固態(tài)生料發(fā)酵棉籽粕菌種篩選及發(fā)酵工藝的研究

宣秋希 喬 琳 侯曉林 李愛科 王永偉 王薇薇 劉寬博 段 濤

(1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206；2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧食品質(zhì)營養(yǎng)研究所，北京100037)

棉籽粕作為一種蛋白質(zhì)含量較高的植物性蛋白質(zhì)飼料，具有在動物飼料中替代豆粕的潛力。然而，棉籽粕中有諸如游離棉酚等內(nèi)源毒素的存在，如果將其用作飼料原料，會對養(yǎng)殖動物產(chǎn)生毒性作用，這限制了棉籽粕的利用[1]。我國2017年頒布的《飼料衛(wèi)生標準》中明確指出，在棉籽加工產(chǎn)品中游離棉酚的含量應(yīng)低于1 200 mg/kg，而在畜禽、反芻以及水產(chǎn)等養(yǎng)殖動物的配合飼料中游離棉酚的含量最低應(yīng)不高于60 mg/kg。目前，微生物發(fā)酵被認為是脫除棉籽粕中游離棉酚并提高其營養(yǎng)價值的最佳方法[2-3]。Sun等[4]利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)發(fā)酵棉籽粕，脫毒率為61.91%，且粗蛋白質(zhì)含量提高了12.23%。Zhang等[3]利用熱帶假絲酵母ZD-3于30 ℃發(fā)酵棉籽粕48 h后，其游離棉酚含量從549.06 mg/kg降至35.86 mg/kg，脫毒率高達93.47%，粗蛋白質(zhì)含量提高了8.49%。羅遠琴等[5]利用枯草芽孢桿菌和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)1∶1復(fù)合發(fā)酵棉籽粕72 h后，發(fā)酵產(chǎn)物的總游離氨基酸、酸溶蛋白及棉籽肽的含量均顯著提高。陳生琴等[6]篩選出一株高效降解游離棉酚的菌株，經(jīng)鑒定為紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)，發(fā)酵后棉酚的降解率為72.54%。而徐晶等[7]研究發(fā)現(xiàn)，生料棉籽粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵脫毒率為50.03%，且混菌發(fā)酵效果優(yōu)于單菌，最佳組合為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)Bl2和產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)Cu1。魏炳棟等[8]和亓秀曄等[9]的研究顯示，乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對棉籽粕中游離棉酚和植酸的降解能力有限，但能很好地改善棉籽粕的風(fēng)味，且能提高棉籽粕中有機酸等營養(yǎng)物質(zhì)的含量。在此基礎(chǔ)上，本研究以生料棉籽粕為發(fā)酵基質(zhì)，選用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和乳酸菌作為發(fā)酵菌株，通過檢測棉籽粕發(fā)酵后的感官狀態(tài)、發(fā)酵菌株活菌數(shù)、pH、游離棉酚的降解程度以及酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量的變化，進一步研究不同菌種及發(fā)酵條件對棉籽粕生料發(fā)酵的影響，以優(yōu)化最適菌種組合、發(fā)酵方式和發(fā)酵工藝參數(shù)，提升發(fā)酵棉籽粕的脫毒效率和營養(yǎng)價值，為固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉籽粕購自山東；枯草芽孢桿菌BS15-3、釀酒酵母SC17-1、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)LP15-1、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)RS047均由本實驗室保藏，并制為固體發(fā)酵菌劑，菌劑的活菌數(shù)分別為5.0×1010、5.0×1010、5.6×1010和1.7×1010CFU/g。

LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化

分別稱取枯草芽孢桿菌BS15-3、釀酒酵母SC17-1、植物乳桿菌LP15-1、屎腸球菌RS047菌粉0.2 g，加入到裝有100 mL已滅菌的2%糖蜜溶液的250 mL三角瓶中，枯草芽孢桿菌BS15-3和釀酒酵母SC17-1分別于37和30 ℃，180 r/min振蕩活化4 h；植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047振蕩混勻后，37 ℃靜置活化4 h。

1.2.2 單菌固態(tài)發(fā)酵

稱取已粉碎并過10目篩的棉籽粕200 g于1 000 mL燒杯中，按照料水比1.0∶0.5(質(zhì)量體積比)加入100 mL活化菌液，充分混勻。

好氧發(fā)酵：4層紗布封口，物料蓬松且每12 h攪拌1次。厭氧發(fā)酵：4層紗布和1層保鮮膜封口，且將物料壓實，靜置培養(yǎng)，發(fā)酵期間不攪拌。

