軍曹魚nanos1的克隆及其在胚胎和性腺發(fā)育過程中的表達分析

李豫 陳剛 馬騫 鄺杰華 陳有銘

（1. 廣東海洋大學水產學院，湛江 524025；2. 廣東藍糧種業(yè)有限公司，湛江 524000）

在魚類的早期胚胎發(fā)育過程中，生殖細胞系與體細胞系發(fā)生分離并形成原始生殖細胞（primordial germ cells，PGCs），隨著胚胎的發(fā)育PGCs遷移至性腺原基，并逐步轉化為生殖干細胞（精原細胞或卵原細胞），隨后經過減數分裂和進一步的發(fā)育，最終形成成熟的精子和卵子［1］。從PGCs起源到配子發(fā)生的整個過程受基因、激素、環(huán)境因子等多種因素的調控，然而其分子調控機制尚不明確。近年來，越來越多生殖細胞相關基因，如vasa、dnd、nanos、dazl等被廣泛地應用于PGCs的起源和遷移研究，這些基因的發(fā)現有助于揭示生殖細胞分化發(fā)育的調控機制［2-5］。

nanos基因最早在果蠅（Drosophila melanogaster）中被確認為一種母源效應基因，編碼一種含有兩個鋅指基序（Cys-Cys-His-Cys，CCHC）的RNA結合蛋白，可介導果蠅腹部的形成，并在多種生物的PGCs發(fā)生、遷移和存活以及生殖細胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。研究表明，nanos基因功能的缺失會導致PGCs過早進行有絲分裂，無法進行正常遷移并最終發(fā)生凋亡，還可能導致胚胎的大量死亡，對生殖干細胞的形成和維持也會產生一定的影響［8-9］。nanos基因存在3種同源基因，分別為nanos1、nanos2和nanos3，其基因功能在不同物種中存在差異［10］。在脊椎動物中，nanos1基因對機體的調控作用存在較大差異。小鼠（Mus musculus）nanos1基因在PGCs中不表達，而生精細胞和卵母細胞中則可以檢測到nanos1基因的表達信號；敲除nanos1基因后，小鼠未出現任何異常，且具有正常的生殖功能［11］。在魚類中，施氏鱘（Acipenser schrenckii）nanos1基因在除心臟外的所有組織中均有表達，其中，卵巢中的表達水平最高［12］。斜帶石斑魚包含兩種類型的nanos1（nanos1a和nanos1b），其表達模式各不相同，其中nanos1a在斜帶石斑魚垂體中的動態(tài)變化與其精巢分化和精子的形成相關［4］。抑制斑馬魚（Danio rerio）胚胎發(fā)育過程中nanos1基因的表達，將對其PGCs的遷移和存活產生影響［13］。此外，在其它魚類中也相繼克隆出nanos1的同源基因，包括河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）［14］、大黃魚（Larimichthys crocea）［15］、中 華 鱘（A. sinensis）［7］、黑脊倒刺鲃（Spinibarbus caldwelli）［16］等。

軍曹魚（Rachycentron canadum），隸屬于鱸形目（Perciformes）、軍曹魚科（Rachycentridae）、軍曹魚屬（Rachycentron），又稱為海鱺和海龍魚，是一種大型的遠洋洄游性魚類［17］。軍曹魚因其生長速度極快、抗病能力強以及經濟價值高，已成為我國極具前景的海水養(yǎng)殖魚類之一，目前在超過23個國家和地區(qū)啟動了軍曹魚的研究和開發(fā)工作，其中一半集中在亞太地區(qū)［18-20］。為了促進軍曹魚的規(guī)模化種苗培育及種質資源改良工作，需對其性腺發(fā)生發(fā)育作進一步研究。

