干旱脅迫對“波尼”薄殼山核桃葉片生理特性的影響

楊海燕，吳文龍，閭連飛，黃正金，李維林

(1 江蘇省中國科學院植物研究所，南京，210014；2 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心/南京林業(yè)大學林學院，南京，210037)

薄殼山核桃(Caryaillinoensis)又名長山核桃、美國山核桃，為胡桃科山核桃屬落葉喬木[1]，是一個用途廣，收益期長(50～70年)，經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益都很高的優(yōu)良經(jīng)濟樹種，既是重要的木本油料作物，又是綠化樹種和材用樹種[2-3]。目前，我國的薄殼山核桃(果實)產(chǎn)量遠遠滿足不了市場的需求，主要以進口加工為主，所以，在我國發(fā)展薄殼山核桃具有廣闊的市場前景。

干旱脅迫是植物最主要的非生物脅迫之一。干旱脅迫對于植物的形態(tài)、發(fā)育、代謝以及各方面的生理調(diào)節(jié)都會產(chǎn)生負面影響[4]。我國南方廣大地區(qū)屬于季節(jié)性干旱區(qū)，主要包括長江流域的江蘇、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、四川等省。這些地區(qū)季節(jié)性干旱發(fā)生頻率高、強度大，而且干旱與炎熱基本同步，蒸發(fā)量大，嚴重影響經(jīng)濟樹木生理代謝、生長發(fā)育、果實產(chǎn)量和品質(zhì)[5]。薄殼山核桃在生長發(fā)育過程中易受到水分虧缺的強烈影響，因此，引種地區(qū)只有滿足其在水分方面的需求，才能保證其正常生長以及獲得較好的果實產(chǎn)量和品質(zhì)。研究薄殼山核桃響應(yīng)干旱脅迫的潛在機制，能更好地揭示其抗旱性的本質(zhì)。本試驗?zāi)M自然環(huán)境中的干旱脅迫并設(shè)置不同的脅迫程度，研究薄殼山核桃在干旱脅迫的生理響應(yīng)機制，為進一步深入研究薄殼山核桃干旱脅迫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和指導(dǎo)其引種栽培提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗材料為“波尼”薄殼山核桃采用本砧(即“波尼”實生苗作砧木)培育的健壯且一致的2年生嫁接苗，選自南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司六合實驗基地。試驗在江蘇省中國科學院植物研究所溫室大棚內(nèi)進行，單株單盆栽植于棕色硬質(zhì)塑料盆中。塑料盆高35 cm，上口徑22 cm，下口徑18 cm。盆栽基質(zhì)為園土∶蛭石∶珍珠巖=4∶2∶1。盆栽適應(yīng)2個月后，于7月20日選取18株生長健壯的植株進行干旱脅迫處理，即在棚內(nèi)平均溫度(29±4)℃、相對濕度為(80±20)%的條件下，連續(xù)9 d不澆水。分別于不澆水的0、3、6和9 d葉片樣品進行生理生化指標測定，并測定土壤(盆栽基質(zhì))的含水量。

1.2 試驗方法葉片相對含水量(RWC)測定：參考張志良[6]的方法。選取生長一致的功能葉片9張，稱量鮮質(zhì)量(m1)，葉片在水中浸泡至恒質(zhì)量后稱量質(zhì)量(m2)，葉片100 ℃殺青，60 ℃烘干至恒質(zhì)量后稱量質(zhì)量(m3)。RWC=[(m1-m3)/(m2-m3)]×100%。

葉片葉綠素含量測定：采用乙醇提取法[7]。稱取葉片鮮樣0.2 g，加入3 mL 95%乙醇溶液研磨，8 000 轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清液，定容至8 mL。以95%乙醇為空白，測定波長665、649 nm下的吸光值(A)，根據(jù)公式(葉綠素a=13.95A665-6.88A649，葉綠素b=24.46A649-7.32A665，葉綠素總量=葉綠素a+葉綠素b)計算提取液中葉綠素濃度，最后計算葉樣中葉綠素的含量。

