慢病毒載體介導(dǎo)過(guò)表達(dá)和敲低miR-155的AB 8/13細(xì)胞株的建立

唐志明　林栩　梁釗　王晨　韋美理　王蓉　吳昱升　黃慕源

【摘要】目的利用慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-155的AB 8/13細(xì)胞株（AB 8/13-LV-has-miR-155）和穩(wěn)定敲低miR-155的AB 8/13細(xì)胞株（AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton），為研究miR-155在足細(xì)胞焦亡和腎臟疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)AB 8/13細(xì)胞，使用不同濃度嘌呤霉素刺激AB 8/13細(xì)胞48 h，在光學(xué)顯微鏡下觀察AB 8/13細(xì)胞的死亡情況;使用LV-has-miR-155陰性對(duì)照病毒、LV-has-miR-155-5p inhibiton陰性對(duì)照病毒分別感染AB 8/13細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察AB 8/13細(xì)胞的狀態(tài)和感染效率;在嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株后，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株的miR-155表達(dá)量。結(jié)果在3.5 μg/mL及以上濃度的嘌呤霉素作用于AB 8/13細(xì)胞48 h后，所有細(xì)胞全部死亡。LV-has-miR-155慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞的感染效率達(dá)到80%的最佳條件為在含HiTransG P的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行感染，MOI為10;LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞的感染效率達(dá)到80%的最佳條件為在含HiTransG A的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行感染，MOI為100。qRT-PCR結(jié)果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155細(xì)胞株的miR-155表達(dá)量明顯升高，AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細(xì)胞株的miR-155表達(dá)量降低。結(jié)論成功構(gòu)建AB 8/13-LV-has-miR-155穩(wěn)定細(xì)胞株和AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton穩(wěn)定細(xì)胞株，為進(jìn)一步探究miR-155在人足細(xì)胞焦亡中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】AB 8/13細(xì)胞;慢病毒載體;miR-155

中圖分類(lèi)號(hào)：R692文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.001

Establishment of overexpression and knockdown of miR-155

genes of AB 8/13 cell lines by lentivirus vector

TANG Zhiming LIN Xu LIANG Zhao WANG Chen WEI Meili WANG Rong WU Yusheng HUANG Muyuan

（1.Department of Nephrology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities; 2. Guangxi Key

Laboratory of Basic Guarantee for Medical Research of Immune-related Diseases， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】ObjectiveTo construct the stable overexpression of miR-155 of AB 8/13 cell line （AB 8/13-LV-has-miR-155） and stable knockdown of miR-155 of AB 8/13 cell line （AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton） by lentivirus vector， so as to? lay a foundation for the study of the role of miR-155 in podocyte pyroptosis and kidney diseases. MethodsAB 8/13 cells were cultured in vitro and stimulated with puromycin at different concentrations for 48 hours， and then the death of AB 8/13 cells was observed under optical microscope. After AB 8/13 cells were respectively? infected with LV-has-miR-155 negative control virus and LV-has-miR-155p inhibiton negative control virus， the state and infection efficiency of AB 8/13 cells were observed under fluorescence microscope. After the stable cell lines were screened by puromycin， the expression of miR-155 in the stable cell line was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. ResultsAfter being treated with puromycin at the concentration of 3.5 μg/mL or above for 48 hours， all AB 8/13 cells died. The optimal conditions for AB 8/13 cells infected with LV-has-miR-155 lentivirus to achieve 80% infectious efficiency were as follows： infection was performed in complete medium containing HiTransG P， and MOI was 10. The optimal conditions for AB 8/13 cells infected with LV-has-miR-155p inhibiton lentivirus to achieve 80% infectious efficiency were as follows： infection was performed in complete medium containing HiTransG A， and MOI was 100. QRT-PCR results showed that the expression of miR-155 in AB 8/13-LV-has-miR-155 cell line increased significantly， and the expression of miR-155 in AB 8/13-LV-has-miR-155 inhibiton cell line decreased. ConclusionTo successfully construct AB 8/13-LV-has-miR-155 stable cell lines and AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton stable cell lines can lay a foundation for further exploring the mechanism of miR-155 in human podocyte pyroptosis.9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

