中精粗比飼糧條件下中鏈脂肪酸對肉牛體外瘤胃發(fā)酵的影響

欒嘉明 楊東旭 馮 鑫 楊 濛 周金影 金英海,2 張 敏,2 耿春銀,2*

(1. 延邊大學農學院，延吉133000；2.延邊大學東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，延吉133002)

中鏈脂肪酸(MCFAs)是含有6～12個碳原子數的脂肪酸，主要包括辛酸(C8)、癸酸(C10)和月桂酸(C12)。MCFAs具有易消化、易吸收、抗菌、抗病毒、用于體內饑餓素?；徒档图淄楫a量等特殊的生理功能[1-4]。目前，有關MCFAs的研究報道多集中在豬、雞和羊上[5-7]，在肉牛中的報道相對較少。同時，研究表明，MCFAs在動物生產中的應用效果可能與其種類、添加量和飼糧的類型有關[8]。因此，明確特定飼糧條件下不同種類MCFAs的添加量和效果，對其合理應用具有重要意義。本研究采用體外瘤胃產氣量法對MCFAs的效果進行了評價，揭示不同添加量、不同種類的MCFAs對50∶50精粗比飼糧體外瘤胃發(fā)酵的影響，旨在為MCFAs種類及添加量的選擇及后續(xù)的相關研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 MCFAs

未酯化辛酸，分子式為C8H16O2，無色油狀液體[購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，純度≥99%]；未酯化癸酸，分子式為C10H20O2，白色結晶[購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，純度≥99.5%]；未酯化月桂酸，分子式為C12H24O2，白色針狀晶體[購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，純度≥99%]。

1.1.2 發(fā)酵底物

發(fā)酵底物為全價混合日糧(精粗比50∶50)，參考中國《肉牛飼養(yǎng)標準》[9]配制肉?；A飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。發(fā)酵底物經干燥，粉碎至80目備用。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

續(xù)表1項目 Items含量 Content粗灰分 Ash5.19鈣 Ca0.68磷 P0.30

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物及飼養(yǎng)管理

瘤胃液供體牛為3頭體重500 kg左右、安裝有永久性瘤胃瘺管的健康延邊黃牛。瘺管牛在采集瘤胃液前預飼2周，飼糧成分與試驗底物飼糧成分相同。瘺管牛每日飼喂2次(08：00和17：00)，自由飲水。

1.2.2 試驗設計

體外產氣試驗：采用單因素試驗設計，以粉碎為80目的基礎飼糧200 mg為發(fā)酵底物，然后分別添加0(對照組)、0.2%(T1)、0.8%(T2)、1.2%(T3)、2.0%(T4)(干物質基礎)的辛酸、癸酸和月桂酸。每個MCFAs有5組，每組有3個平行。發(fā)酵48 h時終止發(fā)酵，測定產氣參數及發(fā)酵參數等指標，發(fā)酵期間記錄各組產氣量變化情況。

體外消化試驗：與體外產氣試驗相似，采用單因素試驗設計，以粉碎為80目的基礎飼糧1 g為發(fā)酵底物，然后分別添加0(對照組)、0.2%(T1)、0.8%(T2)、1.2%(T3)、2.0%(T4)(干物質基礎)的辛酸、癸酸和月桂酸。每個MCFAs有5組，每組有3個平行。發(fā)酵48 h時終止發(fā)酵，進行體外消化率指標的測定。

1.2.3 瘤胃液體外發(fā)酵

體外發(fā)酵采用Menke等[10]體外發(fā)酵法進行。在晨飼前采集3頭瘺管牛的瘤胃液，混勻后用4層紗布過濾，在39 ℃培養(yǎng)液分裝系統(tǒng)中預熱并與經CO2飽和的人工唾液以1∶2的比例混合，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液，同時通入二氧化碳(CO2)。

體外產氣試驗：試驗前1晚將200 mg發(fā)酵底物稱好后裝入人工瘤胃培養(yǎng)管中，用自動分液器向提前39 ℃預熱的(最小刻度1 mL)人工瘤胃培養(yǎng)管中加入30 mL混合人工瘤胃培養(yǎng)液，混勻后讀取刻度，然后迅速放入已預熱(39 ℃)的恒溫水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

體外消化試驗：試驗前1晚將1 g發(fā)酵底物稱好后倒入纖維濾袋中用封口機封口并裝入體外消化率培養(yǎng)管中，用自動分液器向提前39 ℃預熱的體外消化率培養(yǎng)管中加入70 mL混合人工瘤胃培養(yǎng)液，混勻后迅速放入已預熱(39 ℃)的恒溫水浴培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 測定指標

