木犀草素對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)控機(jī)制

韓寧馨 孫雅麗 盛 帥 張 雯

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱150040)

木犀草素(luteolin，LUT)是黃酮亞綱黃酮類化合物，通過(guò)苯丙烷途徑在植物內(nèi)合成，廣泛分布于蔬菜、水果、花卉、香料和藥用植物中，是植物應(yīng)對(duì)紫外輻射、病蟲害、真菌及細(xì)菌感染的重要反應(yīng)物。目前研究證實(shí)，LUT能有效調(diào)節(jié)糖脂代謝，預(yù)防心血管疾病，具有抗炎抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[1]。近年來(lái)，畜牧行業(yè)對(duì)LUT進(jìn)行了初步研究，作為天然植物成分，LUT在改善動(dòng)物健康和提升動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)等方面有著巨大潛力。本文就LUT的吸收代謝、抗炎抗氧化機(jī)制進(jìn)行綜述，并總結(jié)了LUT在畜牧生產(chǎn)中的研究現(xiàn)狀，為L(zhǎng)UT的開發(fā)利用和后續(xù)研究提供參考。

1 LUT的吸收代謝

LUT(相對(duì)分子質(zhì)量286.24，分子式C15H10O6，CAS編號(hào)491-70-3)一般為黃色針狀晶體，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，不溶于冷水、微溶于熱水，易溶于有機(jī)溶劑和堿性溶液，水溶液呈弱酸性。其結(jié)構(gòu)特征為1個(gè)含氧吡喃環(huán)與2個(gè)苯環(huán)相連，且C5、C7、C3和C4位各有1個(gè)羥基[2]。

LUT常以其苷元(沒(méi)有任何糖結(jié)合的分子)和糖苷(與一種或多種糖基結(jié)合的苷元)形式存在，苷元經(jīng)口服給藥后在胃腸道發(fā)生水解，經(jīng)過(guò)氧化、甲基化、磺酸化以及葡萄糖醛基化等過(guò)程代謝為葡萄糖醛酸和硫酸鹽結(jié)合物并進(jìn)入血液循環(huán)。而糖苷(如木犀草素-7-O-葡萄糖苷)則要先經(jīng)過(guò)脫葡萄糖基成為苷元后再經(jīng)歷上述過(guò)程[3]，且LUT對(duì)木犀草素-7-O-葡萄糖苷的生物轉(zhuǎn)化率為48.78%～48.90%[4]。黃酮類化合物的結(jié)合首先發(fā)生在小腸，然后是肝臟，在那里它們被進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生的葡萄糖醛酸和硫酸鹽衍生物促進(jìn)它們通過(guò)尿液和膽汁排泄[5]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glucuronosyltransferase，UGT)介導(dǎo)的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)是機(jī)體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝途徑[6]，UGT1A1、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A9和UGT1A10是參與代謝的主要UGT亞型酶[7]。且UGT1A9是代謝LUT最重要的UGT亞型酶，介導(dǎo)LUT上C7—OH和C3′—OH進(jìn)行葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)；UGT1A6只介導(dǎo)LUT上C7—OH的葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)[8]。Chen等[9]研究了大鼠灌胃菊花提取物(200 mg/kg)后發(fā)現(xiàn)尿液(6.6%)和糞便(31.3%)中LUT含量較低，側(cè)面證明LUT及葡醛酸和硫酸酯結(jié)合物在經(jīng)過(guò)結(jié)腸時(shí)會(huì)立刻被腸道菌群水解成苷元。而未被腸道吸收的LUT將到達(dá)結(jié)腸，并受到結(jié)腸微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)修飾。另外，LUT的代謝還與“腸肝循環(huán)”有關(guān)，在肝臟中代謝的一部分LUT會(huì)與膽汁一起經(jīng)總膽管排進(jìn)十二指腸，共軛化分解為苷元后被小腸重吸收，由門靜脈回流入肝臟，產(chǎn)生“雙峰”現(xiàn)象。Li等[10]采用高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定Beagle犬服用菊花提取物后血液中LUT含量，發(fā)現(xiàn)LUT的末端消除半衰期較長(zhǎng)，且在服用LUT后6～10 h期間出現(xiàn)第2個(gè)吸收峰，大大增加血液中LUT含量。通過(guò)HPLC法和電化學(xué)檢測(cè)(ECD)系統(tǒng)對(duì)大鼠血漿中游離LUT進(jìn)行定量分析，Yasuda等[11]發(fā)現(xiàn)灌胃菊花提取物(1.7 g/kg BW)0.5 h后大鼠血漿中LUT含量迅速升高，并在1 h達(dá)到峰值(0.76～1.03 μmol/L)。另一項(xiàng)在小鼠上的研究表明，LUT的口服生物利用度為26%～32%，高于木犀草素-7-O-葡萄糖苷(10%～12%)，證實(shí)LUT經(jīng)口服后可被有效吸收[4]。

