華支睪吸蟲病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

曾雪梅　張夢玲　梁富雄

【關(guān)鍵詞】華支睪吸蟲病;分子生物學(xué)診斷技術(shù);聯(lián)合診斷

中圖分類號：R532.23文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.05.013

華支睪吸蟲病（Clonorchiasis），又稱肝吸蟲病，是一種由華支睪吸蟲寄生于人體膽管內(nèi)引發(fā)膽管病變的人畜共患寄生蟲病，主要是食用了含有華支睪吸蟲活囊蚴的淡水魚蝦所致[1]。輕度感染者常無癥狀或輕度腹痛，個別可因大量成蟲堵塞膽總管而出現(xiàn)梗阻性黃疸、膽絞痛，更有慢性嚴(yán)重感染者會出現(xiàn)膽管炎、膽囊炎，甚至引發(fā)膽管癌[2]。在第三次全國人體重點寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查中，華支睪吸蟲病流行區(qū)主要分布在華南和東北兩大片區(qū)，全國華支睪吸蟲加權(quán)感染率為0.47%，推算感染人數(shù)約為598萬人，其標(biāo)化感染率為0.25%，較第一次寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查（0.33%）和第二次寄生蟲病現(xiàn)狀調(diào)查（0.58%）分別下降了24.24%和 56.89%[3]。由此可見我國在寄生蟲病防控方面取得了較為顯著的成果?，F(xiàn)階段我國針對華支睪吸蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)有詳細(xì)規(guī)定，可根據(jù)流行病史、臨床表現(xiàn)、實驗室檢查等來確診病例[4]。筆者對華支睪吸蟲病的病原學(xué)、影像學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)診斷技術(shù)等的最新進(jìn)展進(jìn)行介紹，并闡述聯(lián)合診斷及其優(yōu)勢，為提高華支睪吸蟲病的診斷準(zhǔn)確度提供參考依據(jù)。

1 病原學(xué)診斷

對人體糞便進(jìn)行病原學(xué)蟲卵檢測是目前診斷華支睪吸蟲病較為常用的方法，其中包括直接涂片法、飽和鹽水漂浮法、水洗沉淀法、改良加藤厚涂片法（Kato-Katz法）和醛醚離心沉淀法[5]等。糞便查蟲卵的檢測方法準(zhǔn)確率和檢出率都較高，但需要從較少的糞便中找出蟲卵，并且還需要對其形態(tài)進(jìn)行準(zhǔn)確辨認(rèn)，對于輕度感染或早期感染者，其糞排蟲卵量少并且排蟲卵時間不規(guī)律等因素，使得病原學(xué)查蟲卵難以提高診斷靈敏度。單次對糞便檢測蟲卵準(zhǔn)確度并不高，甚至需要進(jìn)行多次糞便涂片鏡檢才能確診[6]。并且查蟲卵對檢測人員水平有著嚴(yán)格的要求，需要具有豐富的鏡檢經(jīng)驗，而且耗時耗力，因此病原學(xué)檢測難以對華支睪吸蟲病進(jìn)行較大規(guī)模的現(xiàn)場檢測。

2 影像學(xué)診斷

影像學(xué)技術(shù)可以對華支睪吸蟲病住院患者出現(xiàn)肝膽病變之后進(jìn)行診斷，并且對病變程度與病變部位的判斷提供診斷依據(jù)。僅根據(jù)其臨床表現(xiàn)易誤診為病毒性肝炎、膽囊炎等消化道疾病，因此需要對感染華支睪吸蟲造成的肝膽病變利用影像學(xué)特征進(jìn)行初步診斷，以便后續(xù)治療。常規(guī)B超檢查對華支睪吸蟲病患者肝膽部位的異常改變進(jìn)行一定的反饋，并且其具有簡便、無創(chuàng)、價格低廉等優(yōu)點，是華支睪吸蟲病影像學(xué)診斷的首選方法[7]。急性、慢性華支睪吸蟲病在肝膽部位會出現(xiàn)不同的癥狀，急性期可見膽管周圍炎或肝膿腫，合并膽管炎癥、膽管擴張多見;慢性期以膽道的慢性炎癥、纖維化為主要表現(xiàn)，CT或MRI可見特征性肝內(nèi)膽管彌漫性擴張[8～9]。肝吸蟲病繼發(fā)肝實質(zhì)炎癥少數(shù)病例與膽管細(xì)胞癌影像難鑒別，而MRI增強影像表現(xiàn)具有一定特征性，這對肝吸蟲病的診斷有所助益。并且MRI檢測胰膽管成像征象可準(zhǔn)確反映膽道擴張的特征，彩色多普勒超聲技術(shù)可檢測到華支睪吸蟲病患者的門靜脈和血流變化，超聲多普勒聯(lián)合 MRI 可提高早期肝吸蟲性膽道梗阻的確診率[10～12]。影像學(xué)的檢查還需要結(jié)合華支睪吸蟲感染者的生食淡水魚蝦史，由于病癥會跟隨患者的患病時長發(fā)生變化，影像成像也會隨之改變，因此單一使用影像學(xué)檢查方法進(jìn)行診斷存在一定的局限性。

