空懷綿羊糞便微生物和血液代謝組特征分析

丁鴻祥 龐麗燕 王 凈 劉 彥 王玉琴 馮 濤*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽(yáng)471023；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京100097；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院-美國(guó)俄克拉荷馬州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京100097；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070；5.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，張家口075000)

妊娠率是繁殖效率的主要影響因素之一，原因不明的空懷會(huì)導(dǎo)致妊娠率下降，顯著影響?zhàn)B羊效益。腸道微生物在宿主代謝、免疫、內(nèi)分泌等方面起著至關(guān)重要的作用，并且隨著環(huán)境、飲食、激素等因素變化而變化[1]，妊娠期間的微生物感染是不良妊娠結(jié)局的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[2]。血清代謝物分析能揭示妊娠相關(guān)的潛在代謝變化[3-4]，通過(guò)檢測(cè)母體血清代謝物的相對(duì)豐度，可以精準(zhǔn)地識(shí)別健康孕婦的胎齡[5]。妊娠是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，與激素變化、新陳代謝和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)有關(guān)，這些生理變化協(xié)同進(jìn)行，以維持胎兒的生長(zhǎng)和發(fā)育[6]。微生物與妊娠結(jié)局關(guān)系的報(bào)道多集中在陰道微生物組，未妊娠狀態(tài)下陰道微生物的物種數(shù)量顯著低于妊娠狀態(tài)[7]，不同妊娠狀態(tài)下門和屬細(xì)菌的相對(duì)豐度存在顯著差異[8]。相比正常女性的陰道微生物組，異常的陰道微生物組可能導(dǎo)致女性懷孕失敗[9]。例如缺乏乳酸桿菌可能增加細(xì)菌性陰道病的患病率[10]，增加早產(chǎn)和妊娠失敗的風(fēng)險(xiǎn)[11]。與陰道微生物群一樣，腸道微生物群也參與調(diào)控宿主的免疫和生理變化，這些變化對(duì)妊娠成功至關(guān)重要[12-14]。與未妊娠相比，妊娠會(huì)引起母體的代謝發(fā)生變化[15]。妊娠期糖代謝和脂代謝變化已經(jīng)被廣泛研究，有研究報(bào)道，妊娠會(huì)造成血液葡萄糖含量降低及低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯含量增加[16]。氨基酸是調(diào)節(jié)精子發(fā)生、卵子受精和胚胎著床等多種生理過(guò)程的信號(hào)分子[17]。Phillips等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與可育小母牛相比，不育小母牛血漿代謝物天冬酰胺、賴氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、色氨酸、半胱氨酸和鳥(niǎo)氨酸含量降低，這些代謝物可能作為預(yù)測(cè)生育能力的生物標(biāo)志物。微生物相對(duì)豐度和代謝物含量可能與妊娠生理狀態(tài)存在密切關(guān)系，綿羊上血清代謝物與妊娠結(jié)局關(guān)系的研究報(bào)道較少，腸道微生物影響綿羊妊娠的機(jī)制暫不清楚。因此，本研究采集自由交配后妊娠與空懷綿羊的糞便和血液樣本，通過(guò)分析不同妊娠狀態(tài)綿羊的腸道微生物和血清代謝物，以期初步揭示綿羊腸道微生物多樣性及血清代謝物與不同妊娠結(jié)局(妊娠與空懷)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)在河北省張家口市陽(yáng)原縣北京市農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地進(jìn)行，按照生產(chǎn)計(jì)劃，320只無(wú)病史、斷奶后2～4歲雜種母羊(中國(guó)美利奴公羊×小尾寒母羊)飼養(yǎng)在半開(kāi)放式羊舍，飼喂相同飼糧，自由飲水和添食舔磚。飼喂根據(jù)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)配制的全混合日糧，試驗(yàn)期間平均每只母羊飼喂量為2 kg/d，母羊集中斷奶后放公羊入群45 d(2個(gè)發(fā)情周期以上)，公母比例為1∶8，采用本交方式進(jìn)行配種，在撤出公羊后30 d使用B超儀(HS-1600V，Honda Electronics公司，日本)經(jīng)直腸進(jìn)行妊娠診斷。