葉片抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標測定：超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率的測定采用羥胺氧化反應(yīng)方法[8]。過氧化氫(H2O2)含量的測定采用建成生物有限公司的H2O2試劑盒法，即H2O2可以與鉬酸作用生成一種絡(luò)合物，在405 nm處測定其吸光值。丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法[9]?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍法[10]。超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用黃嘌呤氧化酶法[11]，以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD量為一個活性單位(U)。過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用鉬酸鹽法[12]，以每克材料每秒鐘分解1 μmol H2O2的CAT量為一個活力單位。抗壞血酸(AsA)含量的測定采用二聯(lián)吡啶法[13]。還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定采用DTNB法[13]。

葉片可溶性糖含量測定：參考於新建等[14]的方法?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法(吸取1 mL提取液，加1 mL水和4 mL 0.2 % 蒽酮試劑，沸水浴10 min，冷卻后測定620 nm下的吸光值)。蔗糖含量測定采用間苯二酚法(吸取0.9 mL提取液，加入0.1 mL 2 mol/L NaOH沸水浴10 min，冷卻后加入1 mL 0.1%間苯二酚和3 mL 10 mol/L HCl，80 ℃水浴60 min，在500 nm下測定其吸光值)。

葉片激素含量測定：采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫分析[15]進行測定。用純化的植物激素抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入對應(yīng)的激素，再與辣根過氧化物酶(HRP)標記的激素抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的激素呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中植物激素的濃度。

土壤(基質(zhì))含水量測定：采用電阻式土壤濕度測定儀(土壤墑情速測儀TZS-W)進行測定。主要根據(jù)土壤的電導(dǎo)性與土壤水分含量的關(guān)系測定土壤濕度，土壤濕度又稱土壤含水率，是用土壤含水量占土干重的百分數(shù)表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析用DPS 7.05軟件進行差異顯著性(α=0.05)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片相對含水量從圖1可以看出，隨著干旱脅迫時間的延長，植株葉片逐漸卷曲，葉片顏色從深綠變?yōu)榈S，失水嚴重。試驗結(jié)果表明，在干旱脅迫下，葉片相對含水量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，在第9天達到最小值(21.33%)，降低為對照(干旱脅迫處理第0天，下同)的29.78%，差異顯著(見圖2)。

圖1 干旱脅迫下各處理時期的植株

注：干旱脅迫處理0、3、6和9 d盆內(nèi)基質(zhì)含水量分別為(81.0±3.58)%、(61.2±3.48)%、(41.7±2.11)%和(16.5±2.02)%。圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3至圖6同。

2.2 葉片葉綠素含量試驗結(jié)果看出，在干旱脅迫下，葉片葉綠素a含量和葉綠素總量呈逐漸下降的趨勢，在第9天達到最小值，與對照相比分別下降了53.98%和56.82%，差異顯著(見表1)。說明，植株受到傷害程度比較嚴重。

表1 干旱脅迫下“波尼”薄殼山核桃葉片的葉綠素含量 mg/g

2.3 葉片自由基水平和MDA含量試驗結(jié)果可以看出，在干旱脅迫下，葉片超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率和過氧化氫(H2O2)含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在第6天達到峰值，與對照相比分別增加了10.01%和155.17%，差異顯著；MDA含量在前期無顯著變化，第9天顯著上升，與對照相比增加了52.07%，差異顯著(見圖3)。

圖3 干旱脅迫下“波尼”薄殼山核桃葉片的自由基水平和MDA含量

2.4 葉片蛋白含量試驗結(jié)果看出，在干旱脅迫下，葉片可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升后降的趨勢；在第6天，達到最大值，與對照相比增加了23.87%，差異顯著；在第9天，蛋白含量下降，但仍顯著高于對照(見圖4)。

