p38/JNK MAPK信號通路對MEHP致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響

黃金瑞，李 玲，德小明，李麗萍，宋貝貝，郭曉英，馬慧穎

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；2.陜西省富平縣疾病預(yù)防控制中心，富平 711700）

鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是一類環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，常作為增塑劑被廣泛用于食品包裝、玩具、化妝品、醫(yī)療器械、裝修材料等。鄰苯二甲酸二（2-乙基）己酯［（Di（2-ethyl）hexyl phthalate，DEHP］是應(yīng)用最為廣泛的增塑劑之一，占國產(chǎn)PAEs的80%[1]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DEHP是寧夏地區(qū)環(huán)境中主要的PAEs[2]。DEHP主要經(jīng)呼吸道、消化道和皮膚接觸途徑進(jìn)入機(jī)體，在體內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP）對機(jī)體產(chǎn)生各種毒性作用[3]，其對生殖能力的毒性引起了人們廣泛關(guān)注[4]。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[5]，活性氧（ROS）水平升高可以上調(diào)p-p38 MAPK、p-JNK及Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過觀察p38 MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125對MEHP染毒致小鼠睪丸間質(zhì)（TM-3）細(xì)胞凋亡情況，探討p38/JNK MAPK信號通路對MEHP致TM-3細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制，為研究MEHP產(chǎn)生雄性生殖毒性機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：HF90 CO2培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國），高壓蒸汽滅菌器（TOMY公司，日本），SW-CJ-1CU超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，中國），正倒置一體顯微鏡（ECHO公司，美國），Neofuge15R高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司，中國），全波長酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，美國），流式細(xì)胞儀（BD公司，美國），凝膠成像儀（Thermo Fisher Scientific公司，新加坡）。

主要試劑：TM-3細(xì)胞株（ATCC細(xì)胞研究中心，美國），MEHP標(biāo)準(zhǔn)品（純度為97%，Sigma公司，美國），SP600125、SB203580（Med Chem Express公司，美國），DMEM培養(yǎng)基、胰酶、青鏈霉素混合液、胎牛血清（Gibco公司，美國），CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，中國），ROS檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒及凝膠配制試劑盒（南京凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國），Caspase-9、Caspase-3、p38、JNK、p-p38、及p-JNK抗體（Cell Signaling Technology公司，美國）。

1.2 TM-3細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

用含10%胎牛血清和100 IU·L-1青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)TM-3細(xì)胞，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。課題組前期已經(jīng)通過CCK-8法實(shí)驗(yàn)確定MEHP低、中、高劑量[3]。實(shí)驗(yàn)分為對照組和MEHP低、中、高劑量組分別給予終濃度為0、200、400，800μmol·L-1的MEHP，SB203580干預(yù)組給予終濃 度 為10μmol·L-1SB203580+400μmol·L-1MEHP，SP600125干預(yù)組給予終濃度為10μmol·L-1SP600125+400μmol·L-1MEHP，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.3 CCK-8法檢測TM-3細(xì)胞活性

將處于對數(shù)生長期的TM-3懸液在細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，配制成1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板。96孔板設(shè)置空白組、對照組和實(shí)驗(yàn)組，空白組加入100μL/孔的培養(yǎng)液，對照組和實(shí)驗(yàn)組中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0、5、10、20、40μmol·L-1的SB203580，0、2.5、5、10、20μmol·L-1的SP600125及0、400μmol·L-1的MEHP、SB203580（10μmol·L-1）+MEHP（400μmol·L-1）、SP600125（10μmol·L-1）+MEHP（400μmol·L-1）培養(yǎng)24 h，后每孔加入10μL CCK-8試劑，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h左右，用酶標(biāo)儀450 nm波長處測吸光度（A）值，當(dāng)對照組A接近1時(shí)，用其值計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值－空白組A值）/（對照組A值－空白組A值）×100%。

1.4 光學(xué)顯微鏡觀察TM-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)

