復(fù)合益生菌發(fā)酵飼料發(fā)酵條件優(yōu)化及品質(zhì)鑒定

萬 里 吳國芳 王 磊* 張曉衛(wèi) 馮宇哲

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧810016；2.青海省高原放牧家畜動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)重點實驗室，西寧810016；3.青海省牦牛工程技術(shù)研究中心，西寧810016；4.青海省高原家畜遺傳資源保護及創(chuàng)新利用重點實驗室，西寧810016)

受非洲豬瘟和新冠疫情雙重影響，飼料原料價格不斷飆升，養(yǎng)殖成本成倍增加，如何降低養(yǎng)殖成本迫在眉睫[1]。抗生素作為飼料添加劑被廣泛使用，其顯著增加了養(yǎng)殖效益，但對人類、動物健康以及生態(tài)環(huán)境都造成了嚴重危害[2]。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已于2020年發(fā)文在飼料端禁抗，而益生菌發(fā)酵飼料由于具有無污染、品質(zhì)高、適口性好、利用率高、可部分替代抗生素等優(yōu)點被廣泛關(guān)注[3]，益生菌發(fā)酵可將植物性農(nóng)副產(chǎn)品等原料分解成多糖、蛋白質(zhì)和脂肪等一些大分子物質(zhì)，生成有機酸、可溶性小肽等小分子物質(zhì)和大量的菌體蛋白，形成營養(yǎng)豐富、適口性好的生物飼料[4]。

乳酸菌是影響青貯飼料發(fā)酵的主要益生菌，屬于兼性厭氧型細菌，通過對糖發(fā)酵形成乳酸，從而降低pH，抑制腐敗微生物的生長，減少發(fā)酵過程中的蛋白質(zhì)水解和干物質(zhì)損失[5]。乳酸菌可分為同型乳酸菌和異型乳酸菌兩大類。在飼料中接種同型乳酸菌，飼料發(fā)酵后NH3-N含量和pH較低[6]。異型乳酸菌可增加發(fā)酵飼料中乙酸的含量，抑制好氧腐敗菌的繁殖，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[7]。酵母菌屬于兼性厭氧型真菌，其一方面在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味或蘋果芳香味，從而提高飼料風(fēng)味和動物采食量，另一方面在發(fā)酵過程中通過自身產(chǎn)生的酶將飼料中的大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，進而提高飼料利用率[8]；同時，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸、乙酸、丙酸等有機酸可降低發(fā)酵飼料pH，抑制病原菌生長，提高發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值[9]。添加促進某些微生物定植的添加劑可以對反芻動物的營養(yǎng)方式進行干預(yù)[10]。已有研究表明，在反芻動物飼糧中添加適量的乳酸菌、酵母菌等益生菌可以提高動物的生產(chǎn)性能，改善肉品質(zhì)[11]，優(yōu)化血液生化指標[12]，提高瘤胃功能[13]。

目前關(guān)于益生菌發(fā)酵精補料的報道較少，因此，本試驗使用復(fù)合益生菌對育肥牦牛精補料進行發(fā)酵，通過發(fā)酵條件優(yōu)化、微生物群落分析以及發(fā)酵后飼料品質(zhì)鑒定，全面地對發(fā)酵飼料進行評價，以期為益生菌發(fā)酵飼料在牦牛育肥生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

3株乳酸菌：鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus，YLW001菌株，菌種保藏號CCTCC M 2018759)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici，YLW002菌株，菌種保藏號CCTCC M 2018760)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei，YLW003菌株，菌種保藏號CCTCC M 2018761)；2株酵母菌：釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae，JZ9菌株，菌種保藏號CCTCC M 2020844)、畢赤酵母菌(Pichiapastoris，JZ10菌株，菌種保藏號CCTCC M 2020843)。以上菌株均由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)實驗室篩選得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基(1 L)：蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸二銨2 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、吐溫-80 1 mL、K2HPO42 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、超純水1 000 mL。YPD液體培養(yǎng)基(1 L)：酵母提取物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、超純水1 000 mL。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1.1.3 精補料