3 血清免疫學(xué)診斷

病原學(xué)糞檢蟲卵通常要等到感染華支睪吸蟲囊蚴4周后成蟲發(fā)育成熟開始產(chǎn)卵才能檢測，感染未能及時發(fā)現(xiàn)易導(dǎo)致嚴(yán)重后果，而酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）是符合現(xiàn)場檢測和早期診斷華支睪吸蟲感染強有力的檢測方法。目前已有許多改進(jìn)版的ELISA檢測方法，如凝膠擴散-酶聯(lián)免疫吸附劑測定（DIG-ELISA）、斑點ELISA（dot-ELISA）、生物素-親和素酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ABC-ELISA）、單克隆抗體ELISA（McAb-ELISA）半胱氨酸蛋白酶ELISA等。其中尋找華支睪吸蟲高敏感度、高特異性和高穩(wěn)定性的抗原是ELISA診斷有效的關(guān)鍵。近年研究篩選出了一些對華支睪吸蟲具有診斷意義的抗原抗體，CsAg17抗原檢測靈敏度和特異度都較高，可以被應(yīng)用于較大規(guī)模對華支睪吸蟲的篩查和監(jiān)測[13];以TPX、CatB4重組蛋白作為包被抗原建立間接ELISA方法[14];血清華支睪吸蟲抗體聯(lián)合EO%、ALT和GGT檢測可提高無癥狀膽囊結(jié)石患者華支睪吸蟲感染的診斷效率[15];重組抗原rCsSQ1和rCsSQ2定位于華支睪吸蟲的口吸盤和腹吸盤，可以利用免疫熒光技術(shù)定位[16]等。利用血清免疫學(xué)技術(shù)可以憑借其靈敏度高、特異性強、方便快捷的優(yōu)勢對華支睪吸蟲進(jìn)行早期診斷，補充了糞檢蟲卵無法在華支睪吸蟲感染早期檢測的不足，可以廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場的檢測，但是其在高靈敏度、高特異性抗原的選取上仍有很大的發(fā)展空間。

4 分子生物學(xué)診斷

4.1 常規(guī)PCR近年來分子診斷技術(shù)不斷發(fā)展，常規(guī)PCR成了在華支睪吸蟲病診斷中被廣泛應(yīng)用的技術(shù)。單從形態(tài)學(xué)上對華支睪吸蟲囊蚴的鑒別存在局限，運用PCR診斷技術(shù)一般會選取具有較高特異性的華支睪吸蟲核糖體第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）基因進(jìn)行檢測[17]。利用PCR法檢測糞便華支睪吸蟲蟲卵的基因具有較高的特異性，其檢出陽性率高于Kato-Katz法檢測結(jié)果，由于PCR技術(shù)是運用較為精密的儀器對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，因此結(jié)果較為可靠[18～19]。王真瑜等人[20]根據(jù)華支睪吸蟲囊蚴ITS2基因序列合成1對特異性CS1/CS2引物，對模板DNA進(jìn)行PCR擴增，其結(jié)果具有高敏感度和強特異性等優(yōu)點。但是PCR檢測需要使用到PCR儀，攜帶不便，并且操作過程容易產(chǎn)生交叉污染，因此在大規(guī)模的檢測華支睪吸蟲感染現(xiàn)場調(diào)查中很少會用到該方法。

