長(zhǎng)鏈非編碼RNA淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲的調(diào)控作用

馮維，尚張麗，吳麗瑋

舌鱗癌是一種起源于舌復(fù)層鱗狀上皮的頭頸部惡性腫瘤，具有惡性程度高、易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后效果差等特點(diǎn)；盡管手術(shù)、放療和化療等醫(yī)療手段有了很大的進(jìn)步，但大部分病人5年總生存率并不理想［1-2］。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種不具有編碼蛋白質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［3］。目前，已發(fā)現(xiàn)多種與舌鱗癌惡性演變密切相關(guān)的lncRNA，包括AFAP1-AS1、MALAT-1和TUG-1等［4-5］。有學(xué)者采用affymetrix軟件在舌鱗癌組織中篩選出一些差異性表達(dá)的ln‐cRNA，其中淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2（DLEU2）呈現(xiàn)低表達(dá)［6］。關(guān)于DLEU2在腫瘤如非小細(xì)胞肺癌、胃癌和黑色素瘤［7-9］等方面的功能研究已有報(bào)道，但DLEU2在舌鱗癌中的作用并不清楚。因此，本研究通過(guò)觀察DLEU2在舌鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，及其對(duì)舌鱗癌細(xì)胞增殖和侵襲影響。

1 材料與方法

1.1材料2018年5月至2019年7月收集在邯鄲市第三醫(yī)院行手術(shù)治療的22例舌鱗癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌，病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

人正?？谇火つぜ?xì)胞株HOK和3種舌鱗癌細(xì)胞株CAL-27、SCC-15和SCC-4（美國(guó)ATCC），pcD‐NA3.1-DLEU2過(guò)表達(dá)載體及pcDNA3.1空載體（中美泰和生物科技公司），DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、二甲基亞砜和噻唑藍(lán)（MTT）（北京索萊寶科技公司），胎牛血清（四季青公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司），脂質(zhì)體2000和Trizol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）。Tranwell小室（康寧公司），二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），紫外分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)CAL-27、SCC-15、SCC-4和HOK細(xì)胞。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DLEU2的表達(dá)采用Trizol法提取舌鱗癌組織、癌旁組織和CAL-27、SCC-15、SCC-4、HOK細(xì)胞的總RNA后，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，以其為模板，根據(jù)上海生工合成的PCR引物（DLEU2正向引物：5'-TCTGGAGAACAGCCTCACTTC-3'，反向引物：5'-TGCTGAGCTAAGTAGAGGTCTC-3'；GAPDH正向引物：5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，反向引物：5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGG-3'）上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，2?ΔΔCt法計(jì)算舌鱗癌組織和細(xì)胞中DLEU2的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4實(shí)驗(yàn)分組和轉(zhuǎn)染將對(duì)數(shù)期的CAL-27細(xì)胞，接種至6孔細(xì)胞板上，分為對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染）、空載體組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體AGUAGCUACGCCCCU‐ACGUUU）和DLEU2組（轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-DLEU2過(guò)表達(dá)載體UGCGUAUCACCCCCUGAUACGAUGCU‐AC），待細(xì)胞培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)，參照脂質(zhì)體2000說(shuō)明書步驟，將無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋4μg載體質(zhì)粒與10μL脂質(zhì)體2000混合物根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加入到CAL-27細(xì)胞中，而對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞并采用“1.3”方法檢測(cè)各組細(xì)胞中DLEU2的表達(dá)水平。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將對(duì)照組、空載體組和DLEU2組細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞板上，培養(yǎng)48 h，每孔加5 g/L MTT試劑20μL。孵育4 h，棄上清液，每孔中加150μL二甲基亞砜。震蕩反應(yīng)15 min后，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度。每組設(shè)置3個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲將轉(zhuǎn)染48 h對(duì)照組、空載體組和DLEU2組細(xì)胞，加無(wú)血清的培養(yǎng)基孵育24 h。加入0.25%胰蛋白酶消化，并將各組細(xì)胞濃度調(diào)整為3×104個(gè)/毫升。經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋工基質(zhì)膠（1∶6比例）平鋪Transwell小室，Tran‐swell小室放24孔細(xì)胞板內(nèi)，上室加200μL細(xì)胞懸液，下室加600μL含血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，以棉簽小心擦去上室中殘留的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，再以0.5%結(jié)晶紫染色15 min。在200倍顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s形式表示，采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DLEU2在舌鱗癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)22例舌鱗癌組織中DLEU2的相對(duì)表達(dá)量（0.30±0.02）較正常癌旁組織（1.00±0.00）明顯降低（t=39.00，P<0.001）；同時(shí)檢測(cè)人正?？谇火つOK細(xì)胞和3種舌鱗癌SCC-15、SCC-4、CAL-27細(xì)胞中DLEU2的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.00±0.00）、（0.35±0.04）、（0.48±0.04）和（0.26±0.03），F(xiàn)=961.39，P<0.001。與HOK細(xì)胞相比，SCC-15、SCC-4和CAL-27細(xì)胞中DLEU2的表達(dá)水平均明顯降低（均P<0.001），且DLEU2在CAL-27細(xì)胞中的表達(dá)水平最低。故后續(xù)以CAL-27細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2轉(zhuǎn)染后舌鱗癌CAL-27細(xì)胞中DLEU2的表達(dá)對(duì)照組（1.00±0.00）、空載體組（0.94±0.06）、DLEU2組（4.15±0.38）DLEU2表達(dá)水平比較，F(xiàn)=615.11，P<0.001；與對(duì)照組相比，DLEU2組明顯降低（P<0.05），空載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.3DLEU2對(duì)舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖的影響DLEU2組增殖活力較對(duì)照組明顯降低（P<0.05），但空載體組和對(duì)照組細(xì)胞增殖活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組舌鱗癌細(xì)胞吸光度比較/±s