試驗所用育肥牦牛精補料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及活菌數(shù)測定

乳酸菌的活化：將凍存的3株乳酸菌菌液解凍后，分別取20 μL，同時加入到裝有MRS液體培養(yǎng)基的15 mL的離心管中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，采用稀釋平板涂布的方法進行活菌數(shù)測定，測得乳酸菌總活菌數(shù)為6×108CFU/mL。

酵母菌的活化：將凍存的2株酵母菌菌液解凍后，分別取20 μL，同時加入到裝有YPD液體培養(yǎng)基的15 mL的離心管中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，采用稀釋平板涂布的方法進行活菌數(shù)測定，測得酵母菌總活菌數(shù)為1×108CFU/mL。

1.2.2 發(fā)酵參數(shù)正交試驗設(shè)計

發(fā)酵條件優(yōu)化使用4因素3水平正交設(shè)計，共設(shè)9個組。用電子秤稱取1.5 kg的精補料，按照正交設(shè)計表(表2)算出所需酵母菌和乳酸菌的體積數(shù)，以及所用水的體積數(shù)(扣除菌液總體積)，將菌液倒入水中，搖勻，均勻地灑在精補料上，拌勻之后分別裝入500 mL的絲口試劑瓶中，每組4個重復(fù)，壓實、蓋好蓋子，按照正交設(shè)計的溫度分別放入到3個對應(yīng)的培養(yǎng)箱中，發(fā)酵5 d后取出，測定相應(yīng)指標。以上一步優(yōu)化條件得到的最優(yōu)組合對精補料進行發(fā)酵，設(shè)定的發(fā)酵時間分別為0、1、3、5、7、10、15 d。發(fā)酵結(jié)束后測定各發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分含量和有氧穩(wěn)定性，以確定最優(yōu)發(fā)酵時間。

1.2.3 指標測定

發(fā)酵飼料的pH使用便攜式pH計進行測定，氨態(tài)氮(NH3-N)、可溶性糖(SS)、淀粉(ST)含量使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒進行測定，黃曲霉毒素B1(AFB1)、嘔吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)含量使用陜西眾美生物科技有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒進行測定。

微生物群落結(jié)構(gòu)：使用Illumina公司的MiSeqPE-300平臺(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)進行16S測序，然后進行α多樣性、β多樣性、LEfSe、相關(guān)性分析。

發(fā)酵飼料中CP(GB/T 6432—2018)、NDF(GB/T 20806—2006)、ADF(NY/T 1459—2007)含量采用相應(yīng)的國標方法測定，纖維素酶(CL)、脂肪酶(LPS)、酸性蛋白酶(ACP)、α-淀粉酶(α-AL)、β-淀粉酶(β-AL)活性使用蘇州科銘生物技術(shù)科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定。

有氧穩(wěn)定性：將發(fā)酵完的飼料依次完全暴露在空氣中10、20、30、40、50、60 d，在每個時間節(jié)點測定飼料中心的溫度和pH，并記錄環(huán)境溫度，當飼料中心溫度高出環(huán)境溫度2 ℃的時間即為有氧穩(wěn)定的臨界時間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

正交設(shè)計結(jié)果采用極差分析法確定最優(yōu)的組合。微生物群落數(shù)據(jù)使用美吉生物云平臺進行分析，按照97%序列相似度進行操作分類單元(OTU)聚類，對樣本進行均一化處理，分析α多樣性，并采用Student’st-test方法進行組間差異性分析。主坐標分析(PCoA)基于bray-curtis距離，組間差異性采用Adonis方法進行分析。LEfSe分析默認LDA-Score的篩選值為2.0。相關(guān)性分析使用R里面的rcorr函數(shù)、Pearson參數(shù)，計算差異菌種和表型的相關(guān)系數(shù)和P值，用熱圖呈現(xiàn)，*表示顯著相關(guān)(P<0.05)，**表示極顯著相關(guān)(P<0.01)。發(fā)酵飼料成分指標數(shù)據(jù)使用SAS 8.2軟件中的ANOVA程序進行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進行多重比較，顯著水平為P<0.05，結(jié)果以平均值±標準差表示。文章中的圖片使用Origin 2018、美吉生物云平臺以及R語言4.0.5軟件繪制而成。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交設(shè)計結(jié)果

