.1 脂肪酶抑制活性 參考本實驗室前期建立的方法[28]，反應(yīng)體系略作修改。50 μL樣液與50 μL脂肪酶液（1 U/mL）于96孔板中混合，然后加入100 μL 4-甲基傘形酮油酸

酯底物（0.75 mg/mL），37 ℃下水浴15 min。激發(fā)波長360 nm，檢測波長465 nm下檢測淫羊藿提取物溶液的熒光值，檢測時間30 min。以Tris-HCl溶液替代樣液檢測熒光值作為空白組；Tris-HCl溶液代替酶液檢測熒光值作為樣液背景組，陽性對照為奧利司他。脂肪酶抑制率（%）計算公式如下：

式中：Ai為樣液組吸光度；Ai0為樣液背景吸光度，用Tris-HCl代替酶液測定吸光度；Aj以Tris-HCl代替樣液作為空白對照吸光度。

1.2.8.2 酪氨酸酶抑制活性 參考袁曉擘等[29]的測定方法反應(yīng)體系稍加修改。取80 μL樣液與80 μL酪氨酸酶溶液（5 U/mL），加入100 μL PBS（pH=6.8）溶液混合，避光5 min，加入80 μL左旋多巴溶液（2.5 mg/mL），室溫靜置20 min。于475 nm波長處測定樣品組吸光度值（Ai），以PBS緩沖液替代酶檢測吸光度值（Ai0）用作樣液背景組；以PBS緩沖液替代樣液檢測吸光度值（A0）用作空白組，曲酸溶液為陽性對照，酪氨酸酶抑制率計算公式如下：

式中：Ai為樣液組吸光度；Ai0用PBS代替酶液測定吸光度，作為樣液背景吸光度；用PBS代替樣品測定吸光度作為空白對照吸光度。

1.2.8.3 膽堿酯酶抑制活性 參考Orhan等[30]的方法，體系稍作修改。將50 μL樣液與125 μL 1.5 mmol/L DTNB溶液混合，加入50 μL酶液（0.25 U/mL）和75 μL PBS緩沖液（pH=8.0），室溫避光10 min。于412 nm處測定樣品組吸光度值（Ai），PBS緩沖液替代酶液檢測吸光度值（Ai0）用作樣液背景組；以PBS緩沖液替代樣液吸光度值（A0）用作空白組，以石杉堿甲溶液為陽性對照，膽堿酯酶抑制率計算同式（2）。

式中：Ai為樣液組吸光度；Ai0用PBS代替酶液測定吸光度，作為樣液背景吸光度；用PBS代替樣品測定吸光度作為空白對照吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復(fù)3次以上，采用SPSS 22.0、Excel 2019、GraphPad Prism 9.00等軟件分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 淫羊藿提取物的化學(xué)成分

4種標準曲線方程及淫羊藿提取物植物化學(xué)成分含量如表1所示，提取物中總多酚的含量最高，為105.60±0.92 mg/g；總黃酮次之，含量為70.09±0.75mg/g；原花青素含量較少，僅有8.79 mg/g；而總多糖含量達到18.45±1.27 mg/g。廖莉玲等[31]的研究報道淫羊藿中的總多酚及總黃酮含量分別為29.75及46.00 mg/g，均低于本實驗中測定的總多酚與總黃酮含量；李倩等[32]測定的淫羊藿總黃酮含量58.2 mg/g，也低于本研究測得的總黃酮含量。付亮等[33]測定的淫羊藿總多糖高于本研究測定的總多糖含量，可能是因為淫羊藿產(chǎn)地、品種及提取方式等因素不同所導(dǎo)致。

表1 淫羊藿提取物植物化學(xué)成分分析Table 1 Analysis of phytochemical constituents in the extracts of Epimedium

2.2 黃酮類化合物含量

由表2可得，測定結(jié)果顯示淫羊藿提取物中淫羊藿苷的含量最高，為266.16±4.22 mg/g；其次為朝藿定C，含量為43.35±0.67 mg/g；朝藿定A與朝藿定B含量相當；寶藿苷I含量最低，達到2.54±0.07 mg/g。淫羊藿5種黃酮類化合物含量HPLC結(jié)果見圖1，可以看出，5種化合物在18 min時已得到完全分離，4號峰（淫羊藿苷）響應(yīng)值及表面積遠高于測定其他黃酮類化合物，表明淫羊藿中淫羊藿苷含量最大，與表2測定結(jié)果一致。黨亞峰等[34]研究發(fā)現(xiàn)，朝藿定C在巫山淫羊藿中含量最高，為2.68 mg/g；淫羊藿苷含量次之，為0.10 mg/g，均低于本實驗中二者的含量；同時，相較于張翔等[35]測定的超高壓提取法淫羊藿苷含量最高，含量為137.25 μg/mg，低于本實驗測定的淫羊藿苷含量，同時其測定的朝藿定C含量為49.33 μg/mg，與本實驗測定的接近；在于雪娥等[36]報告中，10批次淫羊藿總黃酮膠囊中淫羊藿苷的含量在82.48～89.39 mg/g范圍之間，相對于本實驗所測含量較低。