表1 各組舌鱗癌細(xì)胞吸光度比較/±s

注：DLEU2為淋巴細(xì)胞白血病缺失基因2。①與對(duì)照組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組空載體組DLEU2組F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 9 24 h 0.32±0.03 0.34±0.02 0.31±0.03 2.86 0.077 48 h 0.67±0.04 0.65±0.03 0.41±0.03①166.24<0.001 72 h 0.85±0.06 0.88±0.05 0.57±0.03①112.76<0.001 96 h 1.16±0.08 1.23±0.11 0.76±0.05①82.67<0.001

2.4DLEU2對(duì)舌鱗癌CAL-27細(xì)胞侵襲的影響對(duì)照組（125.85±10.50）、空載體組（136.32±12.63）、DLEU2組（57.28±6.35）穿膜細(xì)胞數(shù)比較，F(xiàn)=160.48，P<0.001；與對(duì)照組相比，空載體組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），DLEU2組明顯減少（P<0.05），表明細(xì)胞侵襲能力明顯減弱。見(jiàn)圖1。

圖1 Transwell小室檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲結(jié)果（結(jié)晶紫染色×200）

3 討論

口腔癌是全球常見(jiàn)的第十一大惡性腫瘤，每年約有14.5萬(wàn)人因其死亡，而36.9萬(wàn)新發(fā)病例中有2/3發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家；盡管口腔癌的發(fā)病率總體上有所下降，但其常見(jiàn)的病理類型舌癌的發(fā)病率卻在增加［10］。舌鱗癌是舌癌最常見(jiàn)的病理類型，約占其80%以上［11］。因此，深入探討舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制尋找有效的治療靶點(diǎn)尤為重要。

在舌鱗癌中存在異常表達(dá)的lncRNAs，且舌鱗癌的惡性演變與lncRNAs有著密切聯(lián)系。例如：Jia等［12］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA FALEC在舌鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)ALEC過(guò)表達(dá)可通過(guò)EZH2沉默細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1（ECM1）抑制舌鱗癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。ln‐cRNA MALAT1在舌鱗癌組織和細(xì)胞中異常高表達(dá)，而敲低其表達(dá)可通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［13］。Ma等［14］報(bào)道，異常高表達(dá)的lncRNA GIHCG可通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)miR-429參與細(xì)胞周期、增殖和遷移等促進(jìn)舌鱗癌的惡性進(jìn)展。這些研究表明，lncRNAs參與了舌鱗癌的發(fā)生與發(fā)展，研究舌鱗癌相關(guān)lncRNA的作用有助于深入了解舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制，為舌鱗癌的治療提供新線索。

lncRNA DLEU2是lncRNAs家族成員，也是miR-15a/16-1簇的宿主基因，定位于13q14染色體上，可介導(dǎo)參與細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)過(guò)程。張歡等［15］報(bào)道，在宮頸癌組織和細(xì)胞中DLEU2低表達(dá)，上調(diào)DLEU2可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲。Xie等［16］在喉癌的研究中發(fā)現(xiàn)DLEU2異常低表達(dá)，而DLEU2過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控miR-16-1減弱癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。DLEU2除了在宮頸癌和喉癌中發(fā)揮著抑癌作用外，還在其他腫瘤中扮演著致癌基因的角色。Xu等［17］在胰腺癌組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)DLEU2異常高表達(dá)，DLEU2過(guò)表達(dá)可通過(guò)調(diào)控miR-455/Smad2促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和侵襲。Xie等［18］研究指出，DLEU2在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)靶向miR-186 5p/PDK3促進(jìn)膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展?？梢?jiàn)，DLEU2有望成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。

郭繼平等［6］在舌鱗癌相關(guān)lncRNA的篩選與分析中報(bào)道DLEU2在舌鱗癌中表達(dá)下調(diào)。本研究通過(guò)檢測(cè)22例舌鱗癌組織和3種舌鱗癌細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證了DLEU2在舌鱗癌中的低表達(dá)結(jié)果。這提示，DLEU2可能在舌鱗癌中發(fā)揮著重要作用。本研究通過(guò)成功上調(diào)舌鱗癌CAL-27細(xì)胞中DLEU2表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，CAL-27細(xì)胞增殖和侵襲能力明顯減弱。結(jié)果表明，DLEU2可抑制舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖和侵襲。提示，DLEU2在舌鱗癌中可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，lncRNA DLEU2在舌鱗癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖和侵襲。該結(jié)果進(jìn)一步揭示了舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制，也為關(guān)于DLEU2在舌鱗癌中的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。后續(xù)將研究?jī)?nèi)容放在DLEU2調(diào)控的靶基因和信號(hào)通路上，進(jìn)一步揭示DLEU2在舌鱗癌中的調(diào)控機(jī)制，以期為舌鱗癌的靶向治療提供新線索。