獼猴桃開放式組培增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

辛納慧，李鈺媛，張 馳，張振營，張乃群

(1 南陽師范學院生命科學與農業(yè)工程學院，河南南陽，473061；2 新疆軍區(qū)保障部物資采購站，烏魯木齊，830002；3 西峽縣獼猴桃研究所，河南西峽，474573)

獼猴桃屬(Actinidia)植物為落葉、半落葉至常綠藤本，其果實屬于典型漿果，富含維生素C等營養(yǎng)物質，充分成熟后香味濃郁、酸甜可口，是20世紀后才逐漸得到人們重視的果樹[1-3]。海沃德(Hayward)獼猴桃是新西蘭選育的美味獼猴桃(A.chinensisvar.deliciosa)優(yōu)良品種，果實呈長圓柱形，果肉翠綠，味道酸甜可口，貨架期長，豐產性強，種植效益較高[4]。目前，大量的獼猴桃種苗生產主要來源于組織培養(yǎng)[5-6]。利用組織培養(yǎng)繁殖獼猴桃幼苗可以保存品種的優(yōu)良基因，繁殖速度快，周期短，可實現(xiàn)工廠化育苗[7]。然而，傳統(tǒng)獼猴桃組織培養(yǎng)因需要無菌環(huán)境、使用特定儀器設備以及操作程序繁雜，生產成本高，故限制了該技術的應用和推廣[8]。植物開放式組織培養(yǎng)，是在自然條件下通過添加抑菌劑來替代高壓滅菌鍋和超凈工作臺，從根本上簡化組培環(huán)節(jié)，降低組培成本[9-10]。該技術的關鍵是找到一種抑菌劑來代替高溫滅菌，目前利用農藥、消毒劑等作為抑菌劑的研究均有報道。國內在甘蔗[8]、香蕉[9]、魔芋[11]、山丹[12]等植物已初步建立開放式組織培養(yǎng)體系。

筆者以海沃德獼猴桃無菌苗作為試驗材料，初步篩選次氯酸鈉在增殖培養(yǎng)中的最優(yōu)濃度，對蔗糖濃度、6-BA濃度和NAA濃度進行進一步優(yōu)化，在此基礎上，對開放式組培和傳統(tǒng)組培工廠化育苗進行成本核算及效益分析，可為獼猴桃種苗商品化生產降成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

組培材料為實驗室內已有的海沃德獼猴桃無菌苗。

1.2 試驗準備

抑菌劑為次氯酸鈉(分析純，含量以有效氯計≥10.0%)?；九囵B(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，pH值在5.8～6.0左右。植物生長調節(jié)劑為6-BA和NAA。組織培養(yǎng)室條件為光照12 h/d，光照強度為1 500～2 000 lx，溫度為(25±2)℃。

1.3 試驗方法

1.3.1 自然落菌試驗 在沒經過任何消毒滅菌處理的室內，向培養(yǎng)皿中加入含抑菌劑(次氯酸鈉)的MS培養(yǎng)基，在空氣中暴露使其自然落菌，1 h后封口，放在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定期觀察其生菌狀況。設9個處理，即MS培養(yǎng)基中次氯酸鈉濃度分別設為0、0.001%、0.003%、0.005%、0.007%、0.009%、0.011%、0.013%和0.015%。各處理每個重復10皿，重復3次。

1.3.2 人工接菌試驗 在沒經任何消毒的室內，向培養(yǎng)皿內加入含抑菌劑(次氯酸鈉)的MS培養(yǎng)基，然后在培養(yǎng)基上接種常見的真菌(曲霉菌Aspergillus，青霉菌Penicillium)和細菌(大腸桿菌Escherichiacoli)，封口后放在組培室中培養(yǎng)，定期觀察其生菌狀況。設7個處理，即MS培養(yǎng)基中次氯酸鈉濃度分別設為0.007%、0.009%、0.011%、0.013%、0.015%、0.017%和0.019%。各處理每個重復10皿，重復3次。

1.3.3 最佳次氯酸鈉濃度篩選 使用添加不同濃度次氯酸鈉的增殖培養(yǎng)基進行海沃德獼猴桃的增殖培養(yǎng)，篩選最佳次氯酸鈉濃度。以MS+6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g +瓊脂3 g為培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基未凝固前加入次氯酸鈉，分裝到一次性塑料杯中，冷卻備用。開放式接種在普通實驗室中進行，在接種前先將接種器具在75%酒精中浸泡30 min消毒，接種過程中接種器具要浸泡在75%酒精中，每杯接種1個芽，接種后用PE保鮮膜進行封口。設7個濃度處理，即培養(yǎng)基中濃度分別設為0.007%、0.009%、0.011%、0.013%、0.015%、0.017%和0.019%；同時，以經高溫滅菌處理的傳統(tǒng)組培(MS+6-BA 2.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L +蔗糖30 g +瓊脂6 g)為對照。各處理每重復10杯，重復3次。在組培室進行光照培養(yǎng)，50 d后觀察并記錄污染率、成活率、增殖系數(shù)。