飼料中營養(yǎng)成分和霉菌毒素含量正交試驗結(jié)果分別見表3和表4。通過極差分析得出的主次序可以看出，NH3-N含量受D因素即水料比的影響最大，并且在D3、D7水平下含量較低，得到NH3-N含量的優(yōu)化組為G3、G7組；SS含量受A因素即接種量的影響最大，并且在A1、A2水平下含量較高，得到SS含量的優(yōu)化組為G4、G6組；各組的pH差異不大，因此不需要優(yōu)化；利用同樣的方法得到ST含量的優(yōu)化組為G6組，AFB1含量的優(yōu)化組為G1、G7組，ZEN含量的優(yōu)化組為G1、G7組，DON含量的優(yōu)化組為G5、G7組。由于G4組NH3-N含量過高、ST含量過低，G6組NH3-N、AFB1、DON含量過高，G5和G7組SS含量過低，G1組NH3-N含量過高，不符合要求，因此確定G3組為最優(yōu)組。

2.2 不同處理對飼料中微生物群落的影響

2.2.1 不同處理對飼料中微生物群落α多樣性和β多樣性的影響

為了分析飼料中微生物群落的α多樣性，計算Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)，并進行指數(shù)間差異分析，結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看到，G3組Shannon指數(shù)顯著高于G1、G2、G4、G6、G7、G8、G9組(P<0.05)，略高于G5組(P>0.05)；G3組Simpson指數(shù)顯著低于G1、G2、G4、G6、G7、G8、G9組(P<0.05)，略低于G5組(P>0.05)。上述結(jié)果說明G3組飼料中微生物群落的α多樣性高于其他組。

在OTU水平上，基于bray-curtis距離進行PCoA，結(jié)果如圖2所示，G3、G5、G7組間分組聚類明顯，G1、G2、G4、G6、G8、G9組間分組聚類不明顯，使用Adonis方法進行組間差異分析發(fā)現(xiàn)，G3組與G1、G2、G4、G7、G6、G8、G9組差異顯著(P<0.05)，與G5組差異不顯著(P>0.05)，這說明G3組飼料中微生物群落的β多樣性高于其他組。

2.2.2 不同處理對飼料中微生物群落組成的影響

如圖3所示，在種水平上，G1、G2、G4、G6、G8、G9組的優(yōu)勢菌種為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，分別占總豐度的99.20%、98.37%、98.18%，99.20%、99.24%、98.06%，G3、G5、G7組的優(yōu)勢菌種為Lactobacillusplantarum、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)，其中在G3組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的65.35%、32.56%；G5組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的65.43%、33.86%，在G7組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis分別占總豐度的83.10%、16.34%。對優(yōu)勢菌種進行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，G3組中Lactobacillusplantarum、Lactobacillusbrevis的相對豐度與G1、G2、G4、G5、G6、G8、G9組差異顯著(P<0.05)，與G7組差異不顯著(P>0.05)。此外，G1組中還有少量的密執(zhí)安棒形桿菌(Clavibactermichiganensis)、金色馬賽菌(Massiliaaurea)，分別占總豐度的0.007 6%、0.006 4%；G2組中有少量的類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)、泡囊短波單胞菌(Brevundimonasvesicularis)，分別占總豐度的0.003 8%、0.004 1%；G3組中Pediococcusacidilactici占總豐度的1.7%，高于其他組；G5、G8組中青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)分別占總豐度的0.020%、0.015%；G6組中Clavibactermichiganensis、Massiliaaurea、Brevundimonasvesicularis分別占總豐度的0.003 6%、0.002 5%、0.002 5%。

