油莎豆乙酰乳酸合酶基因CeALS的克隆與分析

肖艷華 鄒智 趙永國(guó) 郭安平 張麗

（1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430074；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院 熱帶生物技術(shù)研究所 海南省南繁生物安全與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 571101；3.廣東石油化工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，茂名 525000）

雜草是影響農(nóng)作物生長(zhǎng)與產(chǎn)量的重要限制因子。一直以來(lái)，雜草防除都是病蟲(chóng)草害防治過(guò)程中的重中之重。除草劑，又名除莠劑，是一類(lèi)可使雜草徹底或選擇性枯死的藥劑。除草劑的發(fā)明及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的廣泛應(yīng)用為雜草的高效防除創(chuàng)造了條件。根據(jù)有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，除草劑可分為氨基酸類(lèi)、三嗪類(lèi)、苯脲類(lèi)、酰胺類(lèi)等，其作用機(jī)制是通過(guò)干擾與抑制生理代謝而使雜草死亡，如影響光合作用、影響脂肪酸的合成、影響色素的合成、阻礙氨基酸的合成、干擾葉酸的形成、干擾激素平衡等［1］。植物中目前已確定的除草劑靶標(biāo)約有10余種［2］，其中，乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS，EC2.2.1.6）或乙酰羥酸合酶（acetohydroxyacid synthase，AHAS）是合成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等支鏈氨基酸的關(guān)鍵酶，其在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化2分子丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，而在異亮氨酸的合成中催化1分子丙酮酸與1分子α-丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸和二氧化碳［3］。ALS基因廣泛分布于各類(lèi)植物以及真菌、細(xì)菌、古細(xì)菌和藻類(lèi)中，在基因組中以單拷貝或小家族的形式存在［3］。目前己開(kāi)發(fā)的ALS抑制劑有50多種，可歸為磺酰脲（sulfonylurea，SU）、咪唑啉酮（imidazolinone，IMI）、三唑并嘧啶（triazolopyrimidine，TP）、嘧啶硫代苯甲酸酯（pyrimidinyl-thiobenzoate，PTB）和磺酰胺羰基三唑啉酮（sulfonyl-aminocarbonyltriazolinone，SCT）等5大類(lèi)［4］。這些抑制劑通過(guò)與ALS結(jié)合而使其失活，進(jìn)而造成支鏈氨基酸合成受阻、蛋白質(zhì)合成停止、有絲分裂細(xì)胞停止在G1階段的S期（DNA合成期）和G2階段的M期，最終導(dǎo)致植物停止生長(zhǎng)并失綠黃化死亡，具有高效、低毒、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［2，4］。雖然如此，ALS抑制劑的廣泛和長(zhǎng)期應(yīng)用極大加速了雜草的進(jìn)化，至今報(bào)道的抗性雜草已超過(guò)160種［5］?？剐缘姆肿踊A(chǔ)主要源于A(yíng)LS的點(diǎn)突變，如Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653和 Gly654（ 對(duì) 應(yīng)于 AtALS 的相應(yīng)位點(diǎn)）［4-5］。

