益生菌對斷奶仔豬腸道屏障功能影響的Meta分析

高靖春 曹舒婷 蔣宗勇 王 麗*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物科學研究所，農(nóng)業(yè)部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)重點實驗室，廣州510640；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院，廣州510225)

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中多采取早期斷奶的手段來適應集約化養(yǎng)殖，但該階段仔豬存在腸道免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全、腸道菌群不穩(wěn)定等因素，使斷奶仔豬易受到外界物理、生物等因素影響而引起腹瀉、生產(chǎn)性能下降，導致腸道屏障功能破壞、腸道通透性增加[1-3]。自我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部宣布禁抗后，探尋綠色安全、經(jīng)濟實惠又便于使用的抗生素替代物來緩解仔豬斷奶腹瀉成為了當前研究的重要方向[4-5]。益生菌制劑是公認的比較有效的抗生素替代物之一，是一類攝入足夠量時對宿主有益的活性微生物[6]。它可以黏附定植在腸道中構成微生物屏障，并逐漸形成穩(wěn)定的腸道微生物群落。益生菌群定植可以競爭性地抑制有害菌，維持腸道微生態(tài)平衡，而且益生菌及其代謝產(chǎn)物會影響機體消化酶的產(chǎn)生，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，進而提高動物的生產(chǎn)性能，因此益生菌被普遍地應用于畜牧生產(chǎn)中[7-8]。多項試驗表明，斷奶仔豬飼糧中添加益生菌可以降低腹瀉率，增加腸道有益菌群定植，提高緊密連接蛋白表達，抑制腸道炎癥發(fā)生，改善腸道屏障功能最終緩解腹瀉[9-11]。Meta分析是通過定量的方法對多個同類研究結果進行合并匯總，最大程度地利用前人發(fā)表的研究成果，通過適當?shù)臄?shù)學模型從統(tǒng)計學層面綜合地解決爭議和模糊性的結果，該分析可以實現(xiàn)增加樣本含量，提高檢驗效能的目的，使結果更具可信度[12-13]。由于益生菌種類繁多，添加量及添加方式各不相同，因此以Meta分析的形式進行統(tǒng)計分析是十分必要的。本研究以Meta分析為手段，針對腸道屏障相關指標及腹瀉率做出分析，探討益生菌對斷奶仔豬腹瀉及腸道屏障功能的影響。

1 材料與方法

1.1 檢索策略

計算機檢索中國知網(wǎng)、維普、Science Direct、Web of Science數(shù)據(jù)庫，檢索年限設定為從各數(shù)據(jù)庫建庫至2021年4月。中文關鍵詞包括：仔豬、斷奶仔豬、益生菌，英文關鍵詞包括：piglets、weaned piglets、probiotics，依據(jù)不同數(shù)據(jù)庫情況將關鍵詞進行自由組合檢索并收集全部相關文獻。

文獻納入標準：1)選擇已發(fā)表的隨機對照試驗且研究對象為健康斷奶仔豬；2)同時具備對照組及益生菌組的研究；3)設定結果指標為①腹瀉率；②空腸絨毛高度、隱窩深度、絨隱比；③回腸絨毛高度、隱窩深度、絨隱比；④腸道緊密連接蛋白表達，并給出指標的平均值、標準差或標準誤。

文獻排除標準：1)非試驗性文章(綜述、會議文章)、重復發(fā)表文獻；2)數(shù)據(jù)明顯有誤或數(shù)據(jù)不全等較低質(zhì)量文獻；3)無對照組文獻；4)試驗組非益生菌添加或與其他藥物、制劑聯(lián)合添加的文獻。

1.2 數(shù)據(jù)提取

全文閱讀后，提取以下數(shù)據(jù)材料進行后續(xù)試驗：1)文獻第一作者；2)試驗組樣本數(shù)、對照組樣本數(shù)；3)斷奶仔豬品種、試驗期；4)給藥途徑、益生菌類型、添加量(如研究中出現(xiàn)多個添加量則先進行數(shù)據(jù)合并，后續(xù)進行敏感性分析)；5)腸道緊密連接蛋白表達量、腸道絨毛高度及隱窩深度、腹瀉率。文獻中如有數(shù)據(jù)不全等相關問題通過電話及郵件聯(lián)系作者獲取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計方法