不同組別的發(fā)酵條件如表1，對照組為加入不接種任何菌株的無菌水并在相應(yīng)條件下放置的空白物料，每組3個重復(fù)。

表1 單菌固態(tài)發(fā)酵條件

1.2.3 混菌同步固態(tài)發(fā)酵

物料混合方法、好氧/厭氧發(fā)酵方法及對照組處理方法同單菌固態(tài)發(fā)酵?；炀焦虘B(tài)發(fā)酵不同組別的發(fā)酵條件見表2，不同菌株按等比例接種，每組3個重復(fù)。

1.2.4 混菌分步固態(tài)發(fā)酵

物料混合方法、好氧/厭氧發(fā)酵方法及對照組處理方法同單菌固態(tài)發(fā)酵?；炀植焦虘B(tài)發(fā)酵不同組別的發(fā)酵條件見表3，不同菌株按等比例接種，每組3個重復(fù)。

表3 混菌分步固態(tài)發(fā)酵條件

1.2.5 正交試驗

本試驗利用SPSS 23.0進行4因素3水平的正交設(shè)計(升序排列)，以料水比(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵溫度(C)和接種比例(D，釀酒酵母SC17-1∶植物乳桿菌LP15-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3)作為考察因素，探究其對混菌發(fā)酵棉籽粕效果的影響，測定發(fā)酵棉籽粕游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量及干物質(zhì)回收率的變化，試驗因素和水平見表4，正交試驗設(shè)計見表5。

表4 混菌發(fā)酵正交試驗因素和水平

表5 混菌發(fā)酵正交試驗設(shè)計

1.2.6 測定指標及方法

樣品處理：將發(fā)酵結(jié)束后的樣品在55 ℃下烘干24 h，粉碎后，測定游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸的含量。

感官評價：發(fā)酵結(jié)束后，隨機取各組發(fā)酵樣品參考羅遠琴等[5]的方法對其進行感官評價。

活菌數(shù)測定：分別取每組的發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束時的棉籽粕樣品10 g于250 mL三角瓶中，加入90 mL無菌水和適量玻璃珠，37或30 ℃，180 r/min，振蕩30 min。振蕩結(jié)束后進行10倍梯度稀釋，每種樣品做3個平行?？莶菅挎邨U菌BS15-3活菌數(shù)測定采用稀釋涂布法于LB平板37 ℃培養(yǎng)24 h后計數(shù)；釀酒酵母SC17-1活菌數(shù)測定采用稀釋涂布法于孟加拉紅平板30 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)；乳酸菌(植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047)活菌數(shù)測定采用稀釋傾注法于含0.5% CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)48 h后計產(chǎn)生溶鈣圈的菌落數(shù)。

pH測定：取1 g發(fā)酵結(jié)束的棉籽粕樣品于10 mL離心管中，加入9 mL無菌水，振蕩后靜置，使用pH計測上清液的pH。

干物質(zhì)回收率測定：稱量發(fā)酵前后樣品的重量，利用干重法測定發(fā)酵前后樣品的干物質(zhì)百分含量。

干物質(zhì)回收率(%)=100×[(發(fā)酵后樣品
重量×發(fā)酵后干物質(zhì)百分含量)/(發(fā)酵前樣品
重量×發(fā)酵前干物質(zhì)百分含量)]。

游離棉酚含量根據(jù)GB/T 13086—2020《飼料中游離棉酚的測定方法》測定。粗蛋白質(zhì)含量根據(jù)GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》測定。酸溶蛋白含量根據(jù)NY/T 3801—2020《飼料原料中酸溶蛋白的測定》方法測定：稱取2 g發(fā)酵樣品于50 mL離心管中，加入20%三氯乙酸溶液40 mL，空氣搖床150 r/min振蕩30 min，靜置5 min后，4 000 r/min離心5 min。取10 mL濾液加入消化管中，加入催化片，按照粗蛋白質(zhì)含量測定方法進行測定。L-乳酸含量測定：稱取3 g發(fā)酵樣品于50 mL離心管中，加入27 mL去離子水，置于25 ℃空氣浴搖床振蕩2 h，靜置5 min后，4 000 r/min離心20 min，取上清液使用SBA-40E型生物傳感分析儀測定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標準誤”表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 單菌發(fā)酵棉籽粕的感官評定、pH、活菌數(shù)、游離棉酚及營養(yǎng)成分變化