表2 樣品中5種黃酮類成分含量Table 2 Content results of five flavonoids

圖 1 HPLC測定5種黃酮成分Fig.1 Five flavonoids were determined by HPLC

2.3 抗氧化活性

本實驗從清除DPPH、OH、ABTS+自由基的三個方面評價淫羊藿苷的抗氧化活性，結(jié)果如圖2所示。

淫羊藿苷具有自由基清除、抑制過氧化的能力[37-38]。由圖2可知，淫羊藿提取物濃度升高，其對自由基清除能力也升高。由表3可知DPPH·清除能力的IC50=4.43±0.40 mg/mL，同時由圖2a可知，當淫羊藿提取物濃度達到10 mg/mL時，其對DPPH自由基清除率達到82%，略低于VC的清除效率，表明淫羊藿提取物對DPPH·具有一定的清除能力；由圖2b可知，淫羊藿提取物在濃度為2 mg/mL時，其對·OH清除率已超過40%，在4～12 mg/mL時，對·OH清除率趨近于一致，說明淫羊藿提取物在濃度達到4 mg/mL后對·OH清除能力較小，由表3得知，淫羊藿清除·OH的IC50=2.83±0.09 mg/mL，高于VC的IC50值，說明淫羊藿對于OH自由基有一定清除能力；由圖2c可知，樣品濃度對于ABTS+·清除能力影響較大，樣品濃度在1 mg/mL時，其清除率為15%，而樣液濃度達到4 mg/mL時，淫羊藿提取物對ABTS+·的清除率達到97%，接近于VC，其IC50=2.04 mg/mL。綜上，淫羊藿提取物有一定的抗氧化能力。

表3 淫羊藿提取物清除DPPH、OH、ABTS+自由基的IC50值Table 3 IC50 value of Epimedium extract in scavenging DPPH,OH and ABTS+ free radicals

圖 2 淫羊藿對DPPH、OH、ABTS+自由基的清除率Fig.2 Scavenging rates of Epimedium on DPPH, OH and ABTS+ free radicals

2.4 酶抑制活性

淫羊藿提取物對于4種酶的抑制活性水平結(jié)果如圖3所示，4種酶的抑制率都隨著淫羊藿提取物濃度的升高而增大。在脂肪酶評價中，提取物濃度達到10 mg/mL時，其抑制率達到91%，與奧利司他的抑制率接近，且由表4可知，提取物對脂肪酶抑制的IC50=5.97±0.04 mg/mL，表明淫羊藿提取物具有降脂的潛力；酪氨酸酶抑制的IC50=2.27±0.23 mg/mL，且當提取物濃度為1 mg/mL時，其抑制率已經(jīng)達到43%，當提取物濃度為10 mg/mL時，其抑制率為88%，略低于曲酸的酶抑制率；在兩種膽堿酯酶酶抑制評價中，提取物濃度為0.1 mg/mL時，ACHE的抑制率為20%，BCHE的酶抑制率僅有13%，當提取物濃度達到20 mg/mL時，ACHE抑制率為88%，BCHE的抑制率達到95%，與石杉堿甲相當。同時，通過表4可知，BCHE的IC50=7.41±0.26 mg/mL，ACHE的IC50=9.27±0.07 mg/mL，故提取物對于兩種膽堿酯酶均有一定的抑制作用。

表4 淫羊藿提取物抑制脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰膽堿酯的IC50值Table 4 IC50 values of Epimedium extract inhibiting lipase,tyrosinase and acetyl / butyrylcholine ester

圖 3 淫羊藿提取物對脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰/丁酰膽堿酯酶抑制率Fig.3 Inhibitory rate of Epimedium extract on lipase, tyrosinase and acetyl/butyrylcholinesterase

3 結(jié)論

本文研究了淫羊藿提取物化學(xué)成分含量，并對淫羊藿苷、朝藿定A-C及寶霍苷I的含量進行了測定，在此基礎(chǔ)上研究評價了淫羊藿體外清除自由基能力及對脂肪酶、酪氨酸酶及膽堿酯酶4種酶的酶抑制能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淫羊藿提取物中富含多酚及黃酮類化合物且淫羊藿苷含量豐富；提取物對于DPPH·及ABTS+·的清除率與陽性對照VC相當，這說明提取物具有較強的體外自由基清除能力；同時，對胰脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶4種酶抑制結(jié)果中，淫羊藿提取物的酶抑制率接近甚至超過了陽性對照，表明了提取物在體外也具有一定的酶抑制能力。綜上表明，本研究為淫羊藿提取物體外生物活性研究提供了一些參考性數(shù)據(jù)，同時說明淫羊藿提取物可作為一種天然的抗氧化劑，亦可作為抗阿爾茲海默癥、抗皮膚病及抗肥胖癥的潛在資源，為淫羊藿的綜合利用提供了依據(jù)。