2 LUT的抗氧化作用

2.1 清除自由基

活性氧(ROS)通常是小的、壽命短的以及高活性的分子，由氧的不完全單電子還原形成。低水平ROS可以作為觸發(fā)細(xì)胞生存機(jī)制的信號(hào)，然而，當(dāng)ROS水平過(guò)高超過(guò)抗氧化防御系統(tǒng)所抑制的范圍時(shí)則會(huì)打破機(jī)體氧化還原平衡，造成氧化應(yīng)激。LUT清除自由基的能力與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，其酚羥基與含氧自由基發(fā)生抽氫反應(yīng)，生成半醌式自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其中B環(huán)上C4′—OH、C5′—OH鄰二羥基的構(gòu)成對(duì)其抗氧化能力的增強(qiáng)有著關(guān)鍵作用[12]。楊怡萌等[13]對(duì)LUT與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基甲醛溶劑發(fā)生抽氫反應(yīng)的反應(yīng)焓變進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)C4′—OH(74.47 kJ/mol)和C5′—OH(90.79 kJ/mol)的反應(yīng)焓值遠(yuǎn)小于其他酚羥基位點(diǎn)。同時(shí)C4′和C3′上的鄰位羥基還可與C4上的羰基氧形成分子內(nèi)氫鍵，加強(qiáng)半醌式自由基穩(wěn)定性，進(jìn)一步提高LUT對(duì)自由基的清除能力[14]。除此之外，作為L(zhǎng)UT發(fā)揮抗氧化活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，B環(huán)上C4′—OH、C5′—OH鄰二羥基還可螯合金屬離子形成配合物。體外研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素-Zn配合物抗DPPH自由基的活性還要強(qiáng)于LUT本身[15]，再次印證了LUT針對(duì)含氧自由基的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)。

2.2 增強(qiáng)抗氧化酶活性

多種抗氧化酶是機(jī)體維持氧化還原平衡的主要物質(zhì)，是有氧代謝過(guò)程中重要的保護(hù)防線，LUT可通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶水平和還原性物質(zhì)的生成來(lái)應(yīng)對(duì)組織和細(xì)胞的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)黃曲霉素B1誘發(fā)肝臟損傷的小鼠連續(xù)15 d灌胃LUT(50 mg/kg)后，肝臟組織中過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性大大提高，肝臟組織中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性等指標(biāo)呈下降趨勢(shì)[16]。此外，在赫曲霉素A誘導(dǎo)的大鼠腎細(xì)胞損傷試驗(yàn)中添加LUT后，細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放量下降，ROS積累減少，線粒體膜電位升高，細(xì)胞活力恢復(fù)至正常水平[17]。除此之外，多項(xiàng)研究證實(shí)，LUT的抗氧化機(jī)制還與核因子E2相關(guān)性因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap-1)通路有關(guān)，Nrf2是一種對(duì)氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于身體各個(gè)器官，在抗氧化反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。正常生理?xiàng)l件下，Nrf2被Keap-1隔離在細(xì)胞質(zhì)中，處于非活性狀態(tài)，使其不斷泛素化和被蛋白酶體降解。當(dāng)Nrf2暴露在氧化應(yīng)激下時(shí)，LUT作用于此通路，使得Nrf2立即從Keap-1的抑制狀態(tài)下釋放并移位至細(xì)胞核，并與Maf蛋白結(jié)合形成異源二聚體再與抗氧化反應(yīng)原件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合，激活血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、NADPH醌氧化還原酶(NADPH quinone oxidoreductase 1，NQO1)等下游抗氧化蛋白和Ⅱ相代謝酶轉(zhuǎn)錄，在機(jī)體適應(yīng)性反應(yīng)和細(xì)胞保護(hù)中扮演重要角色[18]。Li等[19]認(rèn)為L(zhǎng)UT可通過(guò)Nrf2/Keap-1通路緩解小鼠結(jié)腸炎癥狀，不僅如此，LUT對(duì)重金屬中毒[20]、缺血再灌注損傷[21]等模型均有明顯治療作用，其作用機(jī)制均與下調(diào)ROS水平、調(diào)控Nrf2/Keap-1通路有關(guān)。因此LUT可從多條途徑發(fā)揮抗氧化功能，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷。

3 LUT的抗炎作用

3.1 調(diào)控促炎介質(zhì)