1.3.4 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化 單因素試驗：先在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+次氯酸鈉0.013%+瓊脂3 g的基礎上，考察蔗糖含量為10、20、30、40和50 g 時的增殖系數(shù)，然后將優(yōu)化的最佳蔗糖含量作為固定值，再依次考察不同濃度6-BA(0、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L)和NAA(0、0.05、0.10、0.20和0.30 mg/L)下的增殖系數(shù)。用每次優(yōu)化后的最佳值，再篩選其余最佳條件。每試驗各處理重復10瓶，重復3次。在組培室進行光照培養(yǎng)，50 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。

響應面試驗：在基本培養(yǎng)基(MS)、次氯酸鈉濃度(0.013%)和瓊脂用量(3 g)不變的情況下，根據(jù)6-BA、NAA和蔗糖單因素試驗結果，應用Design-Expert 10.0.1軟件設計6-BA、NAA和蔗糖三因素三水平(見表1)響應面試驗。各試驗點30瓶。在組培室進行光照培養(yǎng)，50 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)。確定最優(yōu)因素組合后，進行驗證試驗(每組10瓶，重復3次)。

表1 海沃德獼猴桃開放式增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應面試驗因素和水平

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)據(jù)采用Excel 2019、SPSS 22.0和Desing Expert 10.0.1進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 自然落菌試驗

試驗結果看出，當抑菌劑(次氯酸鈉)濃度≤0.003%時，對培養(yǎng)基以及自然環(huán)境中的真菌、細菌幾乎不存在抑制能力，且培養(yǎng)基污染程度受時間因素影響較??；當抑菌劑濃度在0.003%～0.009%之間時，培養(yǎng)基存在明顯污染狀況，污染率與抑菌劑濃度呈負相關，且污染率隨培養(yǎng)時間增加而增加；當抑菌劑濃度≥0.011%時，對真菌、細菌抑制效果較好，培養(yǎng)基幾乎不存在污染現(xiàn)象(見圖1)。由此認為，在自然環(huán)境中，MS培養(yǎng)基中次氯酸鈉濃度達到0.011%就能夠有效抑制培養(yǎng)基本身以及自然環(huán)境中的真菌、細菌。

圖1 不同濃度次氯酸鈉對MS培養(yǎng)基自然落菌的抑制效果

2.2 人工接菌試驗

在自然落菌試驗中，當抑菌劑濃度為0.007%時，30 d的污染率為50%，因此，選取0.007%以上的抑菌劑濃度進行人工接菌試驗。試驗結果看出，當抑菌劑濃度<0.015%時，培養(yǎng)基存在不同程度的污染，即真菌和細菌會有不同程度的存活。當抑菌劑濃度≥0.015%時，抑菌效果佳，培養(yǎng)基不存在污染情況(見圖2)。

圖2 不同濃度次氯酸鈉對培養(yǎng)基人工接菌的抑制效果

2.3 最佳次氯酸鈉濃度篩選

試驗結果看出，隨著次氯酸鈉濃度的升高，污染率逐漸下降，增殖系數(shù)先升高后降低。當次氯酸鈉濃度為0.013%時，增殖系數(shù)(3.94)僅次于傳統(tǒng)組織培養(yǎng)(4.23)，顯著高于其他濃度次氯酸鈉處理；污染率(6.95%)較低，與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)(1.11%)差距不大。次氯酸鈉濃度低于0.013%時，污染率高，導致增殖系數(shù)降低；濃度大于0.013%時，次氯酸鈉對海沃德獼猴桃的不定芽具有毒害作用，導致增殖系數(shù)下降。因此，海沃德獼猴桃芽采用開放式組培進行增殖，抑菌劑(次氯酸鈉)最佳濃度為0.013%(見表2)。

表2 不同濃度次氯酸鈉對海沃德獼猴桃開放式增殖培養(yǎng)的影響

2.4 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 單因素實驗 蔗糖含量：在固定6-BA(2.0 mg/L)、NAA(0.1 mg/L)、次氯酸鈉(0.013%)、瓊脂(3 g)的情況下，觀察蔗糖含量對增殖系數(shù)的影響。試驗結果看出，蔗糖含量為10，20，30，40，50 g的增殖系數(shù)分別為2.89、3.49、3.94、3.57和3.13，隨著蔗糖含量增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)為先升高后下降的明顯變化，在30 g時增殖系數(shù)最大。