對差異微生物進行LEfSe，由LDA判別柱形圖(圖4)發(fā)現(xiàn)，G1組以葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、Staphylococcales、葡萄球菌屬(Staphylococcus)為主，G3組以片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)為主，G4組以Lactobacillus為主，G5組以乳桿菌科(Lactobacillaceae)、Lactobacillusbrevis為主，G7組以乳桿菌目(Lactobacillales)、厚壁菌門(Firmicutes)、桿菌綱(Bacilli)為主，G8組以Lactobacillales、Lactobacillusplantarum為主，G9組以Lactobacillusrhamnosus、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、明串珠菌屬(Leuconostoc)為主。

2.2.3 飼料微生物與飼料指標之間的關(guān)聯(lián)性

以計算出的Pearson相關(guān)系數(shù)為標準，將飼料AFB1、ZEN、DON、NH3-N、ST、SS含量及pH與微生物在屬水平上的物種進行關(guān)聯(lián)分析(圖5)發(fā)現(xiàn)：AFB1含量與Norank_Mitochondria相對豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；ZEN含量與Norank_Mitochondria、Leuconostoc相對豐度呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)；NH3-N含量與Leuconostoc、Staphylococcus、未分類乳桿菌目(Unclassified_Lactobacillales)相對豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與Pediococcus相對豐度呈極顯著負相關(guān)，與短桿菌屬(Curtobacterium)、棒形桿菌屬(Clavibacter)、Norank_Mitochondria相對豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；ST含量與泛生菌屬(Pantoea)、Leuconostoc、Curtobacterium、Norank_Mitochondria、Unclassified_Lactobacillales相對豐度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與假單胞菌屬(Pseudomonas)相對豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；SS含量與Staphylococcus相對豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；pH與Staphylococcus相對豐度呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與Unclassified_Lactobacillales相對豐度呈顯著負相關(guān)(P<0.05)。

2.3 發(fā)酵天數(shù)對飼料發(fā)酵指標的影響

2.3.1 發(fā)酵天數(shù)對飼料中CP、NDF、ADF含量的影響

從圖6可以看出，與發(fā)酵第0天(未發(fā)酵)時相比，發(fā)酵第1～15天的飼料中CP含量均有不同程度的升高，以發(fā)酵第5天時最高，顯著高于發(fā)酵第0、1、10、15天時(P<0.05)，而發(fā)酵第1、10、15天與發(fā)酵第0天差異不顯著(P>0.05)；飼料中NDF、ADF含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加先降低后升高，發(fā)酵第1～15天的飼料中NDF、ADF含量均顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時最低，發(fā)酵7 d后不再有顯著變化(P>0.05)。

2.3.2 發(fā)酵天數(shù)對飼料中NH3-N、SS、ST含量以及pH的影響

從圖7可以看出，飼料中NH3-N含量在發(fā)酵第3、7、10、15天時顯著高于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，發(fā)酵第1天時顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，發(fā)酵第5天時與發(fā)酵第0天時差異不顯著(P>0.05)，以發(fā)酵第15天時最高，但與發(fā)酵第3、10天時差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵第1～15天的飼料中SS含量顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)；飼料中ST含量隨發(fā)酵天數(shù)的增加總體呈下降趨勢，發(fā)酵第1天時與發(fā)酵第0天時差異不顯著(P>0.05)，其余發(fā)酵天數(shù)均顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)；飼料的pH隨發(fā)酵天數(shù)的增加持續(xù)降低，且發(fā)酵第1～15天的飼料的pH均顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，以發(fā)酵第10、15天時較低。

