基于網(wǎng)絡毒理學的鬼畫符致大鼠肝臟損傷作用機制研究*

韋 潔，曾憲彪，李冬梅，何俊慧，何 飛，鐘 鳴**

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣西南寧 530022)

鬼畫符(Breyniafruticosa)是大戟科植物黑面神的干燥全株，主要分布于廣西、廣東、浙江、福建、貴州等省區(qū)。《中華本草》中記載，鬼畫符葉味微苦，性涼，有毒；鬼畫符根味苦，性寒，有毒，有清熱祛濕、化瘀消腫的功效[1]。傳統(tǒng)主要用于治療腹痛吐瀉、扁桃體炎、疔毒、瘡癤、濕疹、皮炎、跌打腫痛[2]。研究表明，鬼畫符含有鞣質(zhì)、酚酸、三萜類、黃酮類、甾體等化合物[3,4]。現(xiàn)代藥理學研究證實，鬼畫符具有抗炎止癢、抑菌、免疫抑制、抗I型超敏反應及抗病毒等作用[5-7]。鬼畫符是一些中成藥品種的原料藥材，有小毒，若不正確使用會損害人體重要的臟器功能，由于目前仍缺乏鬼畫符藥材相關的毒性研究，其具體毒性機制未明。

網(wǎng)絡毒理學源自網(wǎng)絡藥理學，通過構建“毒性-毒性成分-毒性靶點”互作網(wǎng)絡模型，分析網(wǎng)絡中特定組分與毒理學的相關性，可用于中藥藥材毒性物質(zhì)及機制的初步探討，并通過動物和細胞水平的驗證，闡釋藥材毒性的相關機制[8]。本研究中，為探究鬼畫符致臟器毒性，擬開展長期毒性試驗確認毒性靶器官，并通過網(wǎng)絡毒理學和實驗驗證確認鬼畫符的毒性機制，為鬼畫符臨床應用提供毒性劑量依據(jù)和靶器官毒性機制信息，為藥物開發(fā)及臨床應用提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及飼料

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量180-220 g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(桂)2014-0002。普通飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境室溫保持在20-25℃，濕度55%左右，動物自由進食、進水，按每日12 h晝夜循環(huán)。

1.1.2 藥物與試劑

鬼畫符凍干粉(批號:20190901)，黑褐色粉末，有吸濕性，密封袋裝，每袋450 g，相當生藥量為17.4 g生藥/g凍干粉，由廣西梧州制藥(集團)股份有限公司提供，置5℃冰箱密封保存。蘇木素伊紅染液，購自北京雷根生物科技公司；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)單克隆抗體、白介素1β (IL-1β)單克隆抗體、白介素6 (IL-6)單克隆抗體、缺氧誘導因子1α (HIF-1α)單克隆抗體、免疫組化試劑盒均購自武漢三鷹生物技術有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.1.3 儀器

Leica EG1150石蠟包埋機、RM2255組織石蠟切片機、DM2500光學顯微鏡，均購自德國徠卡儀器有限公司；BS-600全自動血液生化分析儀，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 受試藥物的制備

取鬼畫符凍干粉14.5 g，用1 000 mL純凈水溶解混勻，濃度為0.014 5 g凍干粉/mL(相當于0.25 g生藥/mL)，即為高劑量組藥液；取500 mL高劑量組藥液稀釋1倍，濃度為0.007 25 g凍干粉/mL(相當于0.125 g生藥/mL)，即為低劑量組藥液。

1.2.2 分組及給藥

60只SD大鼠，經(jīng)適應性飼養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機分為3組，即對照組、高劑量組、低劑量組，每組20只，各組大鼠雌雄各半。其中高、低劑量組大鼠灌胃鬼畫符水提物劑量分別為5 g生藥/kg體質(zhì)量、2.5 g生藥/kg體質(zhì)量(按生藥材人臨床日用量為15 g，以60 kg成人計算，鬼畫符臨床每日用量為0.25 g/kg，則大鼠高、低劑量分別相當于生藥材人臨床日用量的20倍和10倍)，對照組大鼠給予等量純凈水，給藥體積為20 mL/kg。給藥期為3個月和6個月，觀察給藥后動物毒性反應及相應毒性靶器官的病理變化。

1.2.3 血清AST和ALT水平檢測

分別于給藥3個月和給藥6個月后，每組取10只大鼠經(jīng)異氟烷麻醉，腹主動脈取血，于4℃ 3 500 r/min離心10 min，取血清，采用全自動血液生化分析儀檢測大鼠血清中AST和ALT水平，評估大鼠肝損傷情況。

1.2.4 肝臟病理學檢測

動物麻醉取血后,摘取肝臟組織，輕輕擦除表面血液，用10%中性福爾馬林溶液固定，然后進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，再進行石蠟切片和HE染色[9]，觀察肝臟病理形態(tài)變化。