【Key words】AB 8/13 cell; lentivirus vector; miR-155

Micro RNA （miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性、長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄后靶基因的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)正常生理、病理生理、疾病發(fā)展等過(guò)程起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。miR-155是一種重要的miRNA，其影響著IgA腎病、急性腎損傷、糖尿病腎病等疾病的發(fā)生發(fā)展[1～3]。足細(xì)胞作為一種重要的臟層上皮細(xì)胞，與基底膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞一起參與了腎小球的過(guò)濾功能。目前的研究表明，足細(xì)胞在微小病變腎病、糖尿病腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化（FGSG）等腎臟疾病中受到損傷，并且足細(xì)胞損傷可以加重腎臟疾病的發(fā)展[4]。本課題組前期研究顯示在TGF-β1誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷模型中miR-155高表達(dá)，降低miR-155表達(dá)量減輕足細(xì)胞損傷[5]。我們近期研究發(fā)現(xiàn)在LPS+ATP誘導(dǎo)的人足細(xì)胞焦亡中miR-155表達(dá)升高。綜上，miR-155可能參與了腎臟疾病中足細(xì)胞焦亡的損傷機(jī)制。但是，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-155在足細(xì)胞焦亡中的具體作用機(jī)制。本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)和敲低miR-155的慢病毒載體感染人足細(xì)胞AB 8/13，建立AB 8/13-LV-has-miR-155細(xì)胞株和AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細(xì)胞株，為下一步研究miR-155在足細(xì)胞焦亡中的作用機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

1材料與方法1.1材料人腎小球足細(xì)胞株（AB 8/13）獲贈(zèng)于英國(guó)Bristol大學(xué)Moin A. Saleem教授。RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó) Gibco），胎牛血清（烏拉圭 Lonsera），ITS（美國(guó) Sigma-Aldrich），胰酶（中國(guó) Solarbio），青鏈霉素混合液（中國(guó) Solarbio），Trizol試劑（美國(guó) Invitrogen），miRNA第一條鏈cDNA合成試劑盒（中國(guó) Sangon Biotech，#B532451），TB Green? Premix Ex Taq^TMⅡ （日本 TaKaRa，RR820A），由武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司合成U6 Forward primer、U6 Reverse primer、miRNA-155 Forward primer，引物序列見(jiàn)表1，miRNA-155 Reverse primer由試劑盒自帶。攜帶過(guò)表達(dá)miR-155基因的慢病毒（LV-has-miR-155）、過(guò)表達(dá)miR-155的陰性對(duì)照慢病毒（LV-has-miR-155 nc）、攜帶敲低miR-155基因的慢病毒（LV-has-miR-155-5p inhibiton）、敲低miR-155的陰性對(duì)照慢病毒（LV-has-miR-155-5p inhibiton nc）、HitransG A、HitransG P均購(gòu)買(mǎi)于上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2AB 8/13細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇后，在33℃、5% CO₂條件下，使用完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清+1%青鏈霉素混合液+ITS 〔Insulin-Transferrin-Selenium〕+RPMI-1640）培養(yǎng)未分化的AB 8/13細(xì)胞，每2～3天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代。

1.3AB 8/13細(xì)胞嘌呤霉素工作濃度的篩選將4×10⁴～5×10⁴個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期AB 8/13細(xì)胞鋪于24孔板，將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達(dá)80%左右;然后于每孔加入不同濃度的嘌呤霉素，濃度從0 μg/mL開(kāi)始，以后每孔依次增加0.5 μg/mL，直到嘌呤霉素濃度達(dá)到10 μg/mL;繼續(xù)培養(yǎng)AB 8/13細(xì)胞48 h，于顯微鏡下觀察;將所有細(xì)胞殺光的最低嘌呤霉素濃度選為AB 8/13細(xì)胞的工作濃度。