2.3.3 發(fā)酵天數(shù)對飼料中酶活性的影響

從圖8可以看出，飼料中纖維素酶活性只有發(fā)酵在第5天時顯著高于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，除發(fā)酵第3天時略有升高外，其余發(fā)酵天數(shù)時均略有升高，但差異不顯著(P>0.05)；飼料中脂肪酶活性隨發(fā)酵天數(shù)的增加先升高后降低之后保持穩(wěn)定，且飼料中脂肪酶活性在發(fā)酵第1～15天時均顯著高于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時活性最高；飼料中α-淀粉酶活性在發(fā)酵第1、5天時顯著高于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，發(fā)酵第3、7天時較發(fā)酵第0天時略有升高，但差異不顯著(P>0.05)，發(fā)酵第10天時開始降低，與發(fā)酵第0天時差異不顯著(P<0.05)；飼料中β-淀粉酶活性在發(fā)酵第1、3天時與發(fā)酵第0天時相比略有升高，在發(fā)酵第5、7天時與發(fā)酵第0天時相比略有降低，但差異均不顯著(P>0.05)，從發(fā)酵第10天時開始顯著降低(P<0.05)。飼料中酸性蛋白酶活性隨發(fā)酵天數(shù)的增加呈先升高后降低的趨勢，且發(fā)酵第1～15天時均顯著高于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，以發(fā)酵第5天時最高。

2.3.4 發(fā)酵天數(shù)對飼料中霉菌毒素含量的影響

從圖9可以看出，發(fā)酵第1～15天時飼料中AFB1、ZEN和DON含量均顯著低于發(fā)酵第0天時(P<0.05)，其中AFB1含量均以發(fā)酵第15天時最低，ZEN含量以發(fā)酵第10天時最低，DON含量從發(fā)酵第5天開始趨于平穩(wěn)，不再有顯著變化(P>0.05)。

2.3.5 發(fā)酵天數(shù)對飼料有氧穩(wěn)定性的影響

從圖10可以看出，隨著暴露時間的增加，飼料的中心溫度逐步升高，當暴露20 d時，飼料的中心溫度高出環(huán)境溫度2 ℃。暴露0～20 d時pH基本在4.5以下，與發(fā)酵時的pH基本保持一致，暴露20～30 d期間pH快速升高，暴露40 d時pH達到最高，說明暴露20 d以后飼料開始腐敗，飼料的有氧穩(wěn)定的臨界時間為20 d。

3 討 論

3.1 最優(yōu)發(fā)酵條件的確定

混合菌發(fā)酵時的接種量、接種比例、溫度、水料比是影響發(fā)酵的主要因素[14]，接種量的多少會通過改變菌的代謝影響發(fā)酵結(jié)果，過多則代謝物太多發(fā)酵不充分，過少則生長底物剩余。接種比例適宜可促進菌株共同生長，不適宜則兩者中的一種對底物消耗太多，影響另一種生長，或者一種大量生長產(chǎn)生過多代謝物抑制另一種生長，影響發(fā)酵效果。溫度則主要影響酶促效率，由于酵母菌和乳酸菌生長的最適溫度不同，在溫度的選擇上應(yīng)考慮到兩者生長曲線的交叉點，保證兩者共同生長。水料比太大影響到氧氣的流動，會抑制微生物的生長，太小則底物的溶解度降低，影響底物的利用率。飼料中SS、ST含量較高為宜，NH3-N、pH、毒素含量較低為宜。影響指標的主次順序與極差的大小呈正相關(guān)，結(jié)合方差分析可得到G3組最符合要求，即接種量5%，接種比例2∶1，溫度30 ℃，水料比1∶1。周靜等[15]采用單因素接種比例研究酵母菌和乳酸菌的共生機制時，設(shè)置接種比例分別為2∶1、1∶1、3∶2、1∶2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種比例為3∶2時總活菌數(shù)最多。吝常華[16]研究顯示，用芽孢桿菌、Lactobacillusplantarum和Saccharomycescerevisiae發(fā)酵豆粕時，最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量15%、水料比1∶1、溫度31 ℃；用枯草芽孢桿菌單菌發(fā)酵豆粕時，最優(yōu)發(fā)酵條件為：接種量10%、水料比1.2∶1、溫度40 ℃。本試驗所得到的最優(yōu)發(fā)酵條件部分與上述研究相一致，部分有差別，可能與測定指標、菌種不一致有關(guān)。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化對飼料微生物群落的影響