炎癥是機(jī)體針對(duì)創(chuàng)傷、應(yīng)激和病原體等多種因素的生理反應(yīng)過(guò)程，是免疫監(jiān)視、組織損傷后再生所必須的。正常狀態(tài)下機(jī)體自身可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，然而炎癥因子的持續(xù)刺激會(huì)招募更多炎癥相關(guān)細(xì)胞從血液遷移至炎癥組織[22]。LUT的抗炎作用一部分是通過(guò)降低多種促炎細(xì)胞因子、趨化因子的表達(dá)發(fā)揮作用，其中包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-31、IL-33以及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等[23]。此外，LUT還可提高IL-10、IL-13等抗炎因子表達(dá)，Xie等[24]研究發(fā)現(xiàn)LUT有效上調(diào)盲腸結(jié)扎穿刺誘導(dǎo)的肺臟損傷小鼠血清和肺泡灌洗液中IL-10水平。不僅如此，LUT還有改變巨噬細(xì)胞M1/M2極化比例，平衡各類炎癥因子的潛力，Wang等[25]經(jīng)過(guò)LUT干預(yù)后發(fā)現(xiàn)M1型表面標(biāo)志物CD86、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、IL-1β和IL-6的表達(dá)明顯降低，而M2型標(biāo)志物CD206、IL-10和IL-13的表達(dá)明顯增加。此外，LUT還能調(diào)控多種內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子，通過(guò)抑制單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、黏附和遷移，避免產(chǎn)生泡沫細(xì)胞和斑塊，預(yù)防血管炎癥和相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn)。Jia等[26]通過(guò)在飼糧中添加LUT(0.6%)對(duì)TNF-α刺激后的小鼠進(jìn)行3周的膳食補(bǔ)充后發(fā)現(xiàn)，小鼠血液中MCP-1、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的循環(huán)水平顯著降低，主動(dòng)脈內(nèi)膜層、內(nèi)皮層附近彈性蛋白纖維等精細(xì)組織得到保留，血管壁完整性大大提高。Su等[27]在研究腸系膜小靜脈炎癥時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)大鼠進(jìn)行LUT灌胃治療后，白細(xì)胞與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附得到有效抑制，血管通透性和腸微循環(huán)血量均有顯著改善，充分說(shuō)明LUT可有效控制體內(nèi)各類促炎介質(zhì)并與體內(nèi)抗炎因子形成正向動(dòng)態(tài)平衡，構(gòu)建正向穩(wěn)定的機(jī)體內(nèi)環(huán)境。

3.2 調(diào)節(jié)促炎基因表達(dá)

LUT的抗炎活性還與促炎基因的控制有關(guān)，其中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是促炎基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子之一，介導(dǎo)多種炎癥因子生成，正常狀態(tài)下，NF-κB與其抑制蛋白(IκB)互相結(jié)合并以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)，一旦受到刺激，位于細(xì)胞膜上的Toll樣受體4(TLR4)通過(guò)髓系分化因子88(MyD88)激活I(lǐng)κB激酶(IKK)，IκB被IKK磷酸化降解，使得NF-κB釋放并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，誘導(dǎo)多種靶基因轉(zhuǎn)錄[28]。研究證實(shí)，LUT以劑量依賴的方式阻斷NF-κB/p65易位和NF-κB/p65在細(xì)胞核內(nèi)的磷酸化水平。在棕櫚酸刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVCEs)中，LUT的預(yù)處理可以抑制IκB激酶β亞基磷酸化，下調(diào)TNF-α、IL-6的mRNA水平[29]。同時(shí)，LUT還可控制NF-κB上游信號(hào)，通過(guò)抑制MyD88蛋白表達(dá)減少巨噬細(xì)胞活化脂肽-2(MALP-2，Toll樣受體2激動(dòng)劑)和CpG1668(Toll樣受體9激動(dòng)劑)生成，從而抑制NF-κB的激活[30]。此外，LUT還對(duì)乙?；?HAT)的活性有抑制作用，Kim等[31]發(fā)現(xiàn)LUT可通過(guò)干擾P300與TNF-α啟動(dòng)子區(qū)間的結(jié)合，減少HAT與NF-κB和TNF-α乙?；南嗷プ饔?，從而抑制NF-κB下游促炎因子轉(zhuǎn)錄。