1.4慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞的最佳感染條件和MOI的篩選①實(shí)驗(yàn)分組：為了篩選出AB 8/13細(xì)胞的最佳感染條件和MOI值，將實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：含慢病毒的完全培養(yǎng)基組（M組）、含慢病毒和感染增強(qiáng)劑HiTransG A的完全培養(yǎng)基組（A組）、含慢病毒和感染增強(qiáng)劑HiTransG P的完全培養(yǎng)基組（P組）、不含慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（Control組）。②AB 8/13細(xì)胞感染：使用完全培養(yǎng)制備2 mL濃度為5×10⁴個(gè)/mL的AB 8/13細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液以100 μL鋪板于96孔板的12個(gè)孔，在33℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中將細(xì)胞培養(yǎng)到匯合度達(dá)20%～30%。從冰箱中取出慢病毒，并使用不含抗生素的完全培養(yǎng)基將慢病毒滴度稀釋為1×10⁶TU/mL、1×10⁷TU/mL、1×10⁸TU/mL，各50 μL。丟掉各孔培養(yǎng)基，按照表2向各孔加入不同滴度慢病毒、感染增強(qiáng)試劑、完全培養(yǎng)基。在慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞12 h后更換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，期間可以根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基。③感染效果確定：在慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染效率和細(xì)胞狀態(tài)。將感染效率在80%左右、使用慢病毒最少、AB 8/13細(xì)胞狀態(tài)良好的感染條件和MOI選做正式感染的條件。

1.5慢病毒正式感染實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞穩(wěn)定株的篩選①實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為5組，即加入LV-has-miR-155慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（LV-has-miR-155組）、加入LV-has-miR-155 nc慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（LV-has-miR-155 nc組）、加入LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（LV-has-miR-155-5p inhibiton組）、加入LV-has-miR-155-5p inhibiton nc慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（LV-has-miR-155-5p inhibiton nc組）、不含慢病毒和感染增強(qiáng)劑的完全培養(yǎng)基組（Control組）。②正式感染實(shí)驗(yàn)：使用完全培養(yǎng)基制備5×10⁴個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將1 mL細(xì)胞懸液鋪板于12孔板，共10個(gè)孔，每組2孔，在33℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24 h。然后根據(jù)分組、最佳感染條件、MOI向每孔加入總體積為500 μL的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基里包含20 μL 25×HitransG感染試劑和慢病毒液。計(jì)算公式：病毒體積=（MOI×細(xì)胞數(shù)目）/病毒滴度。接著繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，中途可以根據(jù)AB 8/13細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)更換培養(yǎng)基。在慢病毒感染72 h后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的感染效率。③穩(wěn)定株篩選：在慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞72 h后，將培養(yǎng)基更換為含工作濃度嘌呤霉素的培養(yǎng)基，每3天更換一次。在顯微鏡下觀察到Control組細(xì)胞被嘌呤霉素殺光而實(shí)驗(yàn)組無(wú)細(xì)胞出現(xiàn)死亡（熒光效率達(dá)到100%）時(shí)，將含工作濃度嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基的濃度降為1/4，繼續(xù)對(duì)感染的AB 8/13細(xì)胞進(jìn)行增殖和篩選。然后收集細(xì)胞進(jìn)行qPCR鑒定，確實(shí)是否為過(guò)表達(dá)和敲低的AB 8/13細(xì)胞株。9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)AB 8/13細(xì)胞的miR-155表達(dá)量通過(guò)Trizol法提取各組AB 8/13細(xì)胞的RNA，然后使用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定所用RNA是否降解。按說(shuō)明書(shū)取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。通過(guò)LightCycler96測(cè)定miR-155、U6的表達(dá)。采用2^-△△CT法計(jì)算miR-155的相對(duì)表達(dá)量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多個(gè)樣本間使用單因素方差分析，其中兩兩相比采用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果2.1嘌呤霉素處理AB 8/13細(xì)胞后的死亡情況將AB 8/13細(xì)胞鋪板于24孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右，各培養(yǎng)孔更換為含不同嘌呤霉素濃度的培養(yǎng)基;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞?？梢?jiàn)隨著嘌呤霉素濃度增加，AB 8/13細(xì)胞死亡越來(lái)越明顯，在濃度達(dá)到3.5 μg/mL及以上時(shí)可見(jiàn)所有細(xì)胞都被殺死（圖1）。