1.2 超聲波直腸檢查法

在母羊妊娠早期，用7.5 MHz直腸探頭，根據(jù)B超圖像診斷卵巢、胎囊等器官，將母羊分為妊娠組(P組)和空懷組(C組)。從妊娠組和空懷組各隨機(jī)選取6只綿羊作為研究對(duì)象，所選取的母羊平均體重為(65.70±1.90) kg，胎次為2～3胎。

1.3 糞便標(biāo)本采集及微生物分析

1.3.1 糞便樣本采集

佩戴一次性PE手套，從6只妊娠母羊和6只空懷母羊直腸采集糞便，采集后更換手套，將新鮮糞便放入無(wú)菌離心管中液氮速凍后-80 ℃保存，用于后續(xù)測(cè)序分析。

1.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù)E.Z.N.A.?soil DNA Kit試劑盒說(shuō)明書提取12個(gè)樣本的微生物群落基因組DNA。提取的DNA用1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，使用分光光度計(jì)(NanoDrop-2000，Thermo Scientific公司，美國(guó))測(cè)定DNA濃度和純度。使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物、純化、檢測(cè)，并使用微型熒光計(jì)(QuantiFluor-ST，Promega公司，美國(guó))對(duì)其進(jìn)行定量。

1.3.3 Illumiana MiSeq測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

將純化后的PCR產(chǎn)物等摩爾混合，采用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina MiSeq PE 300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用Fastq軟件對(duì)原始序列質(zhì)檢，F(xiàn)LASH軟件拼接后，根據(jù)97%相似水平進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類，參照16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(Silva v138/16S_bacteria)對(duì)OTU序列分類注釋(分類置信度0.7)。數(shù)據(jù)分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)上進(jìn)行，由Mother軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson、Chao、Coverage和Ace指數(shù))。采用主坐標(biāo)分析(PCoA)方法分析糞便微生物群落組成的差異性或相似性，并用相似性分析(analysis of similarities，ANOSIM)進(jìn)行OTU數(shù)量的組間差異檢驗(yàn)。采用Studentt檢驗(yàn)法分析2組間微生物門水平上的差異顯著性。使用線性判別分析的影響大小(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)對(duì)2組樣本進(jìn)行線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)，在屬水平上鑒定差異微生物。所有分析結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 血清樣本采集及代謝組學(xué)分析

1.4.1 血清樣本采集

對(duì)采集糞樣的母羊進(jìn)行頸靜脈采血，血樣在真空促凝管中室溫靜置4 h后，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)分離血清，-80 ℃保存，用于后續(xù)檢測(cè)分析。

1.4.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)檢測(cè)

取100 μL血清加入提取液(甲醇∶水=4∶1)，-10 ℃沉淀后，使用冷凍研磨儀(Wonbio-96c，上海萬(wàn)柏生物科技有限公司)將其粉碎，超聲處理30 min(5 ℃，40 kHz)，樣品經(jīng)放置沉淀蛋白后離心，將上清液轉(zhuǎn)移到樣品瓶中進(jìn)行LC-MS/MS分析，樣品經(jīng)超高效液相色譜系統(tǒng)(ACQUITY UPLC HSS T3，Waters公司，美國(guó))分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，流動(dòng)相A為水/乙腈(體積比19∶1，含0.1%甲酸)，流動(dòng)相B為乙腈/異丙醇(體積比1∶1，含0.1%甲酸)。采用離子噴霧電壓和正負(fù)離子掃描模式采集樣品的質(zhì)譜信號(hào)。為保證分析結(jié)果可靠性，將質(zhì)控樣本與所測(cè)樣本混合分析。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Progenesis QI 2.3軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰值校準(zhǔn)和檢測(cè)，生成的數(shù)據(jù)矩陣中，只保留任意一組80%以上非零值的變量，對(duì)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換生成最終數(shù)據(jù)矩陣，將質(zhì)譜信息與代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB(http://www.hmdb.ca/)和Metlin(https://metlin.scripps.edu/)匹配。數(shù)據(jù)分析在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司云平臺(tái)進(jìn)行。使用R軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)。在OPLS-DA模型中計(jì)算投影變量重要性(VIP)值，使用R2Y和Q2評(píng)價(jià)OPLS-DA模型的有效性，結(jié)合Studentt檢驗(yàn)法篩選出組間差異代謝物(P<0.05，VIP值>1)，并繪制差異火山圖。對(duì)組間差異代謝物映射到KEGG通路上，并進(jìn)行通路富集分析，使用Scipy v 1.0.0軟件精確檢驗(yàn)顯著富集的通路(P<0.05)。