本研究以軍曹魚為實驗對象，克隆分析Rcnanos1基因cDNA全長序列，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測Rcnanos1基因在13種組織中的表達分布以及在胚胎和性腺發(fā)育過程中的表達模式，為闡明nanos1基因在硬骨魚類胚胎發(fā)育和配子發(fā)生過程中的生理功能及其調節(jié)作用提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的軍曹魚胚胎于2019年4月采自廣東海洋大學海洋生物研究基地。從海上網箱中挑選自養(yǎng)的3-4齡以上成魚作為親魚，在室外水泥池（100 m3）中強化培育，注射LRH-A2和HCG催產，雌魚注射劑量為LRH-A28 μg/kg + HCG 1 200 IU/kg，雄魚的注射量為雌魚的1/2，效應時間為10-12 h。準確掌握親魚的產卵時間，將受精卵置于培養(yǎng)皿內，在顯微鏡下進行連續(xù)觀察，現場記錄胚胎不同發(fā)育期的時序及形態(tài)特征，分別采集2細胞期、4細胞期、8細胞期、16細胞期、多細胞期、囊胚期、原腸期、神經胚期、器官形成期、孵化期及孵化后1 d的胚胎樣品，經0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水沖洗后放入裝有RNA Later的EP管內，4℃靜置過夜后轉存至-80℃待用。

不同發(fā)育期的軍曹魚性腺組織于2019年6月-2020年4月采自廣東省茂名市某工廠化養(yǎng)殖基地。軍曹魚幼魚飼養(yǎng)于直徑9 m、水深2.5 m的金屬圓形水池內，流水充氣，養(yǎng)殖鹽度27.0%-30.5%，溫度25.0-30.0℃，分別對90、120、150、185、210和360 dph體質良好的軍曹魚進行采樣，其中，雌魚共23尾，體重215.0-5 050.0 g，體長29.8-68.5 cm；雄魚共18尾，體重230.0-4 225.0 g，體長29.2-64.5 cm。軍曹魚經40 mg/L丁香酚麻醉，解剖取出性腺進行性別鑒定，隨后將性腺組織浸入RNA Later中，4℃靜置過夜，最后轉移至-80℃超低溫冰箱保存，用于qRT-PCR實驗。此外，選取150 dph軍曹魚雌雄各1尾，將其腦、肌肉、鰓、肝、腸、胃、脾、體腎、心、皮膚、眼睛、精巢和卵巢分離，經DEPC水沖洗后放入RNA Later中，-80℃保存待用。

1.2 方法

1.2.1 Rcnanos1基因全長cDNA的克隆 將采集的軍曹魚卵巢放入液氮中進行研磨，采用Trizol法（Invitrogen）提取總RNA。通過SimpliNano超微量核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度和純度，并以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。參照EasyScript One-step cDNA Synthesis試 劑 盒（TransGen）說 明書，將2 μg總RNA反轉錄合成第一鏈cDNA，另取2 μg總RNA，按照SMARTer? RACE 5'/3' Kit試劑盒（Clontech）說明合成5'/3' RACE-Ready cDNA。

從課題組前期獲得的軍曹魚全基因組數據庫（暫未上傳至NCBI數據庫）中提取Rcnanos1基因的CDS序列信息，使用Primer Premier5.0分別在序列兩端設計上下游特異性引物Rcnanos1-F和Rcnanos1-R（表1）。按 照95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s共35個循環(huán)，72℃ 10 min 的PCR反應條件進行擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用Gel Extraction Kit（TransGen）純化回收，純化產物連接到pMD-18T（TaKaRa）載體，進而轉化至DH-5α感受態(tài)細胞，篩選挑取單克隆陽性菌落由生工生物工程公司（廣州）測序。根據測序片段，分別在靠近序列5'和3'末端各設計2條RACE引物Rcnanos1 5'-R1/R2和Rcnanos1 3'-F1/F2（表1），采用巢式PCR的方法獲取Rcnanos1基因5'和3'末端序列。