運用R 3.6.3與R Studio 1.2.1335進行相關數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及繪圖。由于不同研究中的研究時間、檢測方法、表達單位等方面存在差異，選擇標準化均數(shù)差(standard mean difference，SMD)作為效應指標。并結合Q檢驗(檢驗標準為α=0.1)，當P<0.1時表明研究存在異質(zhì)性，反之則具有同質(zhì)性。同時結合I2值(0～100%)對異質(zhì)性大小進行定量分析，I2值越大則表明研究間的異質(zhì)性越大。當I2值大于推薦標準40%時應采用隨機效應模型(randomized effect model)進行Meta分析。在95%置信區(qū)間(95% CI)的設定上，將0值作為無效值，當分析結果的95% CI跨越無效值時，則表示無法對該項研究做出定性結論結果分析。

1.4 文獻檢索與篩選

依據(jù)檢索式，檢索的文獻總計2 058篇，依據(jù)文獻標題及摘要排除研究對象非斷奶仔豬、綜述、非益生菌單獨干預文章總計1 778篇，依據(jù)試驗方法及文獻內(nèi)容排除無結局指標、與納入標準不符、非隨機對照試驗、無對照組文獻總計273篇，最終納入樣本文獻7篇。文獻篩選流程圖如圖1所示。

1.5 納入文獻基本特征

本次Meta分析納入樣本的研究對象均為斷奶仔豬，總計樣本量為720頭。試驗組為單一或混合益生菌添加，添加方式分別為飼糧添加及懸液灌服，對照組飼喂無添加基礎飼糧或灌服等量無菌水?；咎卣餍畔⒃斠姳?。

2 結果與分析

2.1 益生菌添加對斷奶仔豬腹瀉率影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻中，共有5篇報道，10項研究(共有研究對象432頭)報道了斷奶仔豬添加益生菌與腹瀉率的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為509.4，I2=98%，自由度(df)=9，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示，SMD=-15.15，95% CI為-21.55～-8.76，提示了腹瀉率與納入益生菌間具有相關性。其結果的森林圖如2-a所示。將各項研究一次性排除掉后應用Meta包中的Metainf命令做敏感性分析，排除各研究結果后的SMD及其95% CI匯總結果如圖2-b所示。根據(jù)程序結果顯示，納入的研究可能是異質(zhì)性的來源之一。若排除掉Li等[16]的異質(zhì)性較大的研究結果，余下研究合并在一起時其SMD值變?yōu)?11.904，95% CI為-17.93～5.88，此時仍表明腹瀉率與納入益生菌間具有相關性，表明本項結局指標結果較穩(wěn)健。因此，根據(jù)最終結果，試驗組腹瀉率低于對照組，結果顯示其SMD=-15.15，95% CI為-21.55～8.76。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗發(fā)表偏倚，并采用trim and filled模型進行校正。本研究中，在應用漏斗圖評價法時，所納入文獻的數(shù)量標準為≥8篇，其漏斗圖如圖2-c所示。從此漏斗圖可以看出，對此腹瀉率的Meta分析存在發(fā)表偏倚的可能性，采用Egger線性回歸法后，其P<0.05(t=-9.89,df=8,P<0.000 01)，驗證了存在發(fā)表偏倚。故采用剪補法評價其所帶來的影響，并作出校正后的漏斗圖，如圖2-d所示即調(diào)整發(fā)表偏倚后其SMD=-2.635 0，95% CI為-8.19～2.92(z=-0.93,P=0.352)。