1.3.1 凈產氣量及產氣參數

當培養(yǎng)至2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48 h時，取出人工瘤胃培養(yǎng)管并對活塞底部與培養(yǎng)管刻度重疊處的刻度值(mL)進行記錄，計算各時間段的凈產氣量。

凈產氣量(mL)=某時間段產氣量(mL)-該時間段空白產氣量(mL)。

根據France等[11]和?rskov等[12]提出的產氣模型：

Y=b×[1-e-(t-L)]；
Y=b×[1-e-ct]。

式中：Y為發(fā)酵底物在t時間點的產氣量(mL)；b為潛在產氣量(mL)；c為發(fā)酵底物產氣速度(mL/h)；t為培養(yǎng)時間(h)；L為產氣延滯時間(h)。利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件中非線性(nonlinear)回歸程序進行產氣參數估算。

1.3.2 發(fā)酵48 h甲烷產量

在發(fā)酵48 h后，將培養(yǎng)管放入冰水浴中終止發(fā)酵，立即采集發(fā)酵氣體。利用氣相色譜儀測定氣體中甲烷的含量[13]。

1.3.3 瘤胃原蟲計數

計數前先配制好染色液即MFS溶液(35%福爾馬林100 mL，NaCl 8 g，甲基綠 0.6 g，用蒸餾水定容至1 000 mL)。取48 h發(fā)酵后的瘤胃液濾液1 mL加入MFS染色液1 mL混勻，用血球計數板在顯微鏡下計數[14]。

1.3.4 48 h發(fā)酵液發(fā)酵參數

發(fā)酵48 h后，將人工瘤胃培養(yǎng)管取出放入冰水中終止發(fā)酵，迅速排出培養(yǎng)管中的發(fā)酵液，使用快速pH測定儀測定發(fā)酵液pH；參考Wang等[15]的方法測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量；參考馮宗慈等[16]的方法測定發(fā)酵液中氨態(tài)氮(NH3-N)的含量。參考楊平平等[17]的方法測定發(fā)酵液中乳酸的含量。

1.3.5 有機物消化率(OMD)、代謝能(ME)值及瘤胃微生物蛋白(MCP)產量

OMD、ME及MCP產量計算參考Menke等[18]的方法，根據產氣量估算，計算公式如下：

OMD(%)=14.88+0.889GP+0.45CP+0.651A；
ME(MJ/kg DM)=2.20+0.136GP+0.0574CP。

式中：GP為24 h的凈產氣量(mL/200 mg DM)；CP為粗蛋白質含量(%)；A為粗灰分含量(%),下式同。

MCP根據每千克可消化有機物(DOM)可產生19.3 g微生物氮求得，計算公式如下：

DOM(g/kg OM)=13.3GP-0.05GP2+
511CP+76EE+91.2。

式中：EE為粗脂肪含量(%)。

1.3.6 體外消化率的測定

體外消化試驗培養(yǎng)48 h后，將體外消化培養(yǎng)管放入冰水浴中終止發(fā)酵，瘤胃液裝入離心管中-80 ℃保存。取出纖維濾袋用蒸餾水清洗后置于烘箱內，105 ℃烘干12～24 h得干物質重，用于計算干物質體外消化率(IVDMD)。粗蛋白質(CP)的含量利用FOSS-8400全自動凱氏定氮儀進行測定；中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量利用國標中的方法進行測定[19-20]。采用以下公式計算DM和各種營養(yǎng)物質的體外消化率：

IVDMD(%)=[(樣本DM重-殘渣
DM重)/樣品DM重]×100；
某營養(yǎng)物質體外消化率(%)=[(樣本DM重×
樣本中該營養(yǎng)物質的含量-殘渣DM重×殘渣中
該營養(yǎng)物質的含量)/(樣本DM重×樣本中
該營養(yǎng)物質的含量)]×100。

1.4 數據分析

試驗數據用SPSS 21.0進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較，并對不同添加量的MCFAs對體外瘤胃發(fā)酵參數的影響采用線性(L)和二次曲線(Q)比較，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結 果

2.1 產氣量及產氣參數

由表2可知，各時間點辛酸和癸酸各試驗組的產氣量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)；月桂酸T2～T4組產氣量從24 h開始與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且在24、36 h隨著月桂酸添加量的增加，產氣量呈先降低后升高的二次曲線變化(P<0.05)。