由表6可知，棉籽粕經(jīng)枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵后黏度增加，結(jié)塊嚴重，且在發(fā)酵過程中出現(xiàn)拉絲情況，顏色也由黃褐色變?yōu)樯詈稚?，有濃郁的枯草腐敗味，pH呈堿性(8.03)；釀酒酵母SC17-1好氧發(fā)酵的棉籽粕在發(fā)酵過程中有醇香味，但發(fā)酵至3 d(72 h)時味道變得不好聞且pH為7.02；釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵的棉籽粕則質(zhì)地松散，氣味醇香且顏色較淺，pH也略有下降(6.00)；植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047發(fā)酵的棉籽粕表面泛白污染霉菌且氣味難聞，pH呈堿性(7.87和8.06)。

表6 單菌發(fā)酵棉籽粕的感官評價及pH

由表7可知，經(jīng)過3 d的發(fā)酵，棉籽粕中枯草芽孢桿菌BS15-3活菌數(shù)從初始活菌數(shù)1.2×107CFU/g升高至2.5×109CFU/g，釀酒酵母SC17-1好氧發(fā)酵活菌數(shù)從8.3×106CFU/g升高至5.9×107CFU/g，釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵活菌數(shù)從8.6×106CFU/g升高至1.7×107CFU/g，植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047的活菌數(shù)分別從1.1×107和8.2×106CFU/g均降低至低于1.0×104CFU/g。

表7 單菌發(fā)酵棉籽粕的活菌數(shù)

由于2株乳酸菌在棉籽粕中沒有生長且棉籽粕發(fā)霉，因此沒有檢測乳酸菌發(fā)酵棉籽粕樣品的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量及干物質(zhì)回收率。由表8可知，與對照組相比，枯草芽孢桿菌BS15-3和釀酒酵母SC17-1發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚含量均顯著降低(P<0.05)，其中釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚降解率為59.98%，與釀酒酵母SC17-1好氧發(fā)酵游離棉酚降解率無顯著差異(P>0.05)；枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚降解率為36.67%，明顯低于釀酒酵母SC17-1。枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量與對照組相比升高了96.23%(P<0.05)，高于釀酒酵母SC17-1發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量，但差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，3個單菌發(fā)酵棉籽粕的粗蛋白質(zhì)含量均顯著升高(P<0.05)，其中釀酒酵母SC17-1好氧發(fā)酵棉籽粕的粗蛋白質(zhì)含量升高了8.58%，釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵升高了9.65%，枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵升高了3.85%。與對照組相比，3個單菌發(fā)酵棉籽粕的L-乳酸含量也均顯著升高(P<0.05)，其中釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵棉籽粕的L-乳酸含量最高達到0.36 g/L，是對照組的36倍；枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵棉籽粕的L-乳酸含量略有升高，為0.05 g/L，是對照組的5倍。與對照組相比，3個單菌發(fā)酵棉籽粕的干物質(zhì)回收率均顯著降低(P<0.05)。

表8 單菌發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))及干物質(zhì)回收率

2.2 混菌同步發(fā)酵棉籽粕的感官評定、pH、活菌數(shù)、游離棉酚及營養(yǎng)成分變化

由表9可知，大多數(shù)接種枯草芽孢桿菌BS15-3的混菌發(fā)酵棉籽粕的黏度均較大，有結(jié)塊，顏色較深且有枯草腐敗味；混菌發(fā)酵樣品中凡是接種釀酒酵母SC17-1的發(fā)酵棉籽粕質(zhì)地都比較松散，其中SC17-1+LP15-1組、SC17-1+LP15-1+RS047組發(fā)酵棉籽粕的感官是最讓人愉悅的，質(zhì)地松散無結(jié)塊，顏色較淺，氣味酸香，但SC17-1+LP15-1組發(fā)酵棉籽粕的pH低于SC17-1+LP15-1+RS047組；LP15-1+RS047組發(fā)酵棉籽粕的感官評價最差，表面泛白且有苦味和長霉的氣味。

表9 混菌同步發(fā)酵棉籽粕的感官評價及pH

由表10可知，經(jīng)過發(fā)酵，枯草芽孢桿菌BS15-3的活菌數(shù)能升高至1.0×109CFU/g以上，只有BS15-3+SC17-1+RS047組枯草芽孢桿菌BS15-3的活菌數(shù)為8.6×108CFU/g，但也高于初始活菌數(shù)9.3×106CFU/g；而釀酒酵母SC17-1活菌數(shù)雖也有升高，但不如枯草芽孢桿菌BS15-3升高的明顯，其中只有BS15-3+SC17-1+LP15-1組的釀酒酵母SC17-1活菌數(shù)升高至3.7×108CFU/g，而BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047組釀酒酵母SC17-1的活菌數(shù)最低，為1.1×106CFU/g，其他組釀酒酵母SC17-1的活菌數(shù)均高于初始活菌數(shù)；發(fā)酵后乳酸菌活菌數(shù)能達到1.0×108～1.0×109CFU/g的發(fā)酵組有BS15-3+RS047組、SC17-1+LP15-1組、BS15-3+SC17-1+LP15-1組、BS15-3+SC17-1+RS047組、BS15-3+LP15-1+RS047組和BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047組，SC17-1+RS047組、SC17-1+LP15-1+RS047組的乳酸菌活菌數(shù)為1.0×107～1.0×108CFU/g，BS15-3+LP15-1組的乳酸菌活菌數(shù)為5.6×106CFU/g(略低于接種量)，而LP15-1+RS047組發(fā)酵后乳酸菌的活菌數(shù)小于1.0×104CFU/g。