2.2LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒最佳感染條件及MOI將AB 8/13細(xì)胞鋪板于96孔板，按不同條件加入相應(yīng)的轉(zhuǎn)染試劑和陰性對(duì)照慢病毒，在感染72 h后，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。在過(guò)表達(dá)miR-155陰性對(duì)照慢病毒感染人足細(xì)胞中，當(dāng)M組、A組、P組的MOI為1時(shí)，少許細(xì)胞被感染，帶有熒光;當(dāng)M組、A組、P組的MOI為10時(shí)，各組被感染足細(xì)胞增多，P組被感染足細(xì)胞較其他兩組多，足細(xì)胞效率在80%左右，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，其他兩組感染效率未達(dá)到80%;當(dāng)M組、A組、P組的MOI為100時(shí)，各組被感染足細(xì)胞最多，感染效率接近100%（圖2）。在敲低miR-155陰性對(duì)照慢病毒感染人足細(xì)胞中，當(dāng)M組、A組、P組的MOI為1時(shí)，極少數(shù)足細(xì)胞被感染;當(dāng)M組、A組、P組的MOI為10時(shí)，被感染足細(xì)胞稍微增多，感染效率遠(yuǎn)不及80%;當(dāng)M組、A組、P組的MOI為100時(shí)，被感染足細(xì)胞明顯增多，感染效率在80%以上，在P組足細(xì)胞狀態(tài)變差，有少許細(xì)胞死亡（圖3）。最佳感染條件和MOI的選擇原則：①在細(xì)胞狀態(tài)不受影響的條件下盡量使用最少量的慢病毒;②細(xì)胞感染效率在80%左右。根據(jù)上述原則，LV-has-miR-155慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞的最佳感染條件是在含HiTransG P的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行感染，MOI為10;LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染AB 8/13細(xì)胞的最佳條件為在含HiTransG A的完全培養(yǎng)基中進(jìn)行感染，MOI為100。

2.3LV-has-miR-155慢病毒感染的AB 8/13細(xì)胞株miR-155的表達(dá)量在含HiTransG P的完全培養(yǎng)基中加入MOI為10的LV-has-miR-155慢病毒，感染AB 8/13細(xì)胞72 h后，使用工作濃度嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定株。熒光顯微鏡結(jié)果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，感染效率為100%（圖4）。使用穩(wěn)定株提取總RNA進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示與Control組（1.00±0.00）比較，LV-has-miR-155組的miR-155表達(dá)量（56.66±2.50）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），LV-has-miR-155 nc組的miR-155表達(dá)量（1.01±0.03）無(wú)明顯變化（圖5）。

2.4LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒感染的AB 8/13細(xì)胞株miR-155的表達(dá)量在含HiTransG A的完全培養(yǎng)基中加入MOI為100的LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒，在感染細(xì)胞72 h后，使用工作濃度嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定株。熒光顯微鏡結(jié)果顯示AB 8/13-LV-has-miR-155p inhibiton細(xì)胞株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，感染效率為100%（圖6）。使用穩(wěn)定株提取總RNA進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示與Control組（1.00±0.00）比較，LV-has-miR-155-5p inhibiton組的miR-155表達(dá)量（0.57±0.04）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），LV-has-miR-155-5p inhibiton nc組的miR-155表達(dá)量無(wú)明顯變化（1.0±0.11）（圖7）。