3.3 調(diào)節(jié)炎癥小體

另一個(gè)與NF-κB通路相關(guān)的研究與NOD樣受體家族蛋白3(NOD-like receptor family protein 3，NLRP3)炎癥小體有關(guān)。NLRP3炎癥小體是一種存在于胞漿的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在受到刺激信號(hào)后，NLRP3炎癥小體首先進(jìn)入“啟動(dòng)階段”，TLR4信號(hào)通路被激活，NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)NLRP3、IL-18前體(pro-IL-18)和IL-1β前體(pro-IL-1β)大量轉(zhuǎn)錄。接著進(jìn)入“激活階段”，NLRP3通過(guò)凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)招募半胱天冬酶-1(Caspase-1)完成炎癥小體的組裝[32]。目前LUT在牙周炎[33]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[34]等多種動(dòng)物模型中均被證實(shí)有抑制NLRP3炎癥小體合成的作用。除了通過(guò)控制NF-κB通路減少炎癥小體生成之外，LUT還可直接阻斷ASC寡聚，下調(diào)炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)。Lee等[35]研究發(fā)現(xiàn)，LUT處理小鼠巨噬細(xì)胞30 min后，對(duì)NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β分泌有50%～60%的抑制作用，同時(shí)抑制Caspase-1活化，達(dá)到雙重抑制IL-1β、IL-18的作用。

4 LUT在動(dòng)物生產(chǎn)方面的應(yīng)用

自2006年歐盟全面禁止抗生素飼料以來(lái)，植物性飼料添加劑得到廣泛關(guān)注。LUT的抗氧化能力在畜禽生產(chǎn)應(yīng)用中有著重要意義。奶牛在圍產(chǎn)期會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，黃酮類化合物作為飼料添加劑被證實(shí)可以限制瘤胃酸中毒發(fā)生率，提高圍產(chǎn)期新陳代謝能力[36]。蛋雞經(jīng)過(guò)一段時(shí)間高產(chǎn)，體內(nèi)蓄積的自由基所產(chǎn)生的氧化反應(yīng)損傷會(huì)影響蛋雞生殖功能。楊慧等[37]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，在蛋雞產(chǎn)蛋后期的飼糧中添加富含LUT(10%)的花生殼提取物能顯著提高血清中的超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px活性，降低產(chǎn)蛋雞后期血清中的丙二醛含量，改善蛋雞后期的產(chǎn)蛋率和采食量，提高蛋雞生產(chǎn)性能。此外，LUT還能改善豬卵母細(xì)胞成熟、發(fā)育及受精能力。Park等[38]研究發(fā)現(xiàn)，體外補(bǔ)充LUT(5 μmol/L)可顯著恢復(fù)過(guò)氧化氫(H2O2)暴露引起的細(xì)胞器缺陷和氧化應(yīng)激損傷，并提高體外受精胚胎的卵裂率和囊胚形成率，改善豬胚胎體外發(fā)育能力。另有研究表明，LUT還可提高冷凍公豬精子質(zhì)量，補(bǔ)充LUT(80 μg/mL)后，公豬精子活力達(dá)55.70%，質(zhì)膜完整率達(dá)45.53%，頂體完整率為44.58%，顯著高于對(duì)照組[39]。這說(shuō)明LUT對(duì)豬卵母細(xì)胞和公豬精子發(fā)育均有積極影響。

此外，LUT還可作為植物防腐劑對(duì)肉類進(jìn)行保鮮，Mhalla等[40]將LUT作為天然植物防腐劑應(yīng)用于4 ℃貯藏30 d的牛肉末，發(fā)現(xiàn)該組分對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯特菌有顯著抑制作用。郝瑞等[41]將LUT作為天然保鮮劑成分對(duì)牛背最長(zhǎng)肌保鮮作用進(jìn)行研究證實(shí)，LUT與冰溫保鮮有協(xié)同作用，可將牛背最長(zhǎng)肌的貨架期延長(zhǎng)至16 d，比單一冰溫保鮮有更好的貯藏效果。

5 小 結(jié)

隨著對(duì)LUT的廣泛研究，越來(lái)越多的證據(jù)證明LUT在各類疾病模型中均有很好的治療效果，同時(shí)LUT也可作為優(yōu)質(zhì)飼料添加劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，有效提高動(dòng)物生產(chǎn)性能和抗應(yīng)激能力，還可作為母豬卵母細(xì)胞發(fā)育成熟和精子的保護(hù)劑。但是目前對(duì)于LUT在飼料應(yīng)用中的添加機(jī)制等研究還缺少相關(guān)數(shù)據(jù)，存在一定局限性，對(duì)投入實(shí)際應(yīng)用還有一定距離。因此，今后還需進(jìn)一步研究LUT作為飼料添加劑的作用效果和適宜添加量，完善LUT體內(nèi)外作用機(jī)制，為畜牧生產(chǎn)和新藥研究提供更多理論依據(jù)。