1.5 微生物與代謝組聯(lián)合分析

利用Python軟件對(duì)差異代謝物和差異微生物進(jìn)行PCoA和普氏分析(Procrustes analysis)，分析差異代謝物和差異微生物之間的相似和變異情況，使用R語(yǔ)言包(ggplot2)可視化作圖。利用R語(yǔ)言包(psych、caret)計(jì)算差異代謝物和屬水平的差異微生物的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient)和P值，并構(gòu)建相關(guān)性熱圖。

2 結(jié) 果

2.1 妊娠診斷

應(yīng)用直腸B超可準(zhǔn)確區(qū)分妊娠與空懷母羊，妊娠母羊B超圖像中緊挨膀胱的微亮區(qū)域?yàn)樵心仪忻?，孕囊?nèi)有一較強(qiáng)的回聲區(qū)域(圖1-A)；空懷母羊沒(méi)有看到孕囊結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)卵泡(清晰的無(wú)回聲圓形結(jié)構(gòu))(圖1-B)。

A：妊娠組，箭頭所指為孕囊；B：空懷組，星號(hào)為卵泡。

2.2 16S rRNA測(cè)序結(jié)果

在對(duì)12個(gè)樣本質(zhì)控過(guò)濾后共獲得556 983條高質(zhì)量序列，其中，最小長(zhǎng)度為213 bp，最大長(zhǎng)度為511 bp，平均長(zhǎng)度為413 bp。根據(jù)97%相似性的閾值，將序列聚類為2 222個(gè)OTU，每個(gè)樣本OTU數(shù)量在1 105～1 392個(gè)。

2.3 糞便微生物群落豐富度和多樣性

使用Chao、Ace、Shannon、Simpson和Coverage指數(shù)來(lái)估計(jì)糞便微生物群落的豐富度和多樣性。由表1可知，與妊娠組相比，空懷組的Shannon指數(shù)顯著降低(P<0.05)，而Chao、Ace、Coverage和Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表1 α多樣性指數(shù)分析

2.4 糞便微生物群落組成分析

由表2可知，在門水平上，相對(duì)豐度≥1%的優(yōu)勢(shì)菌群在妊娠組和空懷組分別有6和4個(gè)。其中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidota)是妊娠組和空懷組母羊糞便微生物群落中共有優(yōu)勢(shì)菌群，二者相對(duì)豐度之和分別為90%和92%；其他菌群相對(duì)豐度較低，妊娠組螺旋菌門(Spirochaetota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)、Patescibacteria和放線菌門(Actinobacteriota)相對(duì)豐度分別為3.74%、2.56%、1.04%和1.00%，空懷組螺旋菌門和疣微菌門相對(duì)豐度分別為3.41%、1.13%。其中，妊娠組放線菌門相對(duì)豐度顯著高于空懷組(P<0.05)。

表2 門水平下的優(yōu)勢(shì)菌群分布

在妊娠組和空懷組共檢出2 222個(gè)OTU，2組共有的OTU有1 835個(gè)，妊娠組特有的OTU有212個(gè)，空懷組特有的OTU有205個(gè)(圖2-A)。OTU分類分析中相對(duì)豐度前30菌屬的熱圖見(jiàn)圖2-B，在屬水平上，UCG-005(10.70%)、克里斯滕菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)(7.39%)、理研菌科RC9腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)(6.54%)和擬桿菌屬(Bacteroides)(4.97%)依次是妊娠組中相對(duì)豐度前4的菌屬；UCG-005(9.64%)、克里斯滕菌科R-7群(8.87%)、理研菌科RC9腸道群(6.76%)和擬桿菌屬(6.24%)依次是空懷組中相對(duì)豐度前4的菌屬。