本試驗中G3組飼料中微生物的α多樣性和β多樣性均高于其他組。乳酸菌是厭氧發(fā)酵最主要的細菌[17]。有研究表明，乳酸含量降低，飼料中pH增大，飼料中一些不耐酸的微生物就會大量繁殖，導(dǎo)致微生物的多樣性增加[18]。G3、G6、G7組飼料中酵母菌和乳酸菌的接種比例為2∶1，G1、G5、G8組為1∶1，G2、G4、G9組為1∶2，因此G2、G4、G9組飼料中微生物多樣性較低。有研究表明酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵前5 d，酵母菌可促進乳酸菌的生長[19]，從種水平上物種豐富度來看，G3組Lactobacillusbrevis的相對豐度提高，并且還有一部分為Pediococcusacidilactici，因此G3組的多樣性最高。同時，在種水平相對豐度上顯示，G1組中有少量的Clavibactermichiganensis，G2組中有少量的Brevundimonasvesicularis，G5、G8組中有少量的Ralstoniasolanacearum，G6組中有少量的密執(zhí)安棒狀桿菌、Brevundimonasvesicularis。研究表明：Ralstoniasolanacearum、Clavibactermichiganensis都是致病菌，可導(dǎo)致植物萎蔫致死[20-21]，Brevundimonasvesicularis也是一種致病菌，但不同于以上的菌種，它能夠引起動物肺部感染、敗血癥、關(guān)節(jié)炎等疾病[22]，因此G1、G2、G5、G6、G8組不符合要求。LEfSe分析發(fā)現(xiàn)G1組有葡萄球菌，G9組有明珠串球菌，而葡萄球菌為致病菌，能產(chǎn)生使血液凝固的酶，以及殺死細胞，明珠串球菌為危害菌，常能使蔬菜、糖類等發(fā)黏而影響加工，因此G1、G9組都不符合要求。而對于G3、G4、G7組，G3組中Pediococcusacidilactici的相對豐度高于其他組，Pediococcusacidilactici作為乳酸菌的一類，有助于提高飼料品質(zhì)，所以G3組相對于其他組更有優(yōu)勢。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳酸菌對AFB1、ZEN、DON、ST、SS有抑制作用，而片球菌對NH3-N、pH有抑制作用，對ST、SS有促進作用，有研究表明：乳酸菌對AFB1、ZEN、DON都有一定的降解能力，而乳酸菌在發(fā)酵過程中需要能量來維持自身的生長，因此ST和SS被消耗。乳酸菌在增殖過程中由于產(chǎn)酸而使得pH降低，因而抑制蛋白酶的活性，使得蛋白質(zhì)損耗減少，從而對NH3-N起抑制作用[23]，LEfSe分析發(fā)現(xiàn)G3組主要以Pediococcus、Lactobacillus為主，因此G3組符合要求。