2.2 益生菌添加對斷奶仔豬腸道緊密連接蛋白表達量影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻中，共有3篇報道，6項研究(共有研究對象608頭)報道了閉合蛋白(Occludin)的表達量與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為370.47，I2=99%，df=5，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示，SMD=2.59，95% CI為0.68～4.50，提示了Occludin的表達量與納入益生菌間具有相關性。其結果的森林圖如圖3-a所示。將各項研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結果后的SMD及其95% CI匯總結果如圖3-b所示。根據(jù)程序結果顯示，納入的研究可能是異質(zhì)性的來源之一。若排除掉Deng等[15]的異質(zhì)性較大的研究結果，其余各項研究合并在一起時其SMD值變?yōu)?.884，95% CI為-0.12～3.89。因此，根據(jù)最終結果，Occludin表達量與納入益生菌間具有相關性，其SMD=2.587，95% CI為0.67～4.50。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖3-c所示，其P=0.223 6，大于0.05(t=1.44,df=4)，表示不存在發(fā)表偏倚。

在納入的文獻中，共有3篇報道，6項研究(共有研究對象608頭)報道了閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)表達量與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為572.9，I2=99%，df=5，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示，SMD=20.83，95% CI為8.84～32.83，提示了ZO-1表達量與納入益生菌間具有相關性。其結果的森林圖如圖4-a所示。將各項研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結果后的SMD及其95% CI匯總結果如圖4-b所示。根據(jù)程序結果顯示，合并后的P<0.01，表明納入的研究并非是異質(zhì)性的來源之一。因此，根據(jù)最終結果，ZO-1表達量指標與納入益生菌間具有相關性，其SMD=20.834，95% CI為8.84～32.83。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖4-c所示，0.223 6

2.3 益生菌添加對斷奶仔豬腸道絨毛高度、隱窩深度及絨隱比影響的森林圖、敏感性分析及漏斗圖

在納入的文獻中，共有4篇報道，4項研究(共有研究對象200頭)報道了空腸腸道絨毛高度與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為94.79，I2=97%，df=3，P<0.01，其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示，SMD=15.22，95% CI為5.91～24.54，提示了空腸絨毛高度與納入益生菌間具有相關性。其結果的森林圖如5-a所示。將各項研究一次性排除掉后做敏感性分析，排除各研究結果后的SMD及其95% CI匯總結果如圖5-b所示。根據(jù)程序結果顯示，合并后的P<0.01，表明納入的研究并非是異質(zhì)性的來源之一。因此，根據(jù)最終結果，空腸絨毛高度與添加益生菌間具有相關性，其SMD=15.22，95% CI為5.91～24.54。采用Egger線性回歸法及漏斗圖法檢驗發(fā)表偏倚，漏斗圖如圖5-c所示，0.050 0

在納入的文獻中，共有4項研究(共有研究對象200頭)報道了空腸隱窩深度與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為346.82，I2=99%，自由度df=3，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示，SMD=-12.59，95% CI為-29.00～3.82，提示了空腸隱窩深度與納入益生菌間不具有相關性。其結果的森林圖如圖6-a所示。共有3項研究(共有研究對象180頭)報道了空腸絨隱比與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為299.55，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示SMD=26.62，95% CI為-5.06～58.31，提示了空腸絨隱比與納入益生菌間不具有相關性。其結果森林圖如圖6-b所示。共有3項研究(共有研究對象180頭)報道了回腸絨毛高度與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為332.78，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示SMD=10.59，95% CI為-25.50～46.68，提示回腸絨毛高度與納入益生菌間不具有相關性。其結果的森林圖如圖6-c所示。共有3項研究(共有研究對象180頭)報道了回腸隱窩深度與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為318.01，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示SMD=-5.80，95% CI為-25.30～13.70，提示回腸隱窩深度與納入益生菌間不具有相關性，這可能意味著益生菌不是隱窩深度改善的影響因素。其結果的森林圖如圖6-d所示；共有3項研究(共有研究對象180頭)報道了回腸隱窩深度與添加益生菌的關系。根據(jù)程序指令及顯示的結果，其Q值為252.65，I2=99%，df=2，P<0.01,其異質(zhì)性較大，因此應選擇隨機效應模型對效應值進行Meta分析，結果顯示SMD=-5.80，95% CI為-25.30～13.70，提示了回腸絨隱比與納入益生菌間不具有統(tǒng)計學相關性。其結果的森林圖如圖6-e所示。