表10 混菌同步發(fā)酵棉籽粕的活菌數(shù)

由于2株乳酸菌混合后在棉籽粕中仍沒有生長且棉籽粕發(fā)霉，因此沒有檢測乳酸菌混菌發(fā)酵棉籽粕樣品的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量及干物質(zhì)回收率。由表11可知，SC17-1+LP15-1組棉籽粕的游離棉酚降解率最高，游離棉酚含量下降至688.50 mg/kg，降解率達到57.96%；其次是BS15-3+SC17-1+LP15-1組，降解率為55.17%；其他混菌組合對游離棉酚均有降解但降解率不高，為20%～50%，其中BS15-3+SC17-1+RS047組游離棉酚降解率最低。除SC17-1+LP15-1組和SC17-1+LP15-1+RS047組之外，混菌發(fā)酵后酸溶蛋白含量顯著高于對照組(P<0.05)，且大多數(shù)高于單菌發(fā)酵，而且凡是接種了枯草芽孢桿菌BS15-3的發(fā)酵組酸溶蛋白含量都比較高，其中BS15-3+SC17-1組、BS15-3+LP15-1組、BS15-3+RS047組、BS15-3+SC17-1+RS047組酸溶蛋白含量與對照組相比都顯著提高(P<0.05)，分別提高了250.94%、223.40%、214.34%和273.96%；SC17-1+LP15-1和SC17-1+RS047這2種組合發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量也有提升，但不如加入BS15-3的組。混菌發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)含量也有不同變化，其中BS15-3+SC17-1組、BS15-3+SC17-1+RS047組、BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047組發(fā)酵棉籽粕的粗蛋白質(zhì)含量分別達到50.61%、51.53%和50.05%，顯著高于對照組(P<0.05)，而BS15-3+SC17-1+LP15-1組的粗蛋白質(zhì)含量最低，且與對照組差異不顯著(P>0.05)。與對照組相比，混菌發(fā)酵后棉籽粕的L-乳酸含量均顯著升高(P<0.05)，其中SC17-1+LP15-1組L-乳酸含量顯著高于其他各組(P<0.05)，達到0.69 g/L；BS15-3+SC17-1+LP15-1組L-乳酸含量提高得最少；BS15-3+SC17-1組、BS15-3+LP15-1組、BS15-3+RS047組、BS15-3+SC17-1+RS047組也略高于對照組，但這4種組合之間差異不顯著(P>0.05)；SC17-1+RS047組、SC17-1+LP15-1+RS047組、BS15-3+LP15-1+RS047組、BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047組L-乳酸含量也分別提高至0.18、0.16、0.13和0.12 g/L。棉籽粕經(jīng)發(fā)酵后干物質(zhì)有一定程度的損失，除BS15-3+SC17-1+LP15-1組外，其他發(fā)酵組均顯著低于對照組(P<0.05)，其中BS15-3+SC17-1+RS047組干物質(zhì)回收率最低，BS15-3+RS047組最高。

表11 混菌同步發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))及干物質(zhì)回收率

2.3 混菌分步發(fā)酵棉籽粕的感官評定、pH、活菌數(shù)、游離棉酚及營養(yǎng)成分變化

由表12可知，先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組發(fā)酵棉籽粕黏度要比單菌和混菌同步發(fā)酵棉籽粕大的多，同時顏色變深，氣味刺鼻，pH與棉籽粕相近，而先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組棉籽粕質(zhì)地松散，顏色較淺，氣味香甜，pH降低至5.28。同時，由表13可知，先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組發(fā)酵后枯草芽孢桿菌BS15-3的活菌數(shù)較高，而先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組發(fā)酵后釀酒酵母SC17-1和乳酸菌活菌數(shù)較高。由表14可知，先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚含量顯著低于對照組和先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組(P<0.05)，降解率為65.10%，粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組和先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組(P<0.05)；先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量升高至19.25%，比對照組提高了626.42%(P<0.05)，先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組酸溶蛋白含量與對照組相比也有顯著提高(P<0.05)，但遠不如先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組；發(fā)酵組L-乳酸含量均顯著高于對照組(P<0.05)，且先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組優(yōu)于先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組(P<0.05)；先SC17-1+LP15-1、再BS15-3組發(fā)酵棉籽粕的干物質(zhì)回收率顯著低于先BS15-3、再SC17-1+LP15-1組和對照組(P<0.05)。