3.3 復(fù)合益生菌發(fā)酵對飼料營養(yǎng)成分及pH的影響

飼料中NDF、ADF和CP的含量是評價飼料品質(zhì)最重要的指標，NDF和ADF含量越低，CP含量越高，表明飼料品質(zhì)越好[24]。NDF、ADF含量降低的原因可能與發(fā)酵過程中產(chǎn)生分解纖維的酶類將植物細胞壁中的纖維降解為水溶性碳水化合物有關(guān)[25]。本試驗中，發(fā)酵到第5天時飼料中纖維素酶的活性最高，因此發(fā)酵到第5天時飼料中NDF、ADF的含量最低。蛋白質(zhì)含量提高的原因可能是在發(fā)酵初期，乳酸菌大量繁殖，酵母菌同時促進乳酸菌的生長，抑制了有害微生物的繁殖，減少了發(fā)酵初期植物呼吸作用對蛋白質(zhì)的水解[26]。ST含量較低的原因可能是加入的乳酸菌數(shù)量充足，大量同型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵前期快速產(chǎn)酸需要消耗能量以維持自身生長，發(fā)酵過程中更多的ST被利用[27]。乳酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸也抑制了酵母菌等其他微生物的活動，使pH維持在低水平下，蛋白酶活性受到抑制，從而減少了NH3-N的產(chǎn)生[23]。SS含量降低的主要原因是發(fā)酵期間乳酸菌活動旺盛，消耗的SS較多。pH降低的原因是乳酸菌和酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸導(dǎo)致酸度增加。羅攖寧等[28]在甜玉米籽青貯中加入乳酸菌后，NH3-N含量顯著降低。王小平等[29]用酵母菌和乳酸菌的復(fù)合菌劑對玉米青貯發(fā)酵，結(jié)果顯示玉米青貯的CP含量顯著升高，NDF、ADF含量顯著下降。程方等[30]使用黑曲霉和啤酒酵母對馬鈴薯渣進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯渣的CP含量及蛋白酶、纖維素酶活性均顯著提高，粗纖維(CF)含量顯著降低。王志敬等[31]對鳳梨渣進行青貯發(fā)酵，結(jié)果顯示，與發(fā)酵第0天相比，發(fā)酵后的鳳梨渣NH3-N含量顯著上升，SS含量、pH顯著下降。王平[32]探究了乳酸菌發(fā)酵對玉米淀粉的影響，結(jié)果表明發(fā)酵第4天后玉米淀粉含量開始下降。不同研究結(jié)果不一致的原因可能是所用的菌株不同，產(chǎn)酶與產(chǎn)酸的速率不同。因此，可以認為復(fù)合益生菌發(fā)酵可以提高飼料的營養(yǎng)水平，降低pH。

3.4 復(fù)合益生菌發(fā)酵對飼料中酶活性的影響

隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，乳酸菌不斷生長，將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，從而為酵母菌的生長提供能量，酵母菌大量繁殖，分泌纖維素酶，促進了植物纖維素的降解，同時酵母菌利用乳酸鹽促進了乳酸菌的生長，乳酸菌產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶，促進了植物飼料中ST、甘油三酯、肽鏈的水解[33]。本試驗中，發(fā)酵到第5天時，飼料中的纖維素酶、脂肪酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶活性較第0天時顯著提高，β-淀粉酶活性差異不顯著，但總淀粉酶活性上升，與上述研究結(jié)果相一致，而后期隨著乳酸菌和酵母菌生長底物的消耗，兩者的生長緩慢，代謝減慢，分泌的酶減少。由此可以認為，復(fù)合益生菌發(fā)酵可以降解飼料中的大分子物質(zhì)，使得飼料更容易被消化吸收。