油莎豆（Cyperus esculentus L.），又名油莎草、虎堅(jiān)果、鐵荸薺、黃色特格拉斯（yellow nutsedge）、地下板栗、地下核桃等，是一種優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、綜合利用前景廣闊的集油、糧、草、飼于一體的經(jīng)濟(jì)作物［6］。與香附子（Cyperus rotundus）或紫色特格拉斯（purple nutsedge）一樣，隸屬于禾本目莎草科莎草屬的油莎豆地上長(zhǎng)草、地下結(jié)豆；不同的是，油莎豆的塊莖積累高水平的油脂（24%-35%）［7］。相比其他油料作物，油莎豆具有生育期短（70-150 d）、生物量大（畝產(chǎn)鮮豆800-2 000 kg、鮮草2 000 kg以上）、每畝產(chǎn)油量高（超過(guò)100 kg）、適應(yīng)性廣（我國(guó)多數(shù)地區(qū)均可種植）、病蟲(chóng)害少、抗逆性強(qiáng)（耐旱、耐澇、耐高溫、耐鹽堿、耐貧瘠等）、發(fā)展?jié)摿Υ?、適合機(jī)械化等特點(diǎn)，便于在不擠占糧食和大豆生產(chǎn)面積的情況下增加我國(guó)的油脂和飼料原料供給，緩減對(duì)國(guó)外大豆的依賴(lài)程度，滿(mǎn)足國(guó)家的戰(zhàn)略需求［6，8］。但是，在我國(guó)華中、華南乃至華北地區(qū)大面積推廣種植油莎豆存在一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)：首先，油莎豆的地下莖系統(tǒng)非常發(fā)達(dá)，其中匍匐莖和塊莖均可繁殖，多數(shù)除草劑不能將其徹底清除，這也是為什么香附子成為世界惡性雜草的主要原因；其次，地里殘留的油莎豆塊莖萌發(fā)不整齊，且在上述區(qū)域可安全越冬，來(lái)年勢(shì)必成為連茬作物的雜草；此外，ALS抑制劑抗性在莎草屬的部分植物中已有發(fā)現(xiàn)，其中包括油莎豆［9-12］。為摸清我國(guó)油莎豆資源的遺傳基礎(chǔ)，本研究對(duì)油莎豆的ALS基因進(jìn)行克隆，并基于現(xiàn)有的種質(zhì)資源分析其遺傳變異，揭示其序列特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)特性，以期為今后的分子設(shè)計(jì)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為種植于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所文昌試驗(yàn)基地（海南文昌）的圓粒型油莎豆熱研1號(hào)及另外55份種質(zhì)，早期初步發(fā)現(xiàn)其對(duì)ALS抑制劑無(wú)抗性。用于提取DNA的幼嫩葉片直接采集于試驗(yàn)地，而用于提取RNA的熱研1號(hào)于采樣前10 d移栽至溫室（海南?？冢?，具體培養(yǎng)條件和樣品采集詳見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和植物表達(dá)載體pCAMBIA1301由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存；引物合成和常規(guī)DNA測(cè)序委托北京擎科生物技術(shù)有限公司完成；基因組測(cè)序委托武漢希望組生物科技有限公司完成；天根DNA Marker Ⅲ（貨號(hào)MD103）、天根植物多糖多酚RNA提取試劑盒、賽默飛cDNA第一鏈合成試劑盒、Omega快速質(zhì)粒小提試劑盒、Omega DNA純化回收試劑盒、諾唯贊ClonExpress II One Step Cloning Kit（C112-02）試劑盒、Promega DNase I酶、寶生物高保真DNA聚合酶及各類(lèi)分析純生化試劑和實(shí)驗(yàn)耗材均購(gòu)自相應(yīng)的試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 ALS基因的鑒定 擬南芥的ALS基因下載于A(yíng)raport11（https://www.arabidopsis.org/），并以其蛋白序列作為種子tBLASTn檢索研究組前期獲得的油莎豆全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組［8］以及代表性植物的基因組［13-14］。

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成 采用天根試劑盒單獨(dú)提取幼嫩葉片、成熟葉片、衰老葉片、芽、芽莖、塊莖等不同組織樣本的總RNA，經(jīng)純度、濃度和完整性檢測(cè)合格后用DNase I酶清除殘存的DNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，然后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 基因克隆 基于上述轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)獲得的CeALS轉(zhuǎn)錄本序列，采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆和同源重組引物對(duì)CeALSF（5′-TCC TCT CCA TTC CAT TCC ATT CG-3′）/CeALSR（5′-ACA ACA CCT GAG GGA ACC GC-3′）和 CeALSHF（5′-CAC GGG GGA CTC TTG ACC ATG GCT TCC TCT TCC TCC CTC-3′）/CeALSHR（5′-CTG GTC ACC TGT AAT TCA CAC CTA GTA CAC AGT CCG GCC ATC-3′）（下劃線(xiàn)為可與pCAMBIA1301重組的同源臂）。基因克隆參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行，PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；為一步完成植物表達(dá)載體的構(gòu)建，研究以稀釋100倍的第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，利用同源重組引物進(jìn)行第二輪PCR，產(chǎn)物電泳檢測(cè)后切膠回收目的條帶；同時(shí)，用Nco I和Pml I 37℃酶切pCAMBIA1301 12 h，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后回收目的條帶；然后，將上述線(xiàn)性化載體和PCR膠回收產(chǎn)物按1∶2比例混合，并用Exnase II 37℃催化2 h，構(gòu)建載體pCAMBIA1301-CeALS。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)后，參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行后續(xù)的菌落PCR、測(cè)序及質(zhì)粒的提取。