表2 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧體外產氣量的影響

由表3可知，辛酸各組產氣參數指標與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；癸酸T4組理論最大產氣量和T3組產氣速率與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且隨著癸酸添加量的增加分別呈先升高后降低和先降低后升高的二次曲線變化(P<0.05)；月桂酸各試驗組理論最大產氣量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，產氣延滯時間隨著月桂酸添加量的增加呈線性下降(P<0.05)。

表3 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧體外產氣參數的影響

2.2 甲烷產量和瘤胃原蟲數量

由表4可知，辛酸T3、T4組能夠顯著降低瘤胃原蟲數量(P<0.05)，隨著3種MCFAs添加量的增加，甲烷產量和瘤胃原蟲數量呈線性下降(P<0.05)。

表4 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧體外發(fā)酵甲烷產量和瘤胃原蟲數量的影響

2.3 48 h發(fā)酵參數

由表5可知，辛酸各試驗組pH及氨態(tài)氮、乳酸含量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，各組間總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸、戊酸等含量均無顯著差異(P>0.05)，但丁酸含量隨著辛酸添加量的增加呈先升高后降低的二次曲線變化(P<0.05)。癸酸T2～T4組氨態(tài)氮含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且隨著癸酸添加量的增加呈線性下降(P<0.05)，T3、T4組乳酸含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，各組間總揮發(fā)性脂肪酸及乙酸、丙酸、丁酸等含量均無顯著差異(P>0.05)。月桂酸T2、T3、T4組pH、各試驗組氨態(tài)氮含量及T4組丁酸含量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且隨著月桂酸添加量的增加呈線性下降(P<0.05)，各試驗組丙酸含量與對照組相比顯著升高(P<0.05)，且隨著月桂酸添加量的增加呈線性上升(P<0.05)。

表5 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧體外48 h發(fā)酵參數的影響

續(xù)表5項目Items組別 Groups對照 CONT1T2T3T4SEMP值 P-value處理 T線性 L二次 Q異丁酸 Isobutyric acid/(mmol/L)0.900.961.091.070.710.0610.3020.5010.081丁酸 Butyric acid/(mmol/L)5.145.865.405.646.450.2160.2940.1350.513異戊酸 Isovaleric acid/(mmol/L)1.681.741.891.681.610.0510.5690.6220.211戊酸 Valeric acid/(mmol/L)1.011.081.380.961.210.0620.1890.4800.429乙丙比 A/P2.942.952.942.972.870.0260.8520.6160.477月桂酸 Lauric acidpH6.69a6.67a6.63ab6.58b6.56b0.0130.0010.0010.916氨態(tài)氮 NH3-N/(mg/dL)29.42a26.32b24.77bc25.87b22.96c0.5240.0010.1040.075乳酸 Lactic acid/(mg/dL)1.020.850.790.710.670.0460.0540.0050.347總揮發(fā)性脂肪酸 TVFA/(mmol/L)47.6448.8047.3145.4644.330.5070.1690.0390.284乙酸 Acetic acid/(mmol/L)27.6829.9428.6627.1327.000.4160.2590.4300.354丙酸 Propionic acid/(mmol/L)8.40b9.04a9.25a9.15a9.38a0.1310.0400.0230.298異丁酸 Isobutyric acid/(mmol/L)1.061.041.050.890.830.0510.5920.1760.597丁酸 Butyric acid/(mmol/L)6.76a5.98a5.52a5.73a4.48b0.2960.0080.0060.259異戊酸 Isovaleric acid/(mmol/L)2.44a1.59b1.55b1.40b1.42b0.1430.0430.0120.062戊酸 Valeric acid/(mmol/L)1.301.211.281.161.220.0560.0550.0500.337乙丙比A/P3.303.313.102.972.880.0510.1520.0280.882

2.4 OMD、ME值及MCP產量

由表6可知，辛酸和癸酸各試驗組OMD、ME值及MCP產量與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)；月桂酸各試驗組OMD、ME值及MCP產量與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且隨著月桂酸添加量的增加呈線性下降(P<0.05)。

表6 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧體外發(fā)酵OMD、ME值及MCP產量的影響

2.5 營養(yǎng)物質體外消化率

由表7可知，辛酸、癸酸和月桂酸各試驗組的IVDMD、IVNDFD和IVADFD與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，IVCPD與對照組相比顯著降低(P<0.05)，且隨著辛酸添加量的增加呈先降低后升高的二次曲線變化(P<0.05)，隨著癸酸和月桂酸添加量的增加呈線性下降(P<0.05)。