表12 混菌分步發(fā)酵棉籽粕的感官評價及pH

表13 混菌分步發(fā)酵棉籽粕的活菌數(shù)

表14 混菌分步發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))及干物質(zhì)回收率

2.4 正交試驗結(jié)果

由表15可知，不同正交組合發(fā)酵后棉籽粕的品質(zhì)均有不同程度的提升，其中組合4的發(fā)酵效果要優(yōu)于其他組合，其棉籽粕脫毒率(游離棉酚降解率)為62.32%，酸溶蛋白含量提高至4.17%，粗蛋白質(zhì)含量升高至47.07%，L-乳酸含量提高至1.75 g/L，干物質(zhì)回收率為95.27%。通過對正交組合的極差分析可知，對于游離棉酚而言，考察因素效應(yīng)大小依次為料水比>接種比例>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間，最優(yōu)組合為A2D3C3B3；對于酸溶蛋白而言，考察因素效應(yīng)大小依次為接種比例>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>料水比，最優(yōu)組合為D3B3C2A3；對于粗蛋白質(zhì)而言，考察因素效應(yīng)大小依次為料水比>發(fā)酵時間>接種比例>發(fā)酵溫度，最優(yōu)組合為A3B3D2C3；對于L-乳酸而言，考察因素效應(yīng)大小依次為料水比>發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種比例，最優(yōu)組合A2B3C2D3。

表15 正交試驗不同組合發(fā)酵棉籽粕的游離棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白質(zhì)和L-乳酸含量(風(fēng)干基礎(chǔ))及干物質(zhì)回收率

正交試驗方差分析結(jié)果見表16，料水比、發(fā)酵溫度和接種比例對游離棉酚含量有極顯著性影響(P<0.01)，發(fā)酵時間對游離棉酚含量有顯著影響(P<0.05)；接種比例對酸溶蛋白含量有極顯著性影響(P<0.01)，發(fā)酵時間對酸溶蛋白含量有顯著影響(P<0.05)；料水比和發(fā)酵時間對粗蛋白質(zhì)含量有極顯著影響(P<0.01)；料水比、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對L-乳酸含量有極顯著影響(P<0.01)，接種比例對L-乳酸含量有顯著影響(P<0.05)。

綜上所述，發(fā)酵影響因素效應(yīng)大小依次為料水比>發(fā)酵時間>接種比例>發(fā)酵溫度，得到發(fā)酵參數(shù)的最佳工藝組合為A2B3C2D3，即料水比為1.00∶0.80，發(fā)酵時間為4 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，接種比例為1∶1∶10(釀酒酵母SC17-1∶植物乳桿菌LP15-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3)。

表16 正交試驗方差分析結(jié)果

2.5 正交試驗驗證結(jié)果

通過正交試驗得到的發(fā)酵棉籽粕最佳工藝為：料水比為1.00∶0.80，發(fā)酵時間為4 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，接種比例為釀酒酵母SC17-1∶植物乳桿菌LP15-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3=1∶1∶10，即1.0×106CFU/g∶1.0×106CFU/g∶1.0×107CFU/g，在該條件下發(fā)酵，棉籽粕的游離棉酚含量從1 637.61 mg/kg降至552.21 mg/kg，降解率為66.28%，粗蛋白質(zhì)含量從44.66%升高至47.51%，酸溶蛋白含量從2.65%升高至4.99%，L-乳酸含量從0.01 g/L升高至1.83 g/L，干物質(zhì)回收率為94.05%，符合試驗預(yù)期。