1.2.4 基因組測(cè)序與分析 采用改良的CTAB法［16］分別提取56份葉片材料的基因組DNA，經(jīng)純度、濃度和完整性檢測(cè)合格后等量混合，然后用全基因組鳥(niǎo)槍法構(gòu)建二代400 bp的小片段DNA文庫(kù)，并利用NovaSeq 6000進(jìn)行150 bp雙末端測(cè)序。序列比對(duì)和SNP分析分別采用 bwa-mem（v0.7-17）［17］和GATK（v3.8.1）［18］。

1.2.5 序列分析 參照文獻(xiàn)［19］，利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的理化特性；利用Protscale（http://cn.expasy.org/tools/protscale.html）分析親水 /疏水性；利用 TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜螺旋；利用ChloroP 1.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位和葉綠體信號(hào)肽剪切位點(diǎn)；利用CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 和 SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/） 分析保守結(jié)構(gòu)域；利用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/）預(yù)測(cè)生物學(xué)功能；利用MEGA6.0進(jìn)行多序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.6 表達(dá)特性分析 熒光定量分析具體參照文獻(xiàn)［20］，以18S rRNA作為內(nèi)參，引物對(duì)分別為18SF（5′-TGT GAT GCC CTT AGA TGT TCT GG-3′）/18SR（5′-GAC GTA GTC AAC GCG AGC TGA-3′）和 CeALSFq（5′-GCA GGT TTG GGT GCT ATG GG-3′）/CeALSRq（5′-TGG CCT TGA CAG GTA GGT TCT CTA T-3′），每樣品至少3次生物學(xué)重復(fù)，基因相對(duì)表達(dá)值和方差分析分別用2ΔΔCt法和SPSS進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 CeALS基因的克隆

通過(guò)搜索實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的油莎豆全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，獲得一條2 425 bp的轉(zhuǎn)錄本（圖1），該序列包含1 938 bp的開(kāi)放讀碼框（ORF），其序列長(zhǎng)度與其他植物相近，將基因命名為CeALS。為實(shí)驗(yàn)克隆該基因，在其5′和3′轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)（UTR）分別設(shè)計(jì)引物CeALSF和CeALSR，目標(biāo)擴(kuò)增長(zhǎng)度為2 161 bp；通過(guò)以熱研1號(hào)反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得一條約2 000 bp的特異條帶（圖2-A）；隨后，以上述PCR產(chǎn)物作為模板、CeALSHF/HR作為引物進(jìn)行第二輪PCR，成功擴(kuò)增到一條約1 977 bp的清亮條帶（圖2-B）。將目標(biāo)條帶切膠回收后與線(xiàn)性化載體pCAMBIA1301混勻、孵育、轉(zhuǎn)化大腸桿菌，菌落PCR后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果顯示，研究分離到的序列與上述全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)（CDS）完全一致。

圖1 CeALS的全長(zhǎng)cDNA及其推測(cè)編碼的氨基酸Fig.1 Full-length cDNA sequence of CeALS and its deduced coding amino acids

圖2 油莎豆CeALS基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of CeALS in C.esculentus

2.2 代表性植物中ALS基因的鑒定

為揭示油莎豆的分類(lèi)學(xué)地位并探討ALS基因在單子葉植物中的分布與進(jìn)化特征，研究基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)中釋放的全基因組序列對(duì)ALS基因進(jìn)行了鑒定，從14種代表性的單子葉植物中共計(jì)鑒定到19個(gè)ALS基因；同時(shí)，研究還從4種無(wú)參考基因組的莎草科植物中檢索獲得7個(gè)包含完整編碼區(qū)的ALS基因。如表1所示，ALS基因在這些植物中多以單拷貝的形式存在，而在康藏嵩草（Carex littledalei）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）和香蕉（Musa acuminata）中存在2個(gè)拷貝；基因在擬南芥和多數(shù)單子葉植物中無(wú)內(nèi)含子，而在康藏嵩草、短葉水蜈蚣（Cyperus brevifolius）、 螢 藺（Schoenoplectiella juncoides）、 豬毛草（Schoenoplectiella wallichii）和沼澤蘆葦（Schoenoplectiella mucronata）等莎草科植物中存在一個(gè)內(nèi)含子（表1）。