Treponema：密螺旋體屬；Alistipes：阿利斯泰伯屬；Monoglobus：?jiǎn)吻蛳x屬；Norank_f_Eubacterium_coprostanoligenes_group：未分類的糞真桿菌群；Bacteroides：擬桿菌屬；Norank_f_UCG-010：未分類的UCG-010科；Unclassified_f_Lachnospiraceae：未分類的毛螺菌科；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科_RC9_腸道群；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕菌科_R-7群；Turicibacter：尿道桿菌屬；Norank_f_p-251-o 5：未分類的p-251-o5科；Norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014：未分類的未分類科_梭狀芽孢桿菌目_UCG-014；Lachnospiraceae_AC2044_group：毛螺菌科_AC2044群；Prevotellaceae_UCG-003：普氏菌科_UCG-003；Norank_f_F082：未分類的F082科；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；NK4A214_group：NK4A214群；Norank_f_Ruminococcaceae：未分類的瘤胃球菌科；Norank_f_Bacteroidales_RF16_group：未分類的擬桿菌目_RF16群；Prevotella：普氏菌屬；Prevotellaceae_UCG-004：普氏菌科_UCG-004；Candidatus_Saccharimonas：糖單胞菌屬；Family_ⅩⅢ_AD3011_group：ⅩⅢ科_AD3011群；Norank_f_norank_o_Bacteroidales：未分類的未分類科擬桿菌；Unclassified_c_Clostridia：未分類的梭狀芽孢桿菌綱。

2.5 糞便微生物組成差異分析

基于bray-curtis算法的PCoA顯示，在屬水平上，大多數(shù)樣本與同一組的其他樣本聚在一起，妊娠組與空懷組樣品明顯分開(kāi)(圖3-A)，ANOSIM表明妊娠組與空懷組屬水平菌群組成差異顯著(P<0.05)。在屬水平進(jìn)行LEfSe多級(jí)差異物種判別分析，篩選出LDA值大于2.5的屬水平菌群，其中妊娠組具有顯著作用的菌屬有12個(gè)，包括瘤胃梭菌屬(Ruminiclostridium)、琥珀酸菌屬(Succiniclasticum)、Saccharofermentans等；空懷組具有顯著作用的菌屬有4個(gè)，包括Turicibacter、UCG-002、Romboutsia和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)(圖3-B)。

Eubacterium_siraeum_group：惰性真桿菌群；Eubacterium_brachy_group：短優(yōu)桿菌群；Succiniclasticum：琥珀酸菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Corynebacterium：棒狀桿菌屬；Norank_f_UCG-011：未分類的UCG-011科；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Norank_f_Oscillospiraceae：未分類的顫螺菌科；Norank_f_norank_o_RF39：未分類的科_未分類RF39目；Eubacterium_nodatum_group：纏結(jié)真桿菌群；Saccharofermentans：產(chǎn)乙酸糖發(fā)酵菌屬。

2.6 母羊血清差異代謝物分析

對(duì)差異代謝物進(jìn)行PCA，主成分1和主成分2對(duì)樣本差異貢獻(xiàn)值分別為25.90%和17.20%，2組樣品明顯分開(kāi)(圖4-A)。去除與分組無(wú)關(guān)的信息，通過(guò)OPLS-DA進(jìn)一步分析，妊娠組與空懷組各組樣品很好地聚集在一起并且完全分開(kāi)(圖4-B)，OPLS-DA模型的R2Y和Q2的累計(jì)值(cumulative values)均大于0.5，表明OPLS-DA具有良好的預(yù)測(cè)能力(圖4-C)。妊娠組與空懷組之間共發(fā)現(xiàn)78種血清差異代謝物，其中58種差異代謝物表達(dá)上調(diào)，20種差異代謝物表達(dá)下調(diào)(圖4-D)。

A：PCA；B：OPLS-DA；C：OPLS-DA模型驗(yàn)證，R2Y表示對(duì)Y矩陣解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力，R2Y和Q2越接近1表示模型越可靠；D：差異代謝物火山圖。

如圖5所示，根據(jù)HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)，共有66個(gè)差異代謝物被標(biāo)注為8個(gè)超類(圖5-A)，脂質(zhì)和類脂分子28個(gè)、有機(jī)酸及衍生物12個(gè)、有機(jī)氧化合物9個(gè)、有機(jī)雜環(huán)化合物8個(gè)、核苷和核苷酸類似物4個(gè)、苯環(huán)型化合物2個(gè)、糖類多酮類化合物2個(gè)和有機(jī)硫化合物1個(gè)。差異代謝物的聚類熱圖(圖5-B)顯示了VIP值前30的差異代謝物表達(dá)譜和VIP值，可以看出代謝物被分為上下2個(gè)群集，上群集代謝物中LysoPC(O-18∶0)含量在空懷組極顯著上調(diào)(P<0.01)；下群集代謝物中脫氧肌苷(deoxyinosine)含量在空懷組顯著下調(diào)(P<0.05)，berteroin和C16二氫(神經(jīng))鞘氨醇(C16 sphinganine)含量在空懷組極顯著下調(diào)(P<0.01)。