將對數(shù)生長期的TM-3細(xì)胞以1×105/mL接種至6孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁70%左右，倒掉培養(yǎng)基，每孔各加入完全培養(yǎng)基（對照）、200、400、800μmol·L-1的MEHP溶液2 mL，10μmol·L-1SB203580+400μmol·L-1MEHP及10μmol·L-1SP600125+400μmol·L-1MEHP溶液放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察TM-3細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.5 Annexin V-FITC/PI法檢測及熒光探針DCFH-DA法分別檢測TM-3細(xì)胞凋亡率及ROS水平

將對數(shù)生長期的TM-3細(xì)胞以1×105/mL接種于60 mm培養(yǎng)皿，貼壁后倒掉原液，對應(yīng)培養(yǎng)皿加入0、200、400、800μmol·L-1MEHP、10μmol·L-1SB203580+400μmol·L-1MEHP及10μmol·L-1SP600125+400μmol·L-1MEHP 3 mL放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，用不含EDTA胰酶消化并收集細(xì)胞，分別依照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書和ROS檢測試劑盒說明書檢測TM-3細(xì)胞的凋亡率及細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.6 免疫印跡法檢測TM-3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期的TM-3細(xì)胞以1×105/mL接種于100 mm培養(yǎng)皿，分別給予完全培養(yǎng)基（對照）及200、400、800μmol·L-1MEHP、10μmol·L-1SB203580+400μmol·L-1MEHP及10μmol·L-1SP600125+400μmol·L-1MEHP溶液后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用刮刀在培養(yǎng)皿底刮下細(xì)胞，離心。根據(jù)全蛋白提取盒說明書破碎細(xì)胞，離心收集上清，檢測蛋白濃度，加入1/5體積的5×Buffer及Lysis Buffer，配平蛋白質(zhì)量，100℃板上進(jìn)行蛋白變性，按照凝膠配制試劑盒說明書配制凝膠，電泳、切膠、轉(zhuǎn)膜、漂洗、封膜、孵育一抗、孵育相應(yīng)的二抗；采集圖像并用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抑制p38/JNK MAPK信號通路對TM-3細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法分別檢測不同濃度（0、5、10、20、40μmol·L-1）SB203580及不同濃度（0、2.5、5、10、20μmol·L-1）SP600125對TM-3細(xì)胞增殖的影響。隨著SB203580和SP600125濃度的增加，TM-3細(xì)胞的增殖呈先增后減趨勢，與對照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），確定抑制劑組干預(yù)劑量分別為10μmol·L-1SB203580和10μmol·L-1SP600125。與中劑量組比較，SB203580干預(yù)組及SP600125干預(yù)組細(xì)胞增殖率均增加（P均＜0.05），見表1和表2。

表1 不同濃度SB203580及SP600125對TM-3細(xì)胞增殖的影響（n=3，±s）

SB203580濃度/（μmol·L-1） SP600125濃度/（μmol·L-1） 細(xì)胞增殖率/%0 0 100.00±0.00 2.5 82.84±16.07 10 5 84.77±6.88 20 10 92.17±9.86 40 20 83.06±9.41 P值 P值 ＞0.05 5細(xì)胞增殖率/%100.00±0.00 88.23±3.94 96.93±12.80 92.06±10.7 85.60±5.18＞0.05

表2 不同組TM-3細(xì)胞增殖率變化（n=3，±s）

與對照組比較*P＜0.05；與中劑量組相比#P＜0.05。

分組 分組 細(xì)胞增殖率/%對照組 對照組 100.00±0.00 SB203580干預(yù)組 SP600125干預(yù)組 70.16±2.22*#中劑量組 中劑量組 65.00±2.00*P值 P值 ＜0.05細(xì)胞增殖率/%100.00±0.00 80.57±8.00*#67.96±7.84*＜0.05

2.2 抑制p38/JNK MAPK信號通路對TM-3細(xì)胞形態(tài)的影響

對照組TM-3細(xì)胞大多為梭形或多邊形貼壁生長，低劑量組細(xì)胞間隔增大，少量細(xì)胞變圓；中劑量組細(xì)胞間縫隙進(jìn)一步增大，大量細(xì)胞水腫變圓呈露水狀；高劑量組細(xì)胞大多數(shù)為圓形，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少。