圖4 干旱脅迫下“波尼”薄殼山核桃葉片的蛋白含量

2.5 葉片抗氧化系統(tǒng)活力試驗結(jié)果看出，在干旱脅迫下，葉片SOD活性先升后降，在第6天達到峰值，為對照的153.73%，差異顯著，第9天時活性開始下降；CAT活性在第3天即顯著下降，為對照的27.70%，此后變化不顯著；AsA含量先升后降，在第3天145.06%)和第6天分別升為對照的145.06%和144.93%，之后開始緩慢下降，但均與對照差異顯著；GSH含量逐漸上升，均與對照差異顯著，在第9天達到峰值(為對照的141.25%)(見圖5)。

圖5 干旱脅迫下“波尼”薄殼山核桃葉片的抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量

2.6 葉片可溶性糖含量試驗結(jié)果看出，在干旱脅迫下，葉片可溶性糖總量在前期比較穩(wěn)定，在第9天降為對照的56.75%，差異顯著；蔗糖是可溶性總糖中的一部分，其含量變化表現(xiàn)為先升后降，第3天、第6天和第9天分別為對照的235.77%、222.00%和143.50%，均顯著高于對照(見圖6)。

2.7 葉片激素含量試驗結(jié)果看出，在干旱脅迫下，葉片乙烯(ETH)和水楊酸(SA)含量均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，ETH在第3天達到峰值(為對照的115.15%)，SA在第6天達到峰值(為對照的115.28%)；茉莉酸(JA)含量隨著干旱時間的延長逐漸下降，第9天降為對照的76.32%，差異顯著；脫落酸(ABA)無顯著變化(見表2)。

表2 干旱脅迫下“波尼”薄殼山核桃葉片的激素含量

3 討論與結(jié)論

干旱脅迫是制約作物生長發(fā)育以及產(chǎn)量的重要的非生物脅迫之一，也是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素[16]。干旱脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，甚至會造成植物死亡。葉片相對含水量可以反映植物葉片細胞水分的生理狀態(tài)，可以用來評估植株抗旱能力的強弱[17]。在本研究中，“波尼”薄殼山核桃葉片相對含水量隨著干旱時間的延長而持續(xù)下降，表現(xiàn)出較低的抗旱水平。葉片是光合作用的主要器官，其葉綠素含量與光合能力的強弱密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著干旱時間的延長，“波尼”葉片的葉綠素(總)含量有不斷下降的趨勢，第9天降為對照的56.82%。這很可能是因為在干旱脅迫下，葉片嚴重失水，導(dǎo)致葉綠素代謝相關(guān)酶活性下降，加快了葉綠素的分解。此外，前人的研究表明，在干旱脅迫下，植物葉片氣孔導(dǎo)度降低，從而直接抑制了葉片的光合碳同化能力[18]。

植物在正常生長狀態(tài)下，活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，在干旱脅迫下，植株體內(nèi)的活性氧自由基大量積累，細胞膜脂過氧化程度加重。在本研究中，隨著干旱時間的延長，“波尼”葉片的O2˙-產(chǎn)生速率和H2O2含量呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢，尤其是H2O2含量在干旱脅迫下均顯著高于對照。這表明，在干旱脅迫下，“波尼”葉片中的自由基大量積累。MDA是衡量細胞破壞程度的重要指標，MDA含量越高，細胞膜脂過氧化程度越嚴重[19]。在本研究中，干旱脅迫前6 d，“波尼”葉片MDA含量平穩(wěn)，而在第9天時顯著上升。可見，隨著干旱脅迫時間的延長，葉片中產(chǎn)生的自由基對植株產(chǎn)生了顯著傷害。植物在干旱脅迫下，會調(diào)動自身的抗氧化防御系統(tǒng)來抵抗氧化傷害。植物的抗氧化系統(tǒng)主要包括抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)兩大類[20-21]。SOD和CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD能以O(shè)2˙-為基質(zhì)進行歧化反應(yīng)，生成H2O2，CAT能夠分解H2O2生成H2O和O2，起到清除活性氧自由基，緩解膜系統(tǒng)氧化傷害的作用[22-23]。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片SOD酶活性變化表現(xiàn)為先升后降，CAT活性直線下降。這表明，隨著干旱時間的延長，這兩種保護酶的活性會受到抑制，其中，CAT對干旱脅迫更加敏感。AsA和GSH是抗氧化系統(tǒng)中重要的非酶系統(tǒng)。AsA和GSH既可以通過AsA-GSH循環(huán)清除活性氧自由基，還可以作為抗氧化酶系統(tǒng)的底物參與反應(yīng)，同時AsA和GSH作為小分子抗氧化物質(zhì)可以直接與活性氧自由基發(fā)生反應(yīng)，將其還原[23]。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片AsA含量先升后降，GSH含量逐漸上升。說明，這兩個物質(zhì)在“波尼”抵抗干旱脅迫的過程中發(fā)揮了重要作用。此外，在干旱脅迫下，植物可以通過增加體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來提高細胞的保水能力，從而減少對膜系統(tǒng)的傷害，其中，可溶性蛋白和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[24]。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片可溶性蛋白含量先升后降，均高于對照；可溶性糖總量雖呈現(xiàn)下降的趨勢，但蔗糖含量先升后降，均高于對照。這說明，可溶性蛋白和蔗糖兩種物質(zhì)在“波尼”植株抵御干旱脅迫的過程中發(fā)揮了調(diào)控功能。