3討論

足細(xì)胞是腎臟的一種固有細(xì)胞，其黏附于腎小球基底膜，與基底膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成一道濾過(guò)屏障，參與腎小球過(guò)濾功能。當(dāng)足細(xì)胞受到多種損傷刺激傷害后，如高血糖、阿霉素、血管緊張素Ⅱ等，可經(jīng)歷一系列變化，這些變化有肥大、自噬、去分化、間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、脫落、死亡[6]。以上變化引起了足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損，從而可以引起和加重多種腎臟疾病，如狼瘡性腎炎、微小病變腎病、FGSG、膜性腎病、糖尿病腎病等[4]。

miRNA是一類(lèi)可以調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA，在病理生理過(guò)程和疾病的發(fā)生發(fā)展中都起著重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA-155是一種重要的miRNA，與多種腎臟疾病的致病過(guò)程密切相關(guān)。有研究顯示，miRNA-155可能通過(guò)抑制CXCR5-ERK信號(hào)通路來(lái)抑制系膜細(xì)胞增殖和TGF-β1的產(chǎn)生，從而參與狼瘡性腎炎的致病過(guò)程[7]。ZHOU等[1]研究表明，在糖尿病大鼠的腎臟和高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞中miRNA-155高表達(dá)，并且其可以通過(guò)TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p炎癥環(huán)調(diào)控糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)和纖維化。ZHANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在I/R誘導(dǎo)的AKI大鼠模型中miRNA-155被上調(diào)，miR-155可能通過(guò)調(diào)節(jié)TCF4 /Wnt/β-Catenin途徑改善急性腎損傷。本課題組前期研究表明miR-155參與了TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[5，9]。我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，在LPS+ATP誘導(dǎo)的人足細(xì)胞焦亡中miR-155被上調(diào)。WANG等[10]研究顯示，在高糖處理的足細(xì)胞中miRNA-155高表達(dá)，其可以通過(guò)抑制SIRT1導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，增強(qiáng)足細(xì)胞釋放炎癥因子。多個(gè)研究顯示miRNA-155可以調(diào)控巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞和腎小管細(xì)胞的焦亡過(guò)程[11～13]。綜上，我們推測(cè)miR-155可能通過(guò)調(diào)節(jié)足細(xì)胞焦亡參與腎臟疾病的病理生理過(guò)程。為了進(jìn)一步探究miR-155在足細(xì)胞焦亡中的具體作用機(jī)制，需要過(guò)表達(dá)和敲低足細(xì)胞miR-155的表達(dá)量。9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8

慢病毒是毒性基因被剔除并被外源性基因替代的重組慢病毒載體HIV-1，其具有良好的感染特性，既可以感染分裂細(xì)胞也可以感染非分裂細(xì)胞。慢病毒常被用于基因過(guò)表達(dá)與敲低的一種工具，通過(guò)把自身攜帶的外源基因或干擾基因整合到目的細(xì)胞染色體上，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因持續(xù)穩(wěn)定地過(guò)表達(dá)或敲低[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒的陰性對(duì)照病毒分別感染AB 8/13細(xì)胞，確定了過(guò)表達(dá)和敲低miR-155慢病毒的最適感染條件;通過(guò)不同濃度嘌呤霉素對(duì)AB 8/13細(xì)胞損傷的情況，確定AB 8/13細(xì)胞嘌呤霉素工作濃度。根據(jù)LV-has-miR-155和LV-has-miR-155-5p inhibiton慢病毒最適感染條件對(duì)足細(xì)胞進(jìn)行感染，用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，獲得過(guò)表達(dá)和敲低miR-155的AB 8/13細(xì)胞株。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，與正常AB 8/13細(xì)胞相比，miR-155過(guò)表達(dá)的AB 8/13穩(wěn)定株miR-155表達(dá)量顯著升高，miR-155低表達(dá)的AB 8/13穩(wěn)定株miR-155表達(dá)量顯著降低。因此，我們成功獲得了miR-155過(guò)表達(dá)的AB 8/13穩(wěn)定株和miR-155低表達(dá)的AB 8/13穩(wěn)定株。