與中劑量組相比，SB203580干預(yù)組少量細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隔減小，皺縮和圓形壞死細(xì)胞明顯減??；SP600125干預(yù)組圓形細(xì)胞較少，細(xì)胞間隔稍有減小，見圖1。

圖1 各組TM-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化的光鏡圖（×100）

2.3 抑制p38/JNK MAPK信號通路對TM-3細(xì)胞凋亡和ROS水平的影響

與對照組相比，MEHP各染毒組TM-3細(xì)胞的凋亡率和ROS水平均升高（P均＜0.05），且隨著MEHP染毒劑量的升高，TM-3細(xì)胞的凋亡率和ROS變化越顯著（P＜0.05）。

與中劑量組相比，SB203580干預(yù)組和SP600125干預(yù)組TM-3細(xì)胞凋亡率和ROS水平均降低（P＜0.05），見表3和圖2、圖3。

圖2 各組TM-3細(xì)胞凋亡的檢測流式圖

圖3 各組TM-3細(xì)胞ROS表達(dá)的熒光檢測圖（×100）

表3 各組TM-3細(xì)胞凋亡率和ROS水平變化（n=3，±s）

表3 各組TM-3細(xì)胞凋亡率和ROS水平變化（n=3，±s）

與對照組比較*P＜0.05；與低劑量組相比#P＜0.05；與中劑量組相比□P＜0.05。

組別 凋亡率/% ROS熒光強(qiáng)度/%對照組 5.10±2.49 0.52±0.09低劑量組 24.13±2.77* 2.17±0.23*中劑量組 36.60±3.21*# 3.55±0.21*#高劑量組 51.57±2.59*#□ 4.51±0.16*#□SB203580干預(yù)組 22.77±4.24*□ 2.90±0.13*□SP600125干預(yù)組 30.37±2.64*□ 3.15±0.05*□F值 77.43 220.99 P值 ＜0.05 ＜0.05

2.4 抑制p38/JNK MAPK信號通路對TM-3細(xì)胞p38、p-p38、JNK、p-JNK、Caspase-9及Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與對照組相比，MEHP各染毒組TM-3細(xì)胞內(nèi)p38和JNK蛋白的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平均升高（P均＜0.05），且隨著MEHP染毒劑量的升高，細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平均呈逐漸上升的趨勢，見圖4。

圖4 MEHP作用TM-3細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)水平圖

與中劑量組相比，SB203580干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)p38蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-p38蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05）；SP600125干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)JNK蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p-JNK蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.05）；SB203580干預(yù)組及SP600125干預(yù)細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9表達(dá)水平均下降（P均＜0.05），見圖5和圖6。

圖5 抑制p38 MAPK信號通路TM-3相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖6 抑制JNK MAPK信號通路TM-3相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

TM-3細(xì)胞的主要作用是合成和分泌雄激素。雄激素的主要功能是調(diào)節(jié)精子生成及生殖行為。研究TM-3細(xì)胞增殖和凋亡分子機(jī)制對于理解精子的生成及雄性不育等意義重大[6]。PAEs產(chǎn)生生殖毒性作用主要機(jī)制之一是氧化應(yīng)激[7]。

細(xì)胞中ROS來源有內(nèi)源性和外源性兩種，其中化學(xué)毒物、炎性細(xì)胞因子及紫外線電離等形成外源性ROS。低水平ROS主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞存活信號，過量ROS會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，致使氧化損傷，如組織損傷及蛋白質(zhì)變性等[8]。多種疾病的發(fā)生發(fā)展和細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激有關(guān)[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)過量ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及MAPK活化[10]。過量ROS可啟動p38和JNK通路，繼而致使細(xì)胞中其他促凋亡蛋白表達(dá)水平增高[11-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示，MEHP染毒可使TM-3細(xì)胞凋亡率升高，且凋亡率隨MEHP染毒劑量的升高而升高；TM-3細(xì)胞ROS水平隨MEHP染毒劑量的升高呈劑量依賴式升高，提示MEHP染毒可引起TM-3細(xì)胞氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

p38及JNK是絲裂原活化蛋白激酶MAPK的主要家族成員，在哺乳類動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)廣泛，可被不同的細(xì)胞外刺激啟動[13]，后將細(xì)胞質(zhì)的信號傳達(dá)至細(xì)胞核使細(xì)胞核發(fā)生變化。p38 MAPK及JNK信號通路在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，p38及JNK的表達(dá)改變，可以有效調(diào)控主要的信號通路，控制細(xì)胞凋亡[14]。