1.2.5 網(wǎng)絡毒理學分析

1.2.5.1 鬼畫符化學成分篩選

鬼畫符化學成分庫的建立基于中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺TCMIP (http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)以及中國知網(wǎng) (https://www.cnki.net/)公開發(fā)表的文獻收集鬼畫符的化學成分。

1.2.5.2 藥物預測靶點篩選

通過SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)、中藥系統(tǒng)藥理學平臺TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺TCMIP (http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)等在線數(shù)據(jù)庫預測鬼畫符中化學成分的作用靶標，構建鬼畫符化學成分作用靶標信息。

1.2.5.3 肝毒性作用靶標的分析、篩選和構建

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)、基因組學毒理數(shù)據(jù)庫CTD (http://ctdbase.org/)中輸入關鍵詞“肝毒性(Hepatoxicity)、肝損傷(Liver injury)”，篩選已報道的與肝損傷相關且標記有“marker/mechanism”的基因，去除重復基因和假陽性基因，得到肝毒性靶標數(shù)據(jù)庫。

1.2.5.4 PPI網(wǎng)絡的構建與分析

將鬼畫符成分預測靶點與肝毒性靶點進行交集，取交集部分靶點分別作為藥物致肝損傷的預測靶標，并分別取上述交集靶點，基于STRING平臺構建其蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡，將其導入Cytoscape軟件進行拓撲學分析，具體操作如下：將所獲取的鬼畫符致肝毒性的預測靶標分別導入STRING，選擇“homo sapiens”，打分默認0.4，獲取TSV格式結果，其中保留文件中node1、node2和Combined score信息并導入Cytoscape軟件繪制藥物成分-靶點-疾病網(wǎng)絡相互作用網(wǎng)絡圖。利用Cytoscape中的“Network Analyer”功能對PPI網(wǎng)絡進行拓撲學分析，以網(wǎng)絡節(jié)點中的拓撲結構特征值度值(Degree)為重要參考，提取分析這些候選節(jié)點網(wǎng)絡關系，計算節(jié)點的度值、接近中心性(Closeness Centrality，CC)和中介中心度(Betweenness Centrality，BC) 3個拓撲結構特征值。選取網(wǎng)絡中≥degree值中位數(shù)的1.5倍的靶點作為鬼畫符致肝損傷的關鍵靶標，用于后續(xù)基因本體論(Gene Ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析。

1.2.5.5 GO分析與KEGG通路富集分析

GO通過生物過程(Biology process)、分子功能(Molecular function)、細胞組成(Cellular component) 3個維度對基因進行說明與注釋。KEGG通路分析可以直觀檢測靶標參與的通路，借助于統(tǒng)計分析方法對靶標進行富集分析。利用Cytoscape軟件的ClueGo插件和DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對藥物致肝損傷的關鍵靶標進行GO分析和KEGG通路富集分析，獲得鬼畫符致肝損傷的關鍵靶標蛋白在基因功能和信號通路中的富集結果。

1.2.6 肝臟免疫組化檢測

根據(jù)前期網(wǎng)絡毒理學分析藥物致肝毒性預測結果，針對肝毒性相關預測靶點及主要損傷機制進行驗證，利用免疫組化技術，檢測鬼畫符對肝臟組織中HIF-1α、iNOS、IL-1β、IL-6蛋白表達的影響。取給藥3個月和6個月后的大鼠肝臟組織石蠟塊切片(3.5 μm)，脫蠟后，切片浸入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液進行高壓加熱修復，加入3%過氧化氫封閉10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，以5%山羊血清封閉，再分別滴加不同蛋白的一抗并4℃孵育過夜，TBS洗滌3次后，滴加抗兔/鼠HRP標記聚合物100 μL，室溫孵育30 min，TBS沖洗3次，滴加預制好的顯色DAB工作液50-100 μL，室溫孵育5 min，蒸餾水洗滌。蘇木素復染3 min，然后蒸餾水沖洗。各級酒精(75%-85%-95%-100%)脫水后，置于二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。采用Image J圖片分析軟件對上述蛋白的陽性表達面積比率進行分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 鬼畫符誘導肝臟損傷

HE染色結果顯示(圖1)，與對照組相比，給藥3個月后，鬼畫符高、低劑量組部分大鼠出現(xiàn)肝細胞水腫、變性，匯管區(qū)附近肝細胞變性，局部結締組織增生。給藥6個月后，鬼畫符高、低劑量組部分大鼠出現(xiàn)肝細胞廣泛變性水腫、空泡化變性，肝匯管區(qū)周圍局灶性黑點狀，肝細胞核固縮和纖維組織增生。由此可知，肝組織病變程度與鬼畫符劑量有關，高劑量組病變程度較低劑量組嚴重。