4.2 實時熒光定量PCR實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR or qPCR）定量擴增DNA的能力很大程度上提高了靶序列定量的精度，對檢測病原體進(jìn)行定性，還能夠靈敏準(zhǔn)確地進(jìn)行定量，可以實時監(jiān)測每次循環(huán)后 PCR 產(chǎn)物的變化，并生成熒光擴增曲線[21]。由于熒光檢測的高靈敏度，實時熒光定量PCR能夠較為準(zhǔn)確地測量靶DNA的初始濃度，而且更為簡易方便[22]。根據(jù)華支睪吸蟲18S rRNA基因合成特異性引物和探針，建立了實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，以此對患華支睪吸蟲病的重點人群進(jìn)行檢測[23]。實時熒光定量PCR需要優(yōu)化引物和探針濃度，但其檢測具有可重復(fù)性，在應(yīng)用于華支睪吸蟲病診斷方面仍有很大的發(fā)展空間。

4.3 巢式PCR巢式PCR （nested PCR）也稱套氏PCR，是利用兩套PCR引物（巢式引物）進(jìn)行兩輪PCR擴展反應(yīng)，這使其降低了擴增多個靶位點的可能性，從而增加了檢測靈敏度，又因為有兩對PCR引物與檢測模板配對，從而又增加了檢測的可靠性。釘螺是華支睪吸蟲的第一中間宿主，在25 μL的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中，即使在高濃度釘螺DNA的作用下，利用巢式PCR檢測方法也能檢測到高達(dá)0.16 fg的華支睪吸蟲基因組DNA[24]。巢式PCR的檢測方法減少了PCR后擴增產(chǎn)物的污染問題，但卻增加了每次實驗的復(fù)雜性。

4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種在人類寄生蟲病檢測中被廣泛應(yīng)用的檢測技術(shù)。施維等人[25]以華支睪吸蟲核糖體rRNA ITS-2的基因為靶序列設(shè)計LAMP引物，測出最優(yōu)反映體系，其中60 ℃、 60 min為最優(yōu)反應(yīng)溫度和時間，以成蟲DNA為模板時擴增的最低限度可達(dá)10 fg。RAHMAN等人[26]對LAMP檢測人類糞便樣本的華支睪吸蟲的靈敏度與特異性進(jìn)行了細(xì)致的研究，對比Kato-Katz方法和實時熒光定量PCR的測定結(jié)果，LAMP結(jié)果顯示其靈敏度和特異性分別可達(dá)97.1%（95%CI，90.1～99.2）和100%（95%CI，92.9～100）。朱海等人[27]建立了一種基于 ITS2 基因序列的淡水魚中華支睪吸蟲囊蚴 LAMP 檢測方法，其更適用于低濃度的 DNA 檢測。LAMP還可根據(jù)擴增特異性DNA序列進(jìn)行吸蟲的鑒別診斷[28]。由于LAMP不需要PCR所必須的熱循環(huán)儀器，這使其適用于華支睪吸蟲的現(xiàn)場檢測，綜合其特異度和靈敏度，LAMP技術(shù)在華支睪吸蟲病檢測診斷方面具有極大的推廣價值。

4.5 重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增技術(shù)重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴增（recombinase aided amplification，RAA）是一種恒溫體外核酸快速擴增技術(shù)。有研究以華支睪吸蟲18S rRNA基因序列作為靶序列，設(shè)計、合成、篩選特異性引物和探針，以快速檢測華支睪吸蟲的檢驗技術(shù)。其可在39 ℃ 20 min內(nèi)實現(xiàn)對華支睪吸蟲 DNA的特異性擴增。以含不同拷貝數(shù)DNA片段的重組質(zhì)粒為模板，該方法最低檢出限為10 拷貝/μL;以不同濃度華支睪吸蟲基因組DNA為模板，該方法最低檢出限為3 pg/μL[29]。RAA可應(yīng)用于華支睪吸蟲陽性糞便及魚肉樣本檢測。在檢測華支睪吸蟲靈敏度方面，RAA檢測法高于PCR法，略低于LAMP法。在特異性評價方面，RAA以似蚓蛔線蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、日本血吸蟲、十二指腸鉤蟲、曼氏血吸蟲基因組DNA 為模板時的擴增結(jié)果均為陰性，提示該方法具有較高特異性[30]。相對于傳統(tǒng)PCR而言其不受儀器的限制，RAA 法還可以應(yīng)用于大量樣品的快速檢測。