1.2.2 序列比對及系統(tǒng)進化分析 根據基因測序結果，利用DNAMAN軟件將序列進行拼接，得到Rcnanos1基因全長cDNA序列。將預測的RcNanos1氨基酸序列與GenBank數據庫中其它物種的序列進行BLASTP一致性比對；下載其它硬骨魚類及高等脊椎動物的Nanos1同源氨基酸序列，使用Clustalx1.83進行序列多重比對分析，通過GenDoc 軟件將比對結果輸出；使用MEGA5.0軟件以鄰接法（Neighbour-joining，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，針對進化樹各分支結點均進行1 000次重復計算檢驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR（qRT-PCR） 通過組織學觀察并參照劉筠［21］對魚類性腺的分期方法，依據性腺中生殖細胞的種類、成熟度、數量占比及排列方式進行發(fā)育分期的劃分，提取軍曹魚不同發(fā)育期胚胎和性腺組織以及150 dph軍曹魚個體各組織的總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA?；跍y序獲得的Rcnanos1基因序列，設計一對特異性擴增引物Rcnanos1-F1/R1，以軍曹魚β-actin作為內參基因（表1），qRT-PCR實驗流程按照SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa）說明進行操作，使用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀檢測Rcnanos1基因的組織表達分布及在胚胎和性腺發(fā)育過程中的表達，每個實驗樣品均設置3個重復。根據測得的Ct值，采用2-△△Ct法計算Rcnanos1的相對表達量。數據均以平均值±標準差（means±SD，n=3）表示，利用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0進行單因素方差（One-way ANOVA）分析及Duncan’s多重比較，當P＜0.05，表示有顯著性差異。

表1 本實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結果

2.1 Rcnanos1 cDNA全長及序列分析

實驗克隆所得的Rcnanos1序列全長為1 290 bp，其中5'非編碼區(qū)139 bp，3'非編碼區(qū)470 bp，開放閱讀框（ORF）長度681 bp，共編碼226個氨基酸，已提交NCBI GenBank（登錄號：MW436699）；預測的編碼蛋白的分子質量為24.77 kD，等電點（pI）為8.74。結構域預測結果顯示，在推導的RcNanos1氨基酸序列的C端具有兩個連續(xù)且高度保守的鋅指功能結構域（圖1，2）。氨基酸序列多重比對結果顯示，軍曹魚Nanos1氨基酸序列與鱸形目魚類的一致性最高，如與尖吻鱸和斜帶石斑魚的序列一致性分別高達99.6%和99.1%，與小鼠（Mus musculus）和智人（Homo sapiens）等的序列一致性則較低，僅為30.9%和27.7%（圖2）。

圖1 Rcnanos1 cDNA全長序列和氨基酸序列分析Fig.1 Complete sequence of Rcnanos1 cDNA and analysis of deduced amino acid sequence

圖2 軍曹魚nanos1氨基酸序列多重序列比對分析Fig.2 Multiple alignment of R. canadum nanos1 deduced amino acid sequence

基于軍曹魚與GenBank數據庫中已發(fā)表的其它物種Nanos1氨基酸序列所構建的系統(tǒng)進化樹中（圖3），軍曹魚與其它硬骨魚類聚為一簇，哺乳類、鳥類和兩棲類等高等脊椎動物則聚為另一簇，其中，軍曹魚先與尖吻鱸和斜帶石斑魚聚為一支，在物種進化上距離最近，其次與大黃魚（Larimichthys crocea）、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）、大西洋鮭（Salmo salar）、日本青鳉（Oryzias latipes）、高體鰤（Seriola dumerili）等分支聚為一簇。

圖3 基于nanos1氨基酸序列構建的系統(tǒng)進化樹（NJ樹）Fig.3 Phylogenetic tree of nanos1 amino acid sequences based on Neighbor-Joining（NJ）method

2.2 Rcnanos1的組織表達分布模式

qRT-PCR檢測了Rcnanos1在150 dph軍曹魚各組織中的表達水平，結果顯示，Rcnanos1在13種組織中均有表達，其中在性腺中的表達水平最高，顯著高于其它組織，并且卵巢中的表達水平顯著高于精巢；其次是心臟、腦、眼、皮膚和肌肉；在肝、脾、體腎、鰓、胃和腸中的表達水平最低（圖4）。

圖4 qRT-PCR分析Rcnanos1在軍曹魚不同組織中的表達Fig.4 Expressions of Rcnanos1 in the tissues of R. canadum by qRT-PCR

2.3 Rcnanos1在胚胎發(fā)育過程中的表達模式

通過qRT-PCR檢測發(fā)現，Rcnanos1在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達，其在1細胞期、2細胞期、4細胞期和8細胞期中的表達量均無顯著差異，從16細胞期開始表達量出現顯著升高，隨后由多細胞期發(fā)育至器官形成期的過程中，表達水平趨于穩(wěn)定且無顯著變化；孵化期時，Rcnanos1的表達量進一步顯著升高，直至胚胎孵化后1 d，Rcnanos1的表達量達到峰值，約為1細胞期的2.8倍（圖5）。