3 討 論

斷奶仔豬腹瀉在生豬養(yǎng)殖過程中常有發(fā)生，引起斷奶仔豬腹瀉的原因有很多，可分為感染型(如病毒、細菌等病原體侵害引起的腹瀉)和非感染型(如環(huán)境、飼糧等突然改變導致的腹瀉)[21]，一直以來抗生素都作為緩解斷奶仔豬腹瀉的主要手段，抗生素濫用導致的藥物殘留、耐藥菌等問題嚴重影響畜牧業(yè)的健康發(fā)展，甚至威脅到食品安全和人類健康。國家自2020年起全面禁止畜牧行業(yè)飼用抗生素，這對仔豬健康養(yǎng)殖也提出了全新的挑戰(zhàn)。因此采用綠色安全、經(jīng)濟實惠又便于使用的營養(yǎng)手段來緩解斷奶仔豬腹瀉成為了重要的研究方向。益生菌制劑是公認的比較有效的抗生素替代物之一，是一類攝入足夠量時對宿主有益的活性微生物[22]。多項研究表明，添加益生菌能夠有效緩解斷奶仔豬腹瀉、提高斷奶仔豬生長性能，還可以改善由病原菌引發(fā)的腸道屏障功能破壞及炎癥反應，提高其緊密連接蛋白表達，緩解腸道通透性提高[23-25]。

小腸是機體主要的營養(yǎng)物質(zhì)吸收場所之一，腸道絨毛在腸腔內(nèi)處于不斷更新的狀態(tài)，腸道隱窩細胞的不斷分化促進著腸絨毛的更新，維持消化吸收功能的穩(wěn)態(tài)。腸道絨毛高度增高能夠增加腸道與營養(yǎng)物質(zhì)間的接觸面積，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收[26]。腸道上皮細胞由多種具備不同功能的細胞組成，共同構成了腸道物理屏障，其中緊密連接蛋白是調(diào)節(jié)這一屏障功能的重要組成部分，緊密連接蛋白表達量是衡量腸道屏障通透性的重要指標[27]。緊密連接蛋白表達量下降會引起腸道通透性增加，試驗證明部分益生菌產(chǎn)物可促進腸道上皮細胞合成緊密連接蛋白來減輕腸道炎癥、維護腸道屏障功能[28]，這與本研究結果相符合。腸道菌群構成了腸道微生物屏障，穩(wěn)定的腸道微生物屏障有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收及腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持。試驗表明添加益生菌可以有效提高斷奶仔豬腸道中有益菌豐度，抑制病原菌的定植，緩解病原微生物刺激下的腸道損傷，維護腸道健康[29-30]。除此之外益生菌還能夠通過維持腸道內(nèi)偏酸性的pH環(huán)境、刺激消化酶及免疫活性物質(zhì)的產(chǎn)生來影響消化吸收及腸道健康。這些都提示益生菌能保護腸道健康[31]，這與本研究中益生菌緩解了斷奶仔豬腹瀉的結果相吻合。

本研究表明，添加益生菌可以有效降低斷奶仔豬腹瀉率，提高空腸段緊密連接蛋白表達及空腸絨毛高度，但益生菌對空腸及回腸隱窩深度及絨隱比的影響并無統(tǒng)計學意義，該結論可為解決斷奶仔豬生產(chǎn)過程中的腸道健康問題提供參考依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性：1)納入研究樣本量較少；2)樣本間異質(zhì)性較大；3)各項研究之間的種系、飼糧配方、試驗周期、益生菌添加量及菌株種類等差異較大；4)缺少質(zhì)量評估標準，無法對試驗結果的科學性進行客觀驗證。這些都可能對結果產(chǎn)生影響，本研究也需要進一步開展大樣本、設計合理且周期足夠長的隨機對照試驗，進一步驗證研究結果。

4 結 論

本研究結果顯示，飼糧中添加益生菌總體上可以有效緩解斷奶仔豬腹瀉，顯著提高腸道緊密連接蛋白表達及空腸絨毛高度，這表明添加益生菌可以改善仔豬腸道健康、保護腸屏障功能。該Meta分析對國內(nèi)外相關文章的結果進行合并，從統(tǒng)計層面為益生菌對斷奶仔豬腹瀉及腸道屏障功能的影響給予一定的數(shù)據(jù)參考。