我們前期研究顯示miR-155在LPS+ATP誘導(dǎo)的足細(xì)胞焦亡中高表達(dá)，表明miR-155參與足細(xì)胞焦亡。在接下來(lái)的研究中，我們將尋找miR-155的下游靶標(biāo)蛋白，探討miR-155表達(dá)變化對(duì)細(xì)胞焦亡和下游靶標(biāo)蛋白的影響，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-155與下游蛋白的靶向關(guān)系，了解miR-155通過(guò)何種通路調(diào)控足細(xì)胞焦亡，進(jìn)而為慢性腎臟疾病的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。參考文獻(xiàn)[1] ZHOU Y，MA X Y，HAN J Y，et al.Metformin regulates inflammation and fibrosis in diabetic kidney disease through TNC/TLR4/NF-κB/miR-155-5p inflammatory loop[J].World J Diabetes，2021，12（1）：19-46.

[2] WANG M，WEI J L，SHANG F T，et al.Long non-coding RNA CASC2 ameliorates Sepsis-induced acute kidney injury by regulating the miR-155 and NF-κB pathway[J].Int J Mol Med，2020： 2020，45（5）：1554-1562.

[3] KANEKO S，YANAI K，ISHII H，et al.Detection of microRNA expression in the kidneys of immunoglobulin a nephropathic mice[J].J Vis Exp，2020（161）：2020（161）：32716396.

[4] ASANUMA K.The role of podocyte injury in chronic kidney disease[J].Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi，2015，38（1）：26-36.

[5] 凌霄雁，林栩，鄭心彤，等.miR-155表達(dá)變化對(duì)TGF-β1損傷足細(xì)胞蛋白podocin、CD2AP、synaptopodin的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2021，37（9）：1029-1034，1040.

[6] ZHOU L L，LIU Y H.Wnt/β-catenin signalling and podocyte dysfunction in proteinuric kidney disease[J].Nat Rev Nephrol，2015，11（9）：535-545.

[7] KONG J，LI L X，LU Z M，et al.microRNA-155 suppresses mesangial cell proliferation and TGF-β1 production via inhibiting CXCR5-ERK signaling pathway in lupus nephritis[J].Inflammation，2019，42（1）：255-263.

[8] ZHANG X B，CHEN X，LI D J，et al.Inhibition of miR-155 ameliorates acute kidney injury by apoptosis involving the regulation on TCF4/wnt/β-catenin pathway[J].Nephron，2019，143（2）：135-147.

[9] ZHENG X T，ZHONG Q H，LIN X，et al.Transforming growth factor-β1-induced podocyte injury is associated with increased microRNA-155 expression，enhanced inflammatory responses and MAPK pathway activation[J].Exp Ther Med，2021，21（6）：620.

[10] WANG X L，GAO Y B，YI W M，et al.Inhibition of miRNA-155 alleviates high glucose-induced podocyte inflammation by targeting SIRT1 in diabetic mice[J].J Diabetes Res，2021，2021：5597394.

[11] LI C，YIN W T，YU N，et al.miR-155 promotes macrophage pyroptosis induced by Porphyromonas gingivalis through regulating the NLRP3 inflammasome[J].Oral Dis，2019，25（8）：2030-2039.

[12] WANG B，WANG Z M，JI J L，et al.Macrophage-derived exosomal miR-155 regulating cardiomyocyte pyroptosis and hypertrophy in uremic cardiomyopathy[J].JACC Basic Transl Sci，2020，5（2）：148-166.

[13]WU H Y，HUANG T，YING L，et al.miR-155 is involved in renal ischemia-reperfusion injury via direct targeting of FoxO3a and regulating renal tubular cell pyroptosis[J].Cell Physiol Biochem，2016，40（6）：1692-1705.

[14] 解笑宸，于斐，姚粵峰，等.慢病毒介導(dǎo)PTEN基因表達(dá)降低的RSC96施萬(wàn)細(xì)胞系模型建立[J].中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志，2021，14（1）：54-60.

（收稿日期：2021-11-07修回日期：2022-04-18）

（編輯：潘明志）9F60236C-D85B-47C2-8353-F753D7AE81E8