圖1 鬼畫符對大鼠肝組織的病理改變Fig.1 Pathological changes of rat liver tissue caused by Breynia fruticosa

血液生化檢測結果可知，給藥3個月后，與對照組相比，鬼畫符高劑量組大鼠ALT水平顯著降低(P<0.05)，AST水平雖出現(xiàn)一定幅度下調(diào)，但無統(tǒng)計學差異；給藥6個月后，鬼畫符高劑量組大鼠血清ALT、AST水平與對照組相比均下降，而低劑量組大鼠ALT、AST水平呈上升趨勢，但無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 鬼畫符對大鼠血清AST和ALT水平的影響Table 1 Effects of B.fruticosa on serum levels of AST and ALT in rats

2.2 鬼畫符的活性化學成分

由表2可知，從知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫公開發(fā)表的文獻中搜集鬼畫符根、葉等部位的成分，共獲得可用于靶標預測的17個化合物，主要為黃酮類、倍半萜類等成分，各成分分別以GHF-01-GHF-17命名，用于后續(xù)作圖及分析。

表2 鬼畫符的化學成分Table 2 Chemical component of B.fruticosa

續(xù)表Continued table

2.3 鬼畫符化學成分作用靶標信息

17種藥物成分的共有靶標情況如圖2所示。從SwissTargetPrediction、TCMSP、TCMIP等數(shù)據(jù)庫中共收集到鬼畫符成分預測靶點229個，其中槲皮素、山奈酚、(+)-南燭木樹脂酚、木犀草素、香草醛、原兒茶醛等擁有共有靶標數(shù)量超過20個。

綠色菱形表示17種藥物成分，紅色橢圓形表示鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標Green diamond shape indicates 17 components,red ellipse shape indicates key targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa圖2 鬼畫符成分的共有靶標Fig.2 Common targets of components from B.fruticosa

2.4 鬼畫符致肝損傷的預測靶標PPI網(wǎng)絡構建以及關鍵靶點的篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫進行上述預測靶標的PPI網(wǎng)絡構建，如圖3所示。經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索獲得肝毒性靶點713個，對鬼畫符成分預測靶點和肝毒性靶點取交集，獲得74個共有靶標，作為藥物致肝毒性的預測靶標。

圖3 鬼畫符致肝毒性的預測靶標PPI網(wǎng)絡圖Fig.3 PPI network diagram of predicted targets in hepatotoxicity caused by B.fruticosa

構建的鬼畫符致肝毒性的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡中，所有節(jié)點的degree值中位數(shù)為20.5，選取degree值>30.75的靶標節(jié)點作為毒性關鍵靶標，共計17個。其中，degree值排前5位的靶標分別為白介素-6 (IL-6)、腫瘤蛋白p53 (TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1 (MAPK1)、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA)、腫瘤壞死因子(TNF)。各個關鍵靶標的基本信息以及與鬼畫符成分之間的映射關系如表3所示，鬼畫符致肝毒性的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡如圖4所示。

表3 鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標Table 3 Key targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa

2.5 鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標KEGG分析和GO分析

選取上述篩選出的17個關鍵靶標(表3)，利用ClueGo插件將鬼畫符致肝損傷的相關靶點進行生物功能富集及通路分析。選取通路富集分析排名前10的通路(P<0.05)(表4)。結果顯示，鬼畫符致肝毒性關鍵靶標主要富集于糖尿病并發(fā)癥相關的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、HIF-1α信號通路(HIF-1α signaling pathway)等通路上，這些通路與炎癥、氧化應激等病理生理過程密切相關。

表4 鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標KEGG分析Table 4 KEGG analysis for key targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa

綠色菱形表示17種藥物成分，紅色橢圓形表示鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標，藍色橢圓形表示鬼畫符致肝毒性的預測靶標Green diamond shape indicates 17 components,red ellipse shape indicates key targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa,blue ellipse shape indicates predicted targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa圖4 鬼畫符致肝毒性的藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡Fig.4 Medicine-target-disease network of hepatotoxicity caused by B.fruticosa

生物功能富集結果顯示，鬼畫符主要參與的生物學過程包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控(Regulation of transcription)、血管新生(Angiogenesis)、一氧化氮合成(Regulation of nitric oxide biosynthetic)、MAPK信號通路(MAPK cascade)、ERK1/2信號通路(Regulation of ERK1 and ERK2 cascade)等過程；在分子功能上，鬼畫符主要與酶、蛋白、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子結合以及細胞因子活性等相關；在細胞組分方面，其主要作用于細胞核、胞外空間、細胞質(zhì)等(圖5)。

圖5 鬼畫符致肝毒性的關鍵靶標GO分析Fig.5 GO analysis for key targets of hepatotoxicity caused by B.fruticosa