6-BA濃度：在固定NAA(0.1 mg/L)、蔗糖(30 g)、次氯酸鈉(0.013%)、瓊脂(3 g)的情況下，觀察6-BA濃度對增殖系數(shù)的影響。試驗結果看出，6-BA濃度為0、1.0、2.0、3.0和4.0 mg/L的增殖系數(shù)分別為2.58、3.37、3.94、3.53和2.81，隨6-BA濃度增加，增殖系數(shù)呈現(xiàn)為先升高后下降的明顯變化，在2.0 mg/L時增殖系數(shù)最大。

NAA濃度：在固定6-BA(2.0 mg/L)、蔗糖(30 g)、次氯酸鈉(0.013%)、瓊脂(3 g)的情況下，觀察NAA濃度對增殖系數(shù)的影響。試驗結果看出，NAA濃度為0、0.05、0.10、0.20和0.30 mg/L的增殖系數(shù)分別為1.92、2.46、3.94、3.15和2.65，隨著NAA濃度增加，增殖系數(shù)也呈現(xiàn)為先升高后下降的明顯變化，在0.1 mg/L時增殖系數(shù)最大。

表3 海沃德獼猴桃增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應面試驗方案及結果

表4 海沃德獼猴桃增殖培養(yǎng)基優(yōu)化響應面試驗二次多項回歸模型方差分析

2.5 成本分析

傳統(tǒng)組培要在嚴格的無菌環(huán)境中進行操作和培養(yǎng)，而開放式組培改善了培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基具有殺菌、抗菌的作用，能保證植物組織正常生長。與傳統(tǒng)組培相比，開放式組培增加了抑菌劑費用以及浸泡消毒工具所需費用支出；傳統(tǒng)組培比開放式組培多高壓滅菌鍋、超凈工作臺費用以及相應的電費支出，還有瓊脂用量多所需費用。以培養(yǎng)10 000株苗為例，在其他條件(成本)相同的情況下，傳統(tǒng)組培需瓊脂3 200 g，費用為629.50元，使用高壓滅菌鍋滅菌所需費用為1 252.34元，使用超凈工作臺接種所需費用1 242.16元，共計3 124.00元；開放式組培需瓊脂1 200 g，費用為223.5元，浸泡工具所需75%酒精費用為45.7元，次氯酸鈉溶液費用為30.22元，共計299.42元?？梢?，開放式組織培養(yǎng)相對于傳統(tǒng)式組織培養(yǎng)簡化了環(huán)節(jié)，降低了成本。

3 討論與結論

植物開放式組培的出現(xiàn)已經有20多年了，目前開放式組培的研究方向側重于篩選有效的抑菌劑。這種方法相對添加CO2無糖培養(yǎng)[13-14]來說，操作簡單，設備要求不高。開放式組培和傳統(tǒng)組培相比，簡化了組培環(huán)節(jié)，降低了操作難度，工人培訓時間縮短，接種效率提升，降低了組培成本，更有利于推廣[10]。

目前開放式組織培養(yǎng)抑菌劑的種類主要有食品添加劑[15]、植物提取物[16]、家用消毒劑[17]和農藥[18]等。本試驗以海沃德無菌苗作為開放式增殖培養(yǎng)的材料，通過在培養(yǎng)基中添加次氯酸鈉溶液，使培養(yǎng)基具有殺菌、抗菌功能，且可以保證植物正常生長。本試驗所用次氯酸鈉是一種家用消毒劑，具有廣譜殺菌、價格便宜的特點，在海沃德獼猴桃開放式增殖培養(yǎng)中，次氯酸鈉濃度為0.013%的增殖系數(shù)(3.94)最佳，與傳統(tǒng)組織培養(yǎng)的增殖系數(shù)(4.23)差距較小。在煙草開放式組培中添加0.1%次氯酸鈉可以保證污染率在10%以下[19]，鐵皮石斛不定芽開放式增殖培養(yǎng)中添加0.15%次氯酸鈉的增殖系數(shù)最高(2.48)[20]，與本試驗所用次氯酸鈉濃度不同。李松[7]等研究發(fā)現(xiàn)，在甘蔗開放式組培中次氯酸鈉濃度為1 000 mg/L時，腋芽繁殖速度較快；解輝[8]等研究發(fā)現(xiàn)，在香蕉開放式培養(yǎng)中次氯酸鈉濃度選擇為0.014%，與本研究結果基本一致。不同試驗及不同植物材料的最佳次氯酸鈉濃度不同，一方面可能與所用次氯酸鈉有效氯含量不同有關，另一方面可能與不同植物材料對次氯酸鈉的耐受性不同有關。

由于開放式組培不需要經過高溫滅菌，減少了培養(yǎng)基成分損失，需要對瓊脂用量、蔗糖用量以及植物生長調節(jié)劑等進行調整。本研究所得海沃德獼猴桃開放式組培最佳增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2.0mg/L +NAA 0.1 mg/L+糖30 g +瓊脂3 g +0.013%次氯酸鈉。