目前，p38及JNK促細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還未完全闡明，p38主要通過激活下游的Caspase來促使細(xì)胞凋亡[15]。JNK通過磷酸化Bcl-2及Bcl-xl，使線粒體釋放細(xì)胞色素C至胞漿，與Caspase-9結(jié)合，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終作用于Caspase-3，激活的Caspase-3與凋亡底物結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。

Eun等[17]研究發(fā)現(xiàn)辣木果實(shí)可使黑色素瘤A2058細(xì)胞ROS水平顯著升高，引起氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)MAPK級聯(lián)被依次激活，主要包括生長因子調(diào)控的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular-sig-nalregulated kinase1/2，ERK1/2）、JNK、p38，最終誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。徐怡等[18]研究發(fā)現(xiàn)胡桃醌能引起口腔鱗癌Tac8113細(xì)胞凋亡率和ROS明顯增加，p38和JNK蛋白表達(dá)變化不明顯，p-p38、p-JNK和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)姜黃素類似物GO-Y078通過激活JNK和p38信號通路誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡，Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、p-p38和p-JNK等凋亡蛋白水平升高。有研究[20]表明，二氧化鈦納米顆粒能上調(diào)小鼠睪丸支持細(xì)胞（TM-4）ROS水平，啟動p38 MAPK信號通路，致使TM-4凋亡率、p-p38等相關(guān)蛋白表達(dá)的升高，加入p38 MAPK的抑制劑SB203580，TM-4細(xì)胞損傷情況均被逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，MEHP染毒后，與對照組相比，TM-3細(xì)胞內(nèi)p38和JNK蛋白的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Caspase-3、Caspase-9、p-p38及p-JNK蛋白濃度均增加，隨著MEHP染毒濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)p-p38、p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白的表達(dá)水平均逐漸上升。用抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)p38 MAPK信號通路后，TM-3細(xì)胞ROS水平及凋亡率均降低，提示MEHP可通過p38 MAPK信號通路誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡。SB203580抑制p38 MAPK活性，阻止下游靶點(diǎn)磷酸化，但不能改變p38 MAPK的表達(dá)水平[21]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)SB203580使TM-3細(xì)胞的p-p38蛋白表達(dá)降低，但p38蛋白表達(dá)水平變化不明顯，驗(yàn)證了p38 MAPK抑制劑SB203580對p-p38具有抑制功效。凌春美[22]研究發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦可使細(xì)胞中p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，誘導(dǎo)TM-4凋亡。當(dāng)JNK的抑制劑SP600125和納米二氧化鈦共同作用于細(xì)胞時(shí)，與納米二氧化鈦組相比，SP600125干預(yù)后的細(xì)胞凋亡率下降，p-JNK、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯下降。JNK特異性抑制劑SP600125可顯著降低JNK活化的c-Jun氨基末端激酶磷酸化，阻止JNK介入的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEHP染毒致TM-3的凋亡率高于對照組，p-JNK、Caspase-9和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平高于對照組，給予SP600125和MEHP共同作用于TM-3細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞凋亡率及p-JNK、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)水低于MEHP染毒組，提示MEHP可通過JNK MAPK信號通路誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡。

綜上，MEHP可能通過上調(diào)TM-3細(xì)胞ROS水平，磷酸化激活p38 MAPK和JNK，激活的p38 MAPK和JNK進(jìn)一步激活下游的Caspase-9和Caspase-3誘導(dǎo)TM-3細(xì)胞凋亡。通過抑制p38/JNK MAPK信號通路能抑制MEHP染毒所致的TM-3細(xì)胞凋亡，緩解MEHP染毒所致的TM-3細(xì)胞損傷，為進(jìn)一步闡明PAEs雄性生殖毒性機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。