2.3 基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 CeALS編碼蛋白的理化特性、亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域 序列分析顯示，CeALS編碼區(qū)的GC含量為55.01%，預(yù)測(cè)編碼645個(gè)氨基酸（圖1），其中含量較高的依次為L(zhǎng)eu（9.30%）、Ala（9.30%）、Ser（8.37%）和Val（8.20%）；強(qiáng)堿性、強(qiáng)酸性、極性和疏水氨基酸所占比例分別為9.61%、10.70%、24.19%和35.66%；蛋白的理論分子量（MW）為69.94 kD，等電點(diǎn)（pI）為6.10，pH 7.0時(shí)的帶點(diǎn)荷數(shù)（ch）為-4.785，脂肪族指數(shù)（AI）為89.36，這與其他物種相近；與多數(shù)物種類(lèi)似，CeALS的總平均疏水指數(shù)（GRAVY）＜0，為-0.156，疏水性最高的為343位的Leu和345位的Phe（分值2.011）、親水性最高的為473位的Tyr和474位的Lys（分值-2.822）；CeALS的不穩(wěn)定系數(shù)（II）與多數(shù)物種類(lèi)似，為44.93，屬于不穩(wěn)定蛋白（表1）。TMHMM分析顯示CeALS無(wú)跨膜螺旋；ChloroP分析顯示蛋白葉綠體定位，其前端的54個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽；CDD分析顯示蛋白的67-645為乙酰乳酸合酶結(jié)構(gòu)域（PLN02470，E值0e+00）；SMART分析進(jìn)一步顯示蛋白的72-240為硫胺素焦磷酸酶N端TPP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TPP_enzyme_N，PF02776，E值4.4e-50）、264-397為硫胺素焦磷酸酶中央結(jié)構(gòu)域（TPP_enzyme_M，PF00205，E值1.5e-42）、459-614為硫胺素焦磷酸酶C端TPP結(jié)合結(jié)構(gòu)域（TPP_enzyme_C，E值 2.3e-45）（圖2）；InterPro分析顯示 CeALS主要參與分支氨基酸的生物合成（GO：0009082），具有TPP結(jié)合（GO：0030976）、FAD結(jié)合（GO：0050660）、Mg2+結(jié)合（GO：0000287）、催化活性（GO：0003824）和乙酰乳酸合酶活性（GO：0003984）等分子功能。

表1 擬南芥和20種單子葉植物中ALS基因的結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白的理化特性Table 1 Gene structure and physicochemical properties of ALS genes in Arabidopsis and 20 monocots

2.3.2 SNP分析 如圖3所示，序列比對(duì)表明至今已報(bào)道可引起除草劑抗性改變的8個(gè)位點(diǎn)在CeALS與AtALS間完全一致。為進(jìn)一步摸清研究組收集的其他種質(zhì)是否存在相關(guān)抗性變異，我們對(duì)其進(jìn)行了基因組重測(cè)序，并從中獲得30個(gè)SNP（表2），深入分析顯示他們僅造成了4個(gè)氨基酸的變異，即Lys211Gln、Leu538Val、Asp568Asn 和 Ser591Ala。

表2 SNP分布情況Table 2 Distribution of SNPs

圖3 CeALS蛋白的多序列比對(duì)和序列特征Fig.3 Multiple sequence alignment and sequence features of CeALS protein

2.3.3 進(jìn)化分析 同源分析顯示，NCBI中至今僅報(bào)道了CeALS 716 bp的部分編碼區(qū)序列（序列號(hào)KM624613.1）；而CeALS與莎草科植物中同源蛋白的一致性都在90%以上，其中，與CbALS的一致性甚至高達(dá)94.92%。進(jìn)一步的進(jìn)化分析證實(shí)了這種結(jié)果，CeALS與CbALS聚在一起，接著是同屬的CdALS以及同科物種來(lái)源的蛋白，其次才是同目的禾本科植物；雙子葉植物擬南芥位于基部，棕櫚目的油棕（Elaeis guineensis）和椰棗（Phoenix dactylifera）、芭蕉目的香蕉、微子目的小蘭嶼蝴蝶蘭（Phalaenopsis equestris）和天南星目的紫萍（Spirodela polyrhiza）都形成獨(dú)立的分支。有意思的是，除二穗短柄草和水稻外，其他來(lái)源于同一物種的旁系同源蛋白都聚在一起，暗示他們可能通過(guò)物種特異性的基因重復(fù)產(chǎn)生（圖4）。OsALS1/OsALS2和BdALS1/BdALS2的一致性分別為75.70%和83.60%，但OsALS1/BdALS1和OsALS2/BdALS2的一致性分別為89.30%和76.60%，這表明這些重復(fù)基因在兩物種分化之前就已產(chǎn)生。