A：HMBD超類化合物餅圖 HMBD superclass pie chart。Organosulfur compounds：有機(jī)硫化合物；Phenylpropanoids and polyketides：糖類多酮類化合物；Benzenoids；苯環(huán)型化合物；Nucleosides, nucleotides and analogues：核苷和核苷酸類似物；Organoheterocyclic compounds：有機(jī)雜環(huán)化合物；Organic oxygen compounds：有機(jī)氧化合物；Organic acids and derivatives：有機(jī)酸及衍生物；Lipids and lipid-like molecules；脂質(zhì)和類脂分子。

差異代謝物在11條KEGG通路上顯著富集(P<0.05)，分別是哮喘、醚類脂代謝、礦物質(zhì)吸收、β-丙氨酸代謝、十字孢堿生物合成、苯丙氨酸代謝、氨基酰-tRNA生物合成、蛋白質(zhì)消化吸收、癌癥中的膽堿代謝、癌癥中的中心碳代謝和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(圖6)。

Central carbon metabolism in cancer：癌癥中的中心碳代謝；Protein digestion and absorption；蛋白質(zhì)消化吸收；Aminoacyl-tRNA biosynthesis：氨基酰-tRNA生物合成；ABC transporters：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；Ether lipid metabolism：醚類脂代謝；Mineral absorption：礦物質(zhì)吸收；Beta-alanine metabolism：β-丙氨酸代謝；Staurosporine biosynthesis：十字孢堿生物合成；Asthma：哮喘；Phenylalanine metabolism：苯丙氨酸代謝；Choline metabolism in cancer：癌癥中的膽堿代謝。

2.7 關(guān)聯(lián)性分析

普氏分析將微生物和代謝物PCoA排序構(gòu)型連接起來(lái)，分析結(jié)果顯示妊娠組與空懷組樣本的微生物組學(xué)相對(duì)豐度和代謝組學(xué)表達(dá)量趨勢(shì)顯著一致(P<0.05)(圖7-A)。為近一步挖掘在微生物多樣性和代謝組分析結(jié)果中差異菌群(屬水平)和差異代謝物之間的關(guān)系，采用皮爾遜分析2組的相關(guān)性關(guān)系，對(duì)具有顯著相關(guān)性關(guān)系的微生物和代謝物建立熱圖，圖中共包含有22種代謝物和14種微生物。微生物被分為2個(gè)群集(上和下)，代謝物被分為2個(gè)群集(左和右)(圖7-B)。圖中上群集微生物都在妊娠組顯著上調(diào)并且?guī)缀醵紝儆诤癖诰T，這些菌屬與左群集代謝物呈正相關(guān)，提示這些菌屬和代謝物可能與成功妊娠相關(guān)；下群集微生物中脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)在空懷組中顯著上調(diào)，并且和3a，7a，12b-三羥基-5b-膽烷酸(3a,7a,12b-trihydroxy-5b-cholanoic acid)含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，提示這些菌屬和代謝物可能與空懷相關(guān)。對(duì)相關(guān)性熱圖分析表明血清代謝物和腸道微生物的相互作用能夠影響母羊妊娠。