3 討 論

3.1 單菌發(fā)酵棉籽粕效果比較

本試驗中，不同菌種對棉籽粕發(fā)酵的效果不同，枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵棉籽粕72 h后，發(fā)酵產(chǎn)物黏度增加且有拉絲現(xiàn)象，可能是因為枯草芽孢桿菌BS15-3有較強的產(chǎn)蛋白酶能力，能將大分子蛋白質(zhì)分解成小肽，因此增加了發(fā)酵產(chǎn)物的黏度[7]；而發(fā)酵棉籽粕的枯草腐敗味且呈弱堿性可能與枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵過程產(chǎn)生的胺等堿性物質(zhì)有關(guān)，然而巨向紅等[10]的研究結(jié)果顯示，經(jīng)枯草芽孢桿菌LBD-1發(fā)酵的飼料pH隨發(fā)酵時間的推移而下降，這可能與所用枯草桿菌菌株和發(fā)酵底物性質(zhì)有關(guān)，該研究使用的發(fā)酵底物不是單一飼料原料而是成品飼料，而且發(fā)酵周期達到15 d，導(dǎo)致代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)；李佳等[11]的研究結(jié)果表明，經(jīng)枯草芽孢桿菌M-9發(fā)酵后的棉籽粕呈黃褐色、質(zhì)地松散、無結(jié)塊，略帶棉籽油味道，無酸敗味、腐味、焦味、霉味或其他異味，這可能是由于該株枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉籽粕過程中沒有產(chǎn)生胺類物質(zhì)。

本試驗中，用釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵的棉籽粕氣味醇香，物料松散，這是因為釀酒酵母厭氧發(fā)酵代謝產(chǎn)生了醇類和有機酸等風(fēng)味物質(zhì)，這種變化提高了發(fā)酵棉籽粕的適口性，同時還降低了棉籽粕的pH，這與羅遠琴等[5]的結(jié)果一致；而釀酒酵母SC17-1好氧發(fā)酵棉籽粕的感官和氣味稍差，主要原因是釀酒酵母在好氧條件下的代謝途徑與厭氧條件不同，產(chǎn)生醇類物質(zhì)和有機酸等代謝產(chǎn)物較少。

綜合感官、活菌數(shù)及營養(yǎng)成分變化來看，枯草芽孢桿菌BS15-3和釀酒酵母SC17-1都能利用棉籽粕生長，成長為優(yōu)勢菌群，說明本研究使用的2株菌都可使棉籽粕中游離棉酚含量降低，酸溶蛋白和粗蛋白質(zhì)含量升高，這與魏蓮清等[12]報道的結(jié)果趨勢一致，但本試驗所用枯草芽孢桿菌發(fā)酵后棉籽粕的脫毒率為36.67%，這與王曉玲等[13]用枯草芽孢桿菌ST-141生料發(fā)酵棉籽粕脫毒率為37%的結(jié)果一致，但遠低于魏蓮清等[12]報道的85.43%。釀酒酵母SC17-1發(fā)酵后棉籽粕的脫毒率為59.98%，與舒文秀[14]所報道的釀酒酵母脫毒率為63.53%的結(jié)果相近，但低于張文舉等[15]報道的熱帶假絲酵母ZD-3達到的86.18%，這可能是菌種差異所致。許多文獻中報道棉籽粕經(jīng)微生物發(fā)酵后脫毒率能達到80%～90%[16]，多數(shù)是因為棉籽粕在發(fā)酵前經(jīng)過了高壓滅菌[17]或者在發(fā)酵過程中添加了發(fā)酵輔料[15]的影響，而本試驗采用固態(tài)生料發(fā)酵且不添加任何發(fā)酵輔料，可以省去對棉籽粕的高溫高壓滅菌處理，這樣可大大節(jié)約生產(chǎn)成本，還可避免棉籽粕因高溫高壓處理而導(dǎo)致的營養(yǎng)物質(zhì)的損失[18-19]。枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵棉籽粕后的酸溶蛋白含量顯著升高說明了感官評價中物料黏度增加是因為小肽含量增加的原因，表明枯草芽孢桿菌BS15-3有較強的蛋白質(zhì)分解能力。根據(jù)發(fā)酵前后干物質(zhì)回收率和粗蛋白質(zhì)含量提高的程度，可以認為發(fā)酵棉籽粕粗蛋白質(zhì)含量增加是由于微生物發(fā)酵后干物質(zhì)損失造成的濃縮效應(yīng)，這與金紅春等[20]和李巧云等[21]的報道一致。釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵后棉籽粕的L-乳酸含量顯著增加說明了感官評價中物料氣味醇香是因為產(chǎn)有機酸的原因。使用乳酸菌植物乳桿菌LP15-1或屎腸球菌RS047單菌發(fā)酵，從感官評價、pH及活菌數(shù)的變化來看，植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047不能在棉籽粕中生長，無法用于棉籽粕的單菌發(fā)酵。

由此可見，綜合發(fā)酵前后感官評價、活菌數(shù)和pH變化以及及游離棉酚和營養(yǎng)成分的變化結(jié)果，單菌發(fā)酵中釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵棉籽粕后游離棉酚降解率最高，感官評價最好，但是酸溶蛋白和L-乳酸含量較低。