圖5 Rcnanos1在胚胎發(fā)育過程中的表達分析Fig.5 Expressions of Rcnanos1 during the embryonic development stages

2.4 Rcnanos1在性腺首周年發(fā)育過程中的表達 模式

90-360 dph軍曹魚的精巢共分為4個發(fā)育時期，包括精母細胞增長期（Ⅱ期）、精母細胞成熟期（Ⅲ期）、精子變態(tài)期（Ⅳ期）和精子成熟期（Ⅴ期）。90 dph時，精巢處于Ⅱ期；120 dph時，精巢處于Ⅱ-Ⅲ 期；150 dph和185 dph的精巢均處于Ⅲ期，而210 dph和360 dph的精巢分別處于Ⅳ期和Ⅴ期。在精巢發(fā)育過程中，Rcnanos1的表達水平呈逐漸升高趨勢，90 dph時的表達量最低，隨后表達水平出現顯著升高，并于360 dph時上升至表達量的峰值，約為90 dph的3.6倍（圖6-A）。90-360 dph軍曹魚的卵巢可分為卵原細胞增殖期（Ⅰ期）、卵母細胞小生長期（Ⅱ期）、初級卵母細胞大生長期（Ⅲ期）。90 dph時，卵巢處于Ⅰ期；120 dph時，卵巢處于Ⅰ-Ⅱ期；150 dph、185 dph和210 dph的卵巢均處在Ⅱ期；360 dph時，卵巢發(fā)育至Ⅲ期。在卵巢發(fā)育過程中，Rcnanos1的表達水平呈不斷上升的變化趨勢，其在90 dph的表達量最低，120-360 dph的表達量均顯著高于90 dph，其中120 dph、150 dph和185 dph三個時間點的表達量無顯著差異；360 dph時，Rcnanos1的表達量顯著升高至最大值，約為90 dph的3.1倍（圖6-B）。

圖6 軍曹魚性腺周年發(fā)育過程中Rcnanos1 mRNA的表達水平Fig.6 Rcnanos1 mRNA expression in annual gonadal development of R. canadum

3 討論

本研究利用RACE技術首次克隆了軍曹魚nanos1基因的全長序列，其全長為1 290 bp，共編碼226個氨基酸，推導的氨基酸序列與尖吻鱸的一致性高達99.6%。RcNanos1包含兩個連續(xù)且高度保守的鋅指功能結構域，與已報道的小斑點角鯊（Scylorhinus canicula）［22］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）［10］、果 蠅［23］、非 洲 爪 蟾（Xenopus laevis）［24］等 物 種 的Nanos1同源蛋白的結構相似。相關研究表明，鋅指結構域是RNA的結合部位，在維持nanos1的功能上發(fā)揮著至關重要的作用［25］。雖然不同物種間nanos1基因序列存在一定差異，但其RNA結合功能域的氨基酸序列在進化過程中高度保守。在系統(tǒng)進化樹中，軍曹魚Nanos1屬于硬骨魚類的進化分支，且與尖吻鱸和斜帶石斑魚的親緣關系最接近，也進一步表明克隆的Rcnanos1基因屬于魚類nanos1同源基因。

基于qRT-PCR檢測的組織表達分布結果顯示，Rcnanos1在150 dph軍曹魚的13種組織中均有表達，其中，性腺中的表達豐度最高，而卵巢中的表達水平又顯著高于精巢，與施氏鱘［12］的組織表達模式相似，暗示Rcnanos1可能與軍曹魚性腺發(fā)育相關，且在卵巢發(fā)育過程中可能發(fā)揮更顯著的調控作用。然而大黃魚nanos1在精巢中的表達水平要顯著高于卵巢［15］；在中華鱘的研究中發(fā)現，nanos1在除脂肪外所有組織中均有表達，但垂體和端腦中的表達量最高，而卵巢中的表達量則較低［7］，上述結果表明nanos1的組織表達模式具有明顯的物種差異性。相關報道證實，nanos1在脊椎動物神經系統(tǒng)中具有一定的作用，Zhu等［14］發(fā)現河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）nanos1基因在腦組織中的表達水平最高且顯著高于其它組織，表明其在神經系統(tǒng)中可發(fā)揮一定的功能。Ye等［26］的研究表明，果蠅nanos1基因可參與外周神經系統(tǒng)的形成。此外，在人類、小鼠、非洲爪蟾等高等脊椎動物的神經系統(tǒng)中均可檢測到nanos1的表達［10］，而本研究發(fā)現Rcnanos1在腦組織中有較高的表達水平，由此推測Rcnanos1也可能在軍曹魚的神經系統(tǒng)中發(fā)揮相關功能，關于其具體調控機理有待進一步的探究。