Actinobacteriota：放線菌門；Bacteroidota：擬桿菌門；Desulfobacterota：脫硫菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Syntrophococcus：同性球菌屬；Norank_f_Eggerthellaceae：未分類的伊格爾茲氏菌科；Lachnospiraceae_NK3A20_group：毛螺菌科_NNK3A20群；Erysipelatoclostridium：丹毒梭菌屬；Beta1-chaconine：Beta1-查茄堿；Lucyoside R：絲瓜皂甙R；Muricin H：木犀草素H；N-Acetyl-D-phenylalanine：N-乙酰-D-苯丙氨酸；(9Z,11R,12S,13S,15Z)-12,13-Epoxy-11-hydroxy-9,15-octadecadienoic acid：(9Z，11R，12S，13S，15Z)-12，13-環(huán)氧-11-羥基-9，15-十八二烯酸；2-Methylbutyrylglycine：2-甲基丁酰甘氨酸；Flunisolide：氟尼縮松；N-undecylbenzenesulfonic acid：N-十一烷基苯磺酸；Taurochenodeoxycholate-3-sulfate：?；蛆Z去氧膽酸鹽-3-硫酸鹽；(-)-erythro-anethole glycol 1-glucoside：(-)-紅-茴香腦二醇1-葡萄糖苷；Annosquamosin B：番紅花素B；3-beta-hydroxy-4-beta-methyl-5-alpha-cholest-7-ene-4-alpha-carboxylate：3-β-羥基4β-甲基5-α-膽甾-7-烯-4-α-羧酸鹽；D-Pipecolic acid：D-哌啶酸；Gymnodimine：環(huán)亞胺毒素；LysoPC(22∶2(13Z,16Z))：LysoPC(22∶2(13Z,16Z))；L-histidine：L-組氨酸；Tyramine glucuronide：酪胺葡萄糖醛酸苷；DL-2-hydroxy stearic acid：DL-2-羥基硬脂酸；Benzene and substituted derivatives：苯和取代衍生物；Benzopyrans：苯駢吡喃類；Carboxylic acids and derivatives：羧酸及衍生物；Fatty Acyls：脂肪?；?；Glycerophospholipids：甘油磷脂；Naphthopyrans：萘并吡喃；Organooxygen compounds：有機(jī)氧化合物；Other：其他；Prenol lipids：異戊二烯脂類；Pyridines and derivatives：吡啶及衍生物；Steroids and steroid derivatives：甾體和甾體衍生物；Tannins：鞣質(zhì)。

3 討 論

3.1 母羊妊娠與糞便微生物的關(guān)系

腸道微生物影響宿主的生長(zhǎng)、新陳代謝和免疫功能，宿主腸道微生物的組成不但與宿主本身遺傳有關(guān)，還受到環(huán)境的影響[19-20]。糞便微生物可以反映腸道微生物的組成，并且越來(lái)越多研究者通過(guò)新鮮糞便微生物組成來(lái)研究腸道微生物區(qū)系[21-23]。妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，母體會(huì)發(fā)生一系列變化，包括激素水平、新陳代謝和腸道黏膜免疫。本研究中，妊娠組和空懷組母羊糞便微生物結(jié)構(gòu)與相對(duì)豐度存在明顯變化。有研究報(bào)道，不孕與健康女性的子宮[24]、陰道[25-26]微生物結(jié)構(gòu)組成存在顯著差異，而關(guān)于腸道微生物的研究報(bào)道較少。本研究中，與妊娠組相比，空懷組母羊糞便微生物的α多樣性指數(shù)有所降低，這與Komiya等[27]研究結(jié)果相似，其中Shannon指數(shù)顯著降低。α多樣性指數(shù)可以反映微生物群落的穩(wěn)定性和功能，并且已有報(bào)道提議其作為一種健康指標(biāo)[28]，推測(cè)低多樣性的腸道微生物可能不利于母體維持妊娠穩(wěn)態(tài)，這需要進(jìn)一步研究論證。

本研究表明，妊娠組和空懷組母羊微生物相對(duì)豐度存在差異。在門水平上，與妊娠組相比，空懷組母羊糞便放線菌門相對(duì)豐度顯著減少。子宮內(nèi)膜容受性和胚胎著床是妊娠2個(gè)主要過(guò)程，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在這2個(gè)過(guò)程中都發(fā)揮重要作用[29]，其可以抑制母體對(duì)胎兒的免疫反應(yīng)，如果調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量缺少會(huì)導(dǎo)致子宮炎癥和纖維化，可能導(dǎo)致胚胎著床失敗[30]。放線菌門可以增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，并且可以通過(guò)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)免疫炎癥和免疫反應(yīng)，減少炎癥因子釋放，避免過(guò)度炎癥[31]。此外，放線菌門還與短鏈脂肪酸(SCFA)的產(chǎn)量增加有關(guān)[32]，SCFA參與維持妊娠期的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和能量平衡[33]，這對(duì)發(fā)育中的胎兒和母體的健康至關(guān)重要[34]。推測(cè)放線菌門的減少可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量和脂質(zhì)代謝變化相關(guān)，導(dǎo)致母羊空懷。