內(nèi)源激素在植物遭受逆境脅迫時，可以起到重要的調(diào)節(jié)作用，許多研究表明，乙烯(ETH)、水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)和茉莉酸(JA)等植物激素是植物啟動防御機制的重要信號物質(zhì)[25-27]。段夢琪等[25]的研究表明，外施乙烯利可以緩解黑麥草在干旱條件下的脅迫損傷。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片ETH含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。這表明，ETH可能在一定程度上緩解了“波尼”植株的干旱脅迫傷害，但后期由于干旱脅迫程度加重，超出了植株本身的承受能力，因而ETH出現(xiàn)了下降的趨勢。李琬婷等[26]研究表明，外施ABA可以提高干旱脅迫下滇潤楠幼苗葉片相對含水量、抗氧化酶活性和脯氨酸含量等，從而增強植株對干旱脅迫的適應(yīng)性。外施SA可以起到與ABA相似的效果。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片ABA含量無顯著變化，SA含量先升后降。這說明，在干旱脅迫前期，SA對“波尼”起到了一定的保護功能。JA作為信號分子，能有效地介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)。金毅等[27]研究發(fā)現(xiàn)，外源JA提高干旱脅迫過程中保護物質(zhì)的含量，從而降低干旱脅迫對大豆機體的損傷。在本研究中，干旱脅迫下的“波尼”葉片JA含量持續(xù)下降。這可能是“波尼”葉片的JA合成系統(tǒng)承受干旱脅迫的能力較低，極易被干旱脅迫抑制所致。

綜上所述，在干旱脅迫下，“波尼”薄殼山核桃可以通過抗氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和激素代謝及時進行響應(yīng)。在受到輕度干旱脅迫時，“波尼”具有有效的防御能力，植株主要通過提高抗氧化酶(SOD)活性、抗氧化物質(zhì)(AsA、GSH)含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(可溶性蛋白和蔗糖)含量以及激素(乙烯、水楊酸)等信號分子的含量來增強自身對干旱脅迫的抵抗能力，但是隨著干旱時間的延長，其葉片相對含水量和葉綠素含量顯著下降，自由基大量積累，膜質(zhì)過氧化程度加重，超出“波尼”的承受能力，植株表現(xiàn)為受到較大的傷害。本研究認為，“波尼”品種對輕度干旱有較強的適應(yīng)性，可以應(yīng)對短暫缺水的狀況，在本試驗中缺水處理第6天時，葉片葉綠素含量仍有對照的78%，SOD活性達到峰值，AsA、可溶性蛋白和水楊酸含量處于高水平，表現(xiàn)出較強的抗旱能力，但此后均顯著下降，抗旱能力降低。因此，“波尼”品種是干旱敏感型品種，適合在長江以南雨水比較充沛的地區(qū)推廣種植。