4.6 重組酶聚合酶擴增技術(shù)重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種被看作可以替代甚至超越 PCR的核酸擴增技術(shù)。RPA技術(shù)具有：可在37 ℃～42 ℃恒溫條件下進(jìn)行核酸擴增、可5～20 min完成檢測、可同時快速檢測多種樣品、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點[31]。在寄生蟲檢測方面，張春玲等人[32]通過華支睪吸蟲囊蚴的COX-1基因序列設(shè)計了引物，建立了檢測華支睪吸蟲囊蚴的RPA方法，靈敏度可達(dá)到2.75 ng/μL，并且可在35 ℃下5 min內(nèi)觀察到檢測結(jié)果，從其高特異性和高靈敏度方面來看，非常適合現(xiàn)場寄生蟲檢測。但是RPA技術(shù)必須對糞便樣本中的華支睪吸蟲DNA進(jìn)行純化，還需要較長的引物和探針，不宜控制檢測大量樣品反應(yīng)的同時進(jìn)行[33]。而且目前還沒有專業(yè)的軟件可以進(jìn)行RPA引物設(shè)計，主要靠大量合成與篩選[34]。從成本上來看，相對于PCR和LAMP，RPA技術(shù)診斷華支睪吸蟲病仍存在優(yōu)勢。

5 聯(lián)合診斷

單一的檢查方法對肝吸蟲病診斷的準(zhǔn)確度有限，聯(lián)合診斷對提高其靈敏度和特異性發(fā)揮著很大的作用。楊綺紅等人[35]對可疑華支睪吸蟲感染者制定了一套聯(lián)合診斷策略，首先檢測血清肝吸蟲抗體（ELISA試驗），對抗體陽性者進(jìn)一步行病原學(xué)檢測糞便蟲卵，若是蟲卵陰性則建議行胃鏡引導(dǎo)下十二指腸液引流術(shù)，從引流液中查找蟲卵，這進(jìn)一步提高了華支睪吸蟲病的檢出率。ELISA法聯(lián)合糞便檢查，兩種診斷方法相結(jié)合對華支睪吸蟲病診斷的敏感度、特異性與準(zhǔn)確率也明顯優(yōu)于單一的糞便檢查、ELISA檢查，誤診率和漏診率也均低于單一檢測[36～37]。在對華支睪吸蟲病患者進(jìn)行影像學(xué)診斷時，若符合B型超聲波檢查的特征，規(guī)定還需要進(jìn)行華支睪吸蟲病的病原學(xué)檢查項目。特別是對于華支睪吸蟲病合并其他寄生蟲感染的病例[38]，更應(yīng)結(jié)合使用形態(tài)學(xué)、血清學(xué)、影像學(xué)和分子生物學(xué)等方法進(jìn)行鑒別診斷，以便進(jìn)一步治療。

6 結(jié)語

綜上所述，隨著科學(xué)技術(shù)的飛躍發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于華支睪吸蟲病的鑒別診斷方面變得更加廣泛，研究出靈敏度高、特異性強、可重復(fù)性好、操作簡易方便、反應(yīng)快速和經(jīng)濟實用的突破性診斷技術(shù)仍是需要關(guān)注的熱點。本綜述主要對華支睪吸蟲病的分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的梳理，認(rèn)為病原學(xué)糞檢蟲卵和免疫學(xué)診斷應(yīng)用較為廣泛，臨床上應(yīng)用影像學(xué)診斷技術(shù)更多的是為后續(xù)診治提供策略，為了檢測的高靈敏度和高特異性可以進(jìn)行聯(lián)合診斷，但工作會更加繁瑣，以上內(nèi)容將為華支睪吸蟲病診斷和后續(xù)治療提供參考依據(jù)。參考文獻(xiàn)[1] XU M，JIANG Y Y，YIN J H，et al.Risk factors for clonorchis sinensis infection in residents of Binyang，Guangxi：a cross-sectional and logistic analysis study[J].Front Public Health，2021，9：588325.

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（收稿日期：2022-03-17修回日期：2022-03-22）

（編輯：梁明佩）