3.2 混菌同步發(fā)酵棉籽粕效果比較

從感官評價來看，加入釀酒酵母SC17-1后可以改善枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵導(dǎo)致的物料結(jié)塊、黏度大的問題，但pH、氣味沒有明顯變化，而釀酒酵母SC17-1與植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047配伍發(fā)酵后的棉籽粕都有醇香味或酸香味，這種味道能促進動物的食欲；物料柔軟松散，在一定程度上還可提高棉籽粕的適口性；同時棉籽粕的pH降低，可提供酸性環(huán)境，使發(fā)酵過程不易受雜菌污染。從活菌數(shù)來看，混菌組合中乳酸菌與枯草芽孢桿菌BS15-3或釀酒酵母SC17-1協(xié)同發(fā)酵后活菌數(shù)都升高，可能是枯草芽孢桿菌或釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了某些可以讓乳酸菌利用和生長的物質(zhì)，或者發(fā)酵過程中消耗了過量的氧氣，促進了乳酸菌生長。同時，枯草芽孢桿菌BS15-3和釀酒酵母SC17-1分別與植物乳桿菌LP15-1、屎腸球菌RS047及4種菌混合的組合中，枯草芽孢桿菌BS15-3在發(fā)酵過程中成長為優(yōu)勢菌群，釀酒酵母SC17-1和乳酸菌雖也有增殖但不能改善枯草芽孢桿菌BS15-3發(fā)酵產(chǎn)生的氣味和pH，這與感官評價的結(jié)果一致。從游離棉酚的降解和營養(yǎng)成分的變化看，混菌發(fā)酵對游離棉酚的降解率不如釀酒酵母SC17-1單菌發(fā)酵，其中SC17-1+LP15-1組和BS15-3+SC17-1+LP15-1組的游離棉酚降解率結(jié)果與其相似，而多數(shù)加入屎腸球菌RS047的試驗組游離棉酚的降解率明顯低于釀酒酵母SC17-1單菌發(fā)酵，這說明屎腸球菌RS047與其他菌株可能在降解游離棉酚上存在拮抗作用，因此在后續(xù)試驗中不考慮屎腸球菌RS047作為發(fā)酵菌種。此外，接入枯草芽孢桿菌BS15-3的試驗組的酸溶蛋白含量都明顯提高，這說明在提高酸溶蛋白方面枯草芽孢桿菌起主要作用，且這幾種菌之間無明顯的拮抗作用，這與羅遠琴等[5]的結(jié)果一致。混菌發(fā)酵試驗組中只有BS15-3+SC17-1+LP15-1組的粗蛋白質(zhì)含量與對照組沒有顯著差異，其余組合粗蛋白質(zhì)含量均顯著升高，這說明BS15-3+SC17-1+LP15-1組的微生物對棉籽粕干物質(zhì)的影響不大。SC17-1+LP15-1組混合發(fā)酵后L-乳酸含量顯著高于其他組合和單菌發(fā)酵，釀酒酵母SC17-1可以促進植物乳桿菌LP15-1的生長，這與SC17-1+LP15-1組的pH結(jié)果也是一致的，說明加入植物乳桿菌LP15-1能提高發(fā)酵棉籽粕中L-乳酸的含量，提高飼料的營養(yǎng)價值，這與魏炳棟等[8]的結(jié)果一致。使用乳酸菌植物乳桿菌LP15-1和屎腸球菌RS047混菌發(fā)酵，從感官評價、pH及活菌數(shù)的變化來看，2種菌株不能在棉籽粕中生長，無法用于棉籽粕的混菌發(fā)酵。

由此可見，綜合發(fā)酵前后感官評價、活菌數(shù)和pH變化以及及游離棉酚和營養(yǎng)成分的變化結(jié)果，混菌發(fā)酵試驗組中，釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1混合厭氧發(fā)酵棉籽粕后游離棉酚的降解率最高，與釀酒酵母SC17-1單菌發(fā)酵沒有明顯差異，但是L-乳酸含量顯著升高，與其他混菌發(fā)酵組合相比效果最好。