屬水平LDA表明瘤胃梭菌屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、脫硫弧菌屬和Turicibacter是妊娠和空懷母羊的差異微生物。瘤胃梭菌屬在妊娠組中顯著富集，瘤胃梭菌屬的纖維素分解功能已經(jīng)被廣泛研究，直到近幾年，瘤胃梭菌屬對(duì)宿主生理的影響才被廣泛報(bào)道[35]。Song等[36]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃梭菌屬與血脂、血糖水平呈顯著負(fù)相關(guān)。雖然脂質(zhì)和葡萄糖可以給母羊和胎兒提供營(yíng)養(yǎng)，滿足胚胎植入和胎兒發(fā)育需要的大量能量[37-38]，但是也有研究表明，脂質(zhì)代謝和葡萄糖代謝出現(xiàn)紊亂，可能會(huì)影響妊娠率[39-40]。所以推測(cè)瘤胃梭菌屬可能通過(guò)參與調(diào)解血脂、血糖的穩(wěn)態(tài)，影響到母羊的早期妊娠發(fā)育。炎癥及其引起的氧化應(yīng)激可以影響受精和卵母細(xì)胞正常發(fā)育[41]，且炎癥或炎癥介質(zhì)引起的類固醇合成改變導(dǎo)致子宮受損，繼而影響妊娠的建立和維持[42]。棒狀桿菌屬與腸道通透性和炎癥呈負(fù)相關(guān)，而脫硫弧菌屬能夠產(chǎn)生脂多糖誘發(fā)腸道炎癥[43]。有研究表明，在妊娠早期腸道通透性的增加與脂多糖含量升高相關(guān)，會(huì)增加妊娠失敗的風(fēng)險(xiǎn)[44]。Turicibacter是空懷組中對(duì)組間相對(duì)豐度差異影響最大的菌屬，Shang等[45]通過(guò)建立葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)Turicibacter是結(jié)腸炎中的靶標(biāo)微生物，而且與炎癥呈正向相關(guān)。還有研究證明，孕婦妊娠期Turicibacter相對(duì)豐度的增加與肝內(nèi)膽汁淤積癥有關(guān)，可能導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[46]。本研究中，與妊娠組相比，空懷組糞便脫硫弧菌屬和Turicibacter相對(duì)豐度顯著增加，棒狀桿菌屬相對(duì)豐度顯著減少，所以推測(cè)這些微生物導(dǎo)致的異常炎癥反應(yīng)可能與綿羊的空懷有關(guān)，需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2 母羊妊娠與血清代謝物的關(guān)系

為了研究母羊空懷生理狀態(tài)下血清代謝組的變化特征，通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)了妊娠組與空懷組間存在78種差異代謝物，這些代謝物被分類為脂質(zhì)和類脂分子、有機(jī)酸及衍生物、有機(jī)氧化合物、有機(jī)雜環(huán)化合物、核苷和核苷酸類似物、苯環(huán)型化合物、糖類多酮類化合物和有機(jī)硫化合物?；贠PLS-DA計(jì)算VIP值，并根據(jù)VIP值大小排列的前30種差異代謝物(VIP值>1，P<0.05)，有可能是母羊妊娠潛在的生物標(biāo)志物。

溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholines，LysoPC)是磷脂酰膽堿(phosphatidylcholines，PC)通過(guò)磷脂酶A2水解的產(chǎn)物[47]，有研究報(bào)道，在體外受精流產(chǎn)組孕婦的卵泡液中LysoPC相對(duì)豐度顯著升高。在本研究中，LysoPC(O-18∶0)相對(duì)豐度在空懷組中增加，并且顯著富集在醚脂代謝通路，提示脂質(zhì)代謝異?？赡苁菍?dǎo)致空懷的原因之一。此外，LysoPC(O-18∶0)相對(duì)豐度的增加可能與氧化應(yīng)激相關(guān)[47-48]。氧化應(yīng)激會(huì)影響胎盤發(fā)育[49]和成功受精[41]，是女性不孕癥發(fā)病的因素之一[50-51]。