3 討 論

3.1 產氣量及產氣參數

產氣量可以綜合反映瘤胃微生物的生長情況[21]，是評價體外發(fā)酵效果的重要指標。本試驗中，辛酸和癸酸各試驗組的產氣量與對照組相比均無顯著差異，月桂酸各試驗組產氣量在產氣中后期與對照組相比顯著降低。張雨等[22]的試驗也表明，體外發(fā)酵產氣量隨椰子油(主要成分為月桂酸)添加水平的增加呈線性降低。本試驗中，月桂酸組瘤胃原蟲數量的降低可能是導致其產氣量下降的原因之一。同時，體外發(fā)酵時產生氣體的成分主要是甲烷(CH4)和CO2，因此試驗組甲烷產量的下降也可能導致月桂酸組產氣量的降低。

表7 不同添加量、種類的MCFAs對中精粗比飼糧營養(yǎng)物質體外消化率的影響

續(xù)表7項目Items組別 Groups對照 CONT1T2T3T4SEMP值 P-value處理 T線性 L二次 Q月桂酸 Lauric acid干物質體外消化率 IVDMD40.4641.9844.4740.6442.450.0070.4240.3880.715粗蛋白質體外消化率 IVCPD60.88a56.48b56.22b55.38b54.92b0.0080.0470.0010.037中性洗滌纖維體外消化率 IVNDFD40.6440.6140.0040.0940.400.0060.9980.1890.634酸性洗滌纖維體外消化率 IVADFD52.9151.9852.4253.2252.940.0090.9970.8100.257

產氣延滯時間的降低有利于飼糧在瘤胃中的降解[18]。在本研究中，雖然辛酸、癸酸和月桂酸各組間產氣延滯時間無顯著差異，但T4組與其余各組相比均有數值上的降低，說明高添加量的MCFAs對底物的利用產生了積極影響。

3.2 甲烷產量和瘤胃原蟲數量

反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵碳水化合物產生甲烷，不但會加劇全球的溫室效應，而且會降低反芻動物對飼糧的利用率[23]。現在已經得到證實，中鏈飽和脂肪酸能夠對甲烷產生抑制作用是因為它們能夠直接抑制瘤胃原蟲。脂肪酸對多種細菌和原蟲都有顯著的毒性作用[24]。原蟲細胞膜內壁的脫氫酶可催化產生氫分子附著在原蟲上，并被寄生在原蟲上的甲烷菌利用生成甲烷[25]。原蟲被抑制后，影響了氫的生成，從而降低了甲烷產量[25-26]。研究表明，在水牛、羔羊和育肥小母牛的飼糧中添加椰子油能夠減少瘤胃原蟲數量并降低甲烷產量[27-28]。本研究發(fā)現，辛酸、癸酸和月桂酸各試驗組都能在不同程度上降低瘤胃原蟲數量和甲烷產量。這些試驗結果均表明，MCFAs可作為反芻動物有效的甲烷抑制劑。

3.3 48 h發(fā)酵參數

反芻動物瘤胃內pH變化范圍為5.5～7.5，pH反映了飼糧在反芻動物瘤胃中發(fā)酵水平及瘤胃內微生物的活性狀況[29]。本試驗中，月桂酸T3、T4組的pH顯著降低，但其值都在正常范圍(6.56～6.69)內，對微生物的生長和營養(yǎng)物質的降解不會產生負面影響。這與李文婷[30]的月桂酸能顯著降低湖羊瘤胃液pH研究結果一致。

瘤胃中NH3-N的適宜含量為10～50 mg/dL[31]。本試驗中，各組NH3-N含量均在20～35 mg/dL，屬于正常水平。有研究發(fā)現，原蟲對其吞噬的氮僅能利用50%，而剩余的氮會在蛋白酶和肽酶的作用下以短肽和氨基酸的形式排出，所以瘤胃原蟲減少后會使瘤胃氨的產生下降，導致NH3-N的含量降低[32]。本試驗中，癸酸和月桂酸試驗組的NH3-N含量與對照組相比顯著降低。在羔羊上的研究表明，當飼糧中添加75 g/kg的椰子油時瘤胃NH3-N含量顯著低于未添加椰子油的對照組[33]。Priambodo[8]的研究結果也表明，在中精粗比飼糧條件下，MCFAs會使NH3-N的含量顯著降低。