3.3 混菌分步發(fā)酵棉籽粕效果比較

與單菌發(fā)酵相比，釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1混合厭氧發(fā)酵棉籽粕的L-乳酸含量明顯增加，但是酸溶蛋白含量仍較低，而單菌和混菌發(fā)酵結(jié)果表明，凡是接種枯草芽孢桿菌BS15-3的組合，酸溶蛋白含量均較高，因此，為了提升發(fā)酵棉籽粕的酸溶蛋白含量，仍需接種枯草芽孢桿菌BS15-3，但是根據(jù)混菌發(fā)酵試驗結(jié)果，直接將其與釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1混合接種，進行好氧發(fā)酵，雖然酸溶蛋白含量增加，但是L-乳酸含量極低，然而如果進行厭氧發(fā)酵，枯草芽孢桿菌無法生長，無法增加酸溶蛋白含量。于是，考慮采用混菌分步發(fā)酵法，先接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵，然后接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵；或者先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵，然后接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵，結(jié)果表明，先接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵，然后接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵的樣品，雖然酸溶蛋白和L-乳酸含量較高，但是游離棉酚含量幾乎沒有變化，而亓秀曄等[9]的研究表明，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的最優(yōu)復(fù)配發(fā)酵方式為先好氧發(fā)酵24 h再繼續(xù)厭氧發(fā)酵48 h，在該條件下發(fā)酵的棉籽粕pH降至5.27，酸溶蛋白含量達到23.54%，游離棉酚降解率達到61.58%。而先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵的效果最好，游離棉酚降解率顯著提升，達到65.10%，且酸溶蛋白含量較單菌釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵和混菌釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1發(fā)酵有顯著提升，粗蛋白質(zhì)含量有提升但不顯著，L-乳酸含量高于單菌釀酒酵母SC17-1厭氧發(fā)酵，但顯著低于混菌釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1發(fā)酵。

由此可見，采用混菌分步發(fā)酵法先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵效果較好，雖然L-乳酸含量低于混菌釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1發(fā)酵，但是綜合評價結(jié)果優(yōu)于單菌發(fā)酵和混菌同步發(fā)酵。

3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化

不同發(fā)酵條件對棉籽粕的發(fā)酵也有影響，有研究報道，益生菌固態(tài)發(fā)酵棉籽粕的最佳發(fā)酵時間在48～72 h，最佳發(fā)酵溫度在30～40 ℃，普遍在30 ℃左右，初始含水量在50%左右[22]。Zhang等[23]通過單因素試驗獲得枯草芽孢桿菌對棉籽粕的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間72 h，發(fā)酵溫度39 ℃，初始pH 6.5，初始含水量50%，接種量1.0×107CFU/g。在該條件下進行發(fā)酵將棉籽粕中游離棉酚的含量降至61.25 mg/kg。張曉羊等[24]利用響應(yīng)面法對嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉籽粕的條件進行優(yōu)化，得到理論最佳發(fā)酵條件是接種量為5.96 mL，發(fā)酵溫度為36.99 ℃，發(fā)酵時間為48.26 h，在該條件下發(fā)酵產(chǎn)物有機酸可達7.50%。本研究的結(jié)果顯示，在料水比為1.00∶0.80(初始含水量為50%)，先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1厭氧發(fā)酵2 d，再接種枯草芽孢桿菌B15-3好氧發(fā)酵2 d，接種比例為釀酒酵母SC17-1∶植物乳桿菌LP15-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3=1∶1∶10，即1.0×106CFU/g∶1.0×106CFU/g∶1.0×107CFU/g，發(fā)酵溫度為30 ℃下發(fā)酵效果最好，在該條件下棉籽粕進行固態(tài)生料發(fā)酵脫毒率為66.28%，粗蛋白質(zhì)含量提高了6.38%，酸溶蛋白含量提高了88.30%，L-乳酸含量從0.01 g/L提高至1.83 g/L。

4 結(jié) 論

① 綜合發(fā)酵棉籽粕的感官評價、pH、活菌數(shù)、游離棉酚降解率、酸溶蛋白和粗蛋白質(zhì)含量的提升效果以及L-乳酸含量來看，本試驗采用兩步法發(fā)酵棉籽粕，即先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1進行厭氧發(fā)酵，再接種枯草芽孢桿菌BS15-3進行好氧發(fā)酵的效果較好。

② 通過正交試驗得到的發(fā)酵棉籽粕最佳工藝為：料水比為1.00∶0.80，先接種釀酒酵母SC17-1和植物乳桿菌LP15-1厭氧發(fā)酵2 d，再接種枯草芽孢桿菌B15-3好氧發(fā)酵2 d，發(fā)酵溫度為30 ℃，接種比例為釀酒酵母SC17-1∶植物乳桿菌LP15-1∶枯草芽孢桿菌BS15-3=1∶1∶10，在該條件下發(fā)酵，棉籽粕脫毒率為66.28%，粗蛋白質(zhì)含量從44.66%升高至47.51%，酸溶蛋白含量從2.65%升高至4.99%，L-乳酸含量從0.01 g/L升高至1.83 g/L。