本研究中脫氧肌苷含量在空懷組中顯著減少，KEGG分析結(jié)果表明脫氧肌苷顯著富集于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通路，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體是胎盤屏障功能和關(guān)鍵生殖過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子[52]，其利用ATP水解參與運(yùn)輸多種底物(類固醇激素、膽固醇和細(xì)胞因子等)，而這些底物都參與胚胎植入、胎盤發(fā)育等過(guò)程[53]。Gao等[54]研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充外源性核苷酸可能通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(mammalian target of rapamycin-peroxisome proliferators-activated receptors，mTORC1-PPARs)通路調(diào)節(jié)胎盤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，脫氧肌苷的增加能提供更多的能量[55]，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育[56]。研究結(jié)果提示脫氧肌苷含量減少可能與母羊空懷相關(guān)。

本研究中berteroin含量在空懷組中顯著下調(diào)，研究表明，berteroin具有很強(qiáng)的抗炎活性，并能抑制巨噬細(xì)胞M1標(biāo)志物(CD80和CD86)的表達(dá)和促炎介質(zhì)(一氧化氮和前列腺素E2)、促炎細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子和白細(xì)胞介素)的分泌[57]。成功妊娠需要促炎因子與抗炎因子的平衡，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致妊娠失敗[58-59]，與能正常繁殖的綿羊相比，受孕失敗綿羊的血清中炎癥因子含量顯著升高[60]。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)Berteroin可能通過(guò)調(diào)節(jié)母羊的炎癥因子平衡發(fā)揮促進(jìn)妊娠建立和維持的作用。

3.3 微生物組與代謝組學(xué)聯(lián)合分析

本研究中，妊娠組與空懷組母羊差異糞便微生物相對(duì)豐度和血清代謝物表達(dá)量趨勢(shì)一致。其中C16-鞘氨醇(C16-sphinganine)含量在妊娠組顯著增加，C16-鞘氨醇屬于鞘脂，鞘脂是真核細(xì)胞膜的普遍組成部分，可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和存活等多種細(xì)胞過(guò)程[61]。通過(guò)聯(lián)合分析熱圖發(fā)現(xiàn)與C16-鞘氨醇含量顯著相關(guān)的腸道菌群屬大多數(shù)是厚壁菌門。厚壁菌門是空懷組和妊娠組的共同優(yōu)勢(shì)菌群，且不存在顯著差異，這與前人研究結(jié)果[62]一致。Sun等[63]研究發(fā)現(xiàn)，假腸膜明串珠菌飲食干預(yù)組相比高脂飲食組，肝臟C16-鞘氨醇含量升高，腸道微生物與肝臟代謝物的相關(guān)性分析表明厚壁菌門相對(duì)豐度與C16-鞘氨醇含量呈負(fù)相關(guān)。而在本研究中，血清C16-鞘氨醇含量與厚壁菌門相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，可能與不同的飼料組成和生理狀態(tài)等有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

本研究中，空懷組糞便脫硫弧菌屬相對(duì)豐度顯著增加，在聯(lián)合分析中與脫硫弧菌屬相對(duì)豐度顯著負(fù)相關(guān)的代謝物大部分是脂質(zhì)。脫硫弧菌能通過(guò)增強(qiáng)CD36表達(dá)來(lái)上調(diào)宿主對(duì)腸道內(nèi)脂質(zhì)的吸收[64]，空懷組的脫硫弧菌屬相對(duì)豐度增加可能與脂質(zhì)代謝有關(guān)；此外脫硫弧菌屬還能促進(jìn)炎癥反應(yīng)[65]，Yi等[66]研究表明，與正常組相比，孕婦流產(chǎn)組血清炎癥因子含量顯著增加，且血清3a,7a,12b-三羥基-5b-膽烷酸含量顯著增加。本研究中，血清3a,7a,12b-三羥基-5b-膽烷酸含量與脫硫弧菌屬相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，基于這些結(jié)果推測(cè)3a,7a,12b-三羥基-5b-膽烷酸與脫硫弧菌屬可能通過(guò)增加炎癥反應(yīng)共同導(dǎo)致母羊的空懷。

4 結(jié) 論

與妊娠組相比，空懷組母羊糞便菌群組成和血清代謝物發(fā)生了明顯改變，差異菌群(屬水平)和差異代謝物之間的相互作用也是影響母羊妊娠與否的因素之一。