據報道，nanos基因參與PGCs的遷移和維持，在生殖干細胞的更新及生殖細胞的發(fā)育中起到關鍵作用，nanos基因發(fā)生突變后，可抑制PGCs的形成及分裂，甚至造成胚胎的死亡［1］，因此研究nanos基因在胚胎發(fā)育中的表達具有重要意義。本研究利用qRT-PCR技術檢測了Rcnanos1在軍曹魚胚胎發(fā)育12個不同時期中的表達情況，結果顯示，Rcnanos1在胚胎發(fā)育的各個時期均有表達，表明Rcnanos1可能參與軍曹魚胚胎發(fā)育的分子調控機制，然而在大黃魚整個胚胎發(fā)育過程中均未檢測到nanos1基因的表達［15］。Rcnanos1在胚胎發(fā)育早期的表達水平較低，16細胞期時表達量開始顯著升高，表明Rcnanos1可能在卵裂后的胚體形成過程中發(fā)揮重要作用，但在早期卵裂階段的作用不顯著。當胚胎發(fā)育至多細胞期后，Rcnanos1在囊胚期、原腸胚期、神經胚期和器官形成期中的表達均維持在較高水平。目前，研究學者普遍認為PGCs主要起源于中胚層或內胚層［27］，而原腸胚期是形成外、中、內3種胚層的時期，可為胚體器官的形成奠定基礎［28］。此外，關于PGCs遷移的研究表明，PGCs起源后主要通過臟壁中胚層從腸道側膜遷移至生殖嵴，或沿著體壁中胚層通過體節(jié)進行遷移后到達生殖嵴［29］。上述研究表明Rcnanos1可能與PGCs的形成及遷移相關，并可能參與胚胎的器官形成過程。Rcnanos1在孵化出膜階段的表達量顯著升高，暗示Rcnanos1可能在胚體孵化后的生長發(fā)育中起到重要的作用，但具體的調控機制仍需通過進一步的原位雜交及功能分析闡明。

基于Rcnanos1在軍曹魚精巢和卵巢中的表達較強，本研究進一步分析了Rcnanos1在性腺首周年發(fā)育過程中的表達模式。隨著精巢和卵巢發(fā)育，Rcnanos1的表達水平呈逐漸升高的趨勢，且均在360 dph時達到表達量的峰值，此時精巢和卵巢分別處于精子成熟期（Ⅴ期）和初級卵母細胞大生長期（Ⅲ期），表明Rcnanos1可能參與調控軍曹魚精子和卵子的發(fā)生過程。然而，河川沙塘鱧nanos1的表達水平隨著精巢發(fā)育（Ⅰ-Ⅳ期）呈不斷下降的趨勢，在卵巢發(fā)育過程中則呈先下降（Ⅰ-Ⅲ期）后上升（Ⅳ期）的趨勢，表明不同物種間nanos1基因在性腺發(fā)育過程中的表達模式存在一定差異，由此推測nanos1基因在配子發(fā)生過程中的調控作用同樣存在種間差異。

4 結論

本研究克隆獲得的Rcnanos1基因與其它魚類的保守性較高，在各組織中均有表達，其中，在性腺中的表達量最高。在軍曹魚胚胎發(fā)育和性腺周年發(fā)育過程中，Rcnanos1表達水平總體均呈逐漸升高的趨勢，表明Rcnanos1基因可能在軍曹魚胚胎和性腺發(fā)育過程發(fā)揮一定的調控作用。