3.5 復(fù)合益生菌發(fā)酵對飼料中霉菌毒素含量的影響

飼料在制備的過程中不可避免地會感染到少數(shù)霉菌，這些霉菌通過代謝會分泌霉菌毒素，如AFB1、ZEN、DON等，動物進食被霉菌毒素感染的飼料后健康遭受危害，已有研究表明益生菌發(fā)酵可以降低飼料中霉菌毒素含量[34]。生物吸附是微生物的細胞壁中的碳水化合物對毒素進行物理以及化學(xué)吸附，微生物發(fā)酵是發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物通過破壞毒素的結(jié)構(gòu)而使其變成低毒產(chǎn)物，從而達到安全、穩(wěn)定、脫毒比較徹底的效果[35]。Bovo等[36]使用Lactobacillusrhamnosus吸附處理AFB1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有未被破壞細胞壁的Lactobacillusrhamnosus對AFB1有一定吸附能力。Hernandez-Mendoza等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacilluscasei也可以降解AFB1，降解率達49.2%。劉暢等[38]研究顯示，Saccharomycescerevisiae同樣可以降解AFB1，降解率達81.16%。Niderkorn等[39]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對DON有較強的清除能力。Repedkiene等[40]研究顯示，Saccharomycescerevisiae對DON有良好的吸附能力。趙雪芹等[41]用6種益生菌對ZEN和DON進行了降解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pediococcusacidilactici對ZEN的降解率達16.32%，對DON的降解率達75.51%。Wang等[42]研究發(fā)現(xiàn)，Lactobacillusrhamnosus和Saccharomycescerevisiae均能降解ZEN，其中Lactobacillusrhamnosus對ZEN的降解率達46%。本試驗所得結(jié)果顯示，在發(fā)酵第10天時，AFB1含量降低了73.27%，DON含量降低了59.01%，ZEN含量降低了70.59%，ZEN含量的降低程度高于上述前人研究結(jié)果，AFB1、DON含量的降低程度都在前人研究范圍內(nèi)，對ZEN含量的降低程度提高可能與本試驗中乳酸菌和酵母菌的相互促進有關(guān)。綜上可知，復(fù)合益生菌發(fā)酵可以降低飼料中霉菌毒素的含量。

3.6 復(fù)合益生菌發(fā)酵對飼料有氧穩(wěn)定性的影響

發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性是評價其是否發(fā)生腐敗變質(zhì)的重要指標，評價方法是將發(fā)酵好的飼料暴露在空氣中，通過測定飼料中心溫度以及環(huán)境溫度，兩者溫度之差達到2 ℃時的時間即為有氧穩(wěn)定的臨界時間，超過該時間則發(fā)酵飼料開始腐敗變質(zhì)[43]。同樣，pH也是衡量發(fā)酵飼料有氧穩(wěn)定性的一個重要指標[44]。發(fā)酵飼料暴露在空氣中與氧氣充分接觸，導(dǎo)致酵母菌、霉菌等好氧微生物大量增殖，會引起溫度和pH的異常升高，導(dǎo)致發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性降低[45]。有研究表明，同型發(fā)酵的乳酸菌產(chǎn)生的乙酸過少，導(dǎo)致有氧穩(wěn)定性差。不同的是，異型發(fā)酵的乳酸菌可以產(chǎn)生更多的乙酸，可以抑制好氧發(fā)酵，抑制酵母菌和霉菌的生長，而Lactobacillusrhamnosus和Lactobacilluscasei均可以進行異型發(fā)酵，從而防止飼料過早的腐敗變質(zhì)，提高發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性。Kleinschmit等[46]對玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定性進行了評價，發(fā)現(xiàn)沒有添加乳酸菌的玉米青貯飼料的有氧穩(wěn)定臨界時間為25 h，布氏乳桿菌的添加量達到105CFU/g后有氧穩(wěn)定臨界時間為35 h，布氏乳桿菌的添加量超過105CFU/g后，有氧穩(wěn)定臨界時間達到503 h。本試驗中添加了Lactobacillusrhamnosus和Lactobacilluscasei，并且添加量均超過105CFU/g，其有氧穩(wěn)定臨界時間為480 h，與上述研究結(jié)果接近。本試驗中有氧暴露20～30 d時，發(fā)酵飼料的pH開始大幅度升高，表明此時pH出現(xiàn)異常升高，結(jié)合溫度變化的時間節(jié)點，可知發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定臨界時間為20 d，說明本試驗的復(fù)合益生菌可以提高發(fā)酵飼料的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

① 精補料的最優(yōu)發(fā)酵條件：接種量5%，接種比例2∶1、溫度30 ℃、水料比1∶1。該發(fā)酵條件能夠有效提高發(fā)酵飼料中微生物的多樣性，提高Lactobacillusbrevis的相對豐度。

② 精補料的最佳發(fā)酵時間為5 d，該發(fā)酵時間可提高發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分含量，降低霉菌毒素含量。

③ 發(fā)酵結(jié)束開蓋后，發(fā)酵飼料應(yīng)在20 d內(nèi)喂完。