2.6 鬼畫符對肝臟IL-1β、IL-6、iNOS、HIF-1α表達的影響

采用免疫組化技術對肝臟中iNOS、HIF-1α、IL-1β、IL-6蛋白表達進行驗證，結果顯示，與對照組相比，給藥3個月后，高劑量組肝臟中IL-6、iNOS、HIF-1α蛋白陽性表達增加(P<0.01，P<0.05)，低劑量組肝臟中IL-6陽性表達水平顯著升高(P<0.05)；給藥6個月后，高劑量組肝臟中IL-1β、iNOS、IL-6、HIF-1α表達水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，低劑量組能顯著升高肝臟中IL-1β、IL-6、iNOS表達水平(P<0.05)(圖6)。由此表明，長期給藥后鬼畫符高劑量可以顯著誘導大鼠肝臟發(fā)生炎性反應及氧化應激損傷。

3 討論

本研究通過長期毒性試驗初步明確鬼畫符具有肝臟毒性作用，并通過網(wǎng)絡毒理學方式，初步揭示鬼畫符中的香草醛、木犀草素、槲皮素、山奈酚、銀椴苷、(+)-南燭木樹脂酚、(+)-異落葉松脂素、蕘花酚、(+)-丁香樹脂醇、β-谷甾醇等化合物可能是誘導肝毒性發(fā)生的潛在成分。有報道稱，β-谷甾醇、木犀草素等具有細胞毒作用，可以抑制肝癌細胞增殖和誘導肝癌細胞凋亡。研究顯示，β-谷甾醇可誘導人SMMC-7721肝癌細胞和HepG2肝癌細胞發(fā)生細胞凋亡現(xiàn)象，可能與降低線粒體膜電位、加劇線粒體氧化應激狀態(tài)、促進活性氧(ROS)釋放有關[10,11]。此外，也有研究證實，木犀草素(50 μmol/L)可以上調(diào)Bax水平、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、活化caspase-3酶、降低線粒體膜電位、誘導SMMC-7721和Bel-7402肝癌細胞凋亡，或者通過誘導自噬繼而促進HepG2肝癌細胞凋亡[12,13]。

網(wǎng)絡毒理學分析結果表明，鬼畫符可能主要通過17個關鍵靶標參與肝損傷機制，主要包括TNF、IL-1β、IL-6、NOS3、MAPK1等。這些關鍵靶標分子主要富集于AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1α信號通路等，上述信號通路及靶點與炎癥、氧化應激等病理生理過程密切相關。研究顯示，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與其受體RAGE結合，可激活多條信號通路誘導氧化應激反應、炎癥反應和蛋白激酶C活化等[14]。Toll樣受體是一類跨膜蛋白，參與識別病原體入侵，誘導機體免疫應答，在TNF-α、IL-1β等炎性因子的上調(diào)過程中發(fā)揮重要作用[15]。HIF信號通路參與線粒體功能障礙后引發(fā)的細胞氧化應激損傷過程[16]。機體內(nèi)氧化應激損傷和炎癥損傷已成為目前中藥致肝毒性的重要因素。有研究顯示，氧化應激狀態(tài)可以誘導HIF-1α表達，造成肝臟糖酵解水平升高，進而誘導肝臟代謝紊亂和肝功能受損[17]。同時，肝臟氧化應激和炎癥狀態(tài)可以進一步誘導iNOS、IL-1β、IL-6等蛋白表達，加重肝臟炎癥風暴和氧化應激損傷[18]。本研究中，鬼畫符5 g/kg劑量連續(xù)給藥6個月后，可以明顯誘導肝細胞變性和纖維組織增生，同時升高肝臟中iNOS、HIF-1α、IL-6和IL-1β的表達水平，表明經(jīng)鬼畫符干預后大鼠肝臟可能發(fā)生了氧化應激和炎癥損傷，這可能是鬼畫符致肝毒性的關鍵機制。

與對照組相比##P<0.01，#P<0.05##P<0.01,#P<0.05 compared with control group圖6 鬼畫符對大鼠肝臟IL-1β、HIF-1α、IL-6、iNOS蛋白表達的影響Fig.6 Effects of B.fruticosa on IL-1β，HIF-1α，IL-6，iNOS expressions in rat liver

鬼畫符是兩廣常用的清熱解毒藥，是治療跌打風濕類方劑的常用藥材，如中華跌打丸。目前，鬼畫符藥材毒性研究仍然較少，具體靶器官不明確，其藥材毒性也是制約中成藥品種臨床應用的重要因素。通過深入研究鬼畫符藥材毒性機制，可推進相關中成藥品種二次開發(fā)過程中有關配伍、炮制工藝等關鍵技術的開發(fā)，為臨床用藥提供理論基礎。