通常情況下，瘤胃內乳酸的含量應該在1 mmol/L(18 mg/dL)以下[34]。本研究中，各試驗組乳酸含量在0.5～1.1 mg/dL，均符合標準。目前未見有關MCFAs對瘤胃內乳酸含量影響的報道，本試驗中，癸酸和月桂酸T4組乳酸含量分別降低了19.46%和33.73%，因此可以推測在中精粗比飼糧中添加MCFAs可能會起到抑制瘤胃乳酸生成的作用，有助于緩解或減少瘤胃酸中毒的發(fā)生。

揮發(fā)性脂肪酸是反芻動物瘤胃營養(yǎng)物質消化代謝的終產物，通常乙酸占主導地位，其次是丙酸和丁酸[35]。目前，有關MCFAs對瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的影響報道相對較少。李文婷[30]對湖羊進行體外發(fā)酵試驗的結果表明，試驗組間總揮發(fā)性脂肪酸含量差異不顯著，但與對照組相比，月桂酸組丙酸含量顯著升高。有研究者認為，原蟲的數量有可能會改變揮發(fā)性脂肪酸的組成，丙酸含量的增加可能是由于原蟲被抑制后與甲烷菌之間的種間氫轉移受到影響，從而使更多的氫被利用到丙酸生成途徑中[36]。瘤胃中丙酸比例越高，可供機體利用的能量就越高[37]。本試驗中，辛酸和癸酸組的總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸和丙酸含量等主要指標與對照組相比差異均不顯著，月桂酸各試驗組丙酸含量與對照組相比顯著上升，T3、T4組的乙丙比在數值上有所降低，說明高添加量月桂酸可能使瘤胃發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵轉化。體內的研究結果也表明，在水牛的飼糧中添加椰子油后瘤胃乙酸含量和乙丙比降低，丙酸含量升高[27]。

3.4 OMD、ME值及MCP產量和營養(yǎng)物質體外消化率

本研究中通過發(fā)酵24 h的產氣量預測了MCFAs對發(fā)酵底物OMD、ME值及MCP產量的影響。結果表明，辛酸和癸酸各試驗組的OMD、ME值及MCP產量與對照組相比均無顯著差異。月桂酸各試驗組的OMD、ME值及MCP產量與對照組相比顯著降低，這可能與月桂酸各試驗組24 h產氣量降低有關。雖然OMD、ME值及MCP產量可以間接地對添加劑的使用效果進行預測，但是體外產氣只有氣體的物理累積量，而不能反映體內氣體不斷外排及交換的動態(tài)變化，因此僅通過預測值并不能完全真實地反映其在體內實際的應用效果。因此，有必要進一步開展體內的研究。

飼糧消化率與體外瘤胃發(fā)酵產氣量具有高度相關性，數值越高表明飼糧在瘤胃中的降解程度越高[38-39]。有研究表明，在含5%脂肪的羊羔基礎飼糧中加入玉米油、戊酸、月桂酸等脂肪酸可明顯降低營養(yǎng)物質的消化率[40]。但也有研究表明，水牛飼糧中添加5%椰子油對營養(yǎng)物質消化率無顯著影響，但7%添加量時纖維的消化率降低[27,41]。本試驗中，各試驗組的IVCPD與對照組相比均顯著降低，其余各體外消化率指標與對照組相比無顯著差異。在瘤胃發(fā)酵過程中，飼糧中絕大多數蛋白質在瘤胃內被降解，只有小部分蛋白質能進入小腸并被吸收，即過瘤胃蛋白，其含量的增多有利于更多的優(yōu)質蛋白質進入小腸并提高動物的生產性能[42-44]。本試驗結果表明，MCFAs可能對進入瘤胃蛋白有一定保護的作用，其有利于增加過瘤胃蛋白的含量。盡管如此，對其保護蛋白質的作用還需開展更多研究。

4 結 論

在本試驗條件下，不同種類及添加量的MCFAs對瘤胃液體外發(fā)酵參數均有一定程度的改善，但其效果存在一定的差異。其中，辛酸能夠降低甲烷產量和瘤胃原蟲數量，以2.0%添加量的體外發(fā)酵效果好；癸酸能夠降低甲烷產量、瘤胃原蟲數量、NH3-N和乳酸含量，以2.0%添加量的體外發(fā)酵效果好；月桂酸能夠降低甲烷產量、瘤胃原蟲數量、NH3-N、乳酸含量和乙丙比，升高丙酸含量并影響發(fā)酵模式，以1.2%添加量的體外發(fā)酵效果好。