圖4 ALS蛋白的進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ALS proteins

2.4 基因的表達(dá)特性分析

圖5所示的組織表達(dá)特性分析顯示，基因在成熟和衰老葉片中的表達(dá)豐度最高，顯著高于幼嫩葉片；在塊莖中的表達(dá)豐度與幼嫩葉片相當(dāng)，顯著高于芽和芽莖。

圖5 CeALS在不同組織中的表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of CeALS in various tissues

3 討論

作為支鏈氨基酸生物合成的關(guān)鍵酶，ALS是SU、IMI、TP、PTB和SCT等除草劑的作用靶標(biāo)［3］。雖然絕大多數(shù)植物原本對(duì)這些除草劑高度敏感，但高選擇壓引起的ALS突變賦予了部分生態(tài)型的抗藥性，并且有關(guān)抗藥突變的報(bào)道與日俱增［5］。如以模式植物擬南芥的ALS作為標(biāo)準(zhǔn)分子，目前的抗性突變主要集中在A(yíng)la122等8個(gè)位點(diǎn)，他們對(duì)除草劑的種類(lèi)和抗性程度均存在較大的差異：Ala122Thr突變可產(chǎn)生IMI抗性，但對(duì)SU和PTB敏感，對(duì)于TP而言則似乎存在物種差異；Ala122Val突變產(chǎn)生SU和IMI抗性，卻對(duì)SCT、TP和PTB敏感；Ala122Asn突變則產(chǎn)生對(duì)SU、IMI、TP和PTB四類(lèi)除草劑的抗性；Pro197和Trp574是目前報(bào)道變異最多的位點(diǎn)，Pro197突變主要引起SU抗性，而Trp574突變則可造成更為廣譜的抗性（含上述5類(lèi)除草劑）；Ala205突變主要引起IMI和PTB抗性；Asp376突變可引起5類(lèi)除草劑的抗性，但抗性程度物種差異較大；Asp376His突變可引起SU、TP和SCT抗性；Ser653突變主要引起IMI和SCT抗性；Gly654突變可引起SU、IMI和SCT抗性，但對(duì)PTB敏感［4-5］。在莎草科中，至今已有7種植物發(fā)現(xiàn)抗藥性，即螢藺、沼澤蘆葦、短葉水蜈蚣、異花莎草（Cyperus difformis）、碎米莎草（Cyperus iria）、扁穗莎草（Cyperus compressus）和油莎豆［10-12，21-24］。螢藺至少含有 2個(gè) ALS基因，均含有一個(gè)內(nèi)含子，其任一拷貝的Pro197His/Ser/Leu突變都可賦予SU抗性，而其對(duì)SU、IMI和PTB的抗性則為SjALS2的Trp574Leu突變引起［21］；此外，SjALS2的Asp376Glu突變可引起高水平的SU和PTB抗性以及低水平的IMI抗性［23］。沼澤蘆葦至少含有3個(gè)ALS基因，SmALS1和SmALS2包含1個(gè)內(nèi)含子，而SmALS3則無(wú)內(nèi)含子；作為主要表達(dá)的基因，SmALS1編碼蛋白的Pro197His和Trp574Leu均可引起抗藥性［22］。短葉水蜈蚣、異花莎草、扁穗莎草和碎米莎草可能僅編碼一個(gè)ALS基因，其在短葉水蜈蚣中含有1個(gè)內(nèi)含子，Pro197His/Ser/Ala突變是前3者抗藥性產(chǎn)生的原因，而Trp574Leu突變則是碎米莎草抗藥性產(chǎn)生的原因，這與油莎豆類(lèi)似［10-12，24-25］。

研究基于實(shí)驗(yàn)室前期獲得的油莎豆全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，首次完成了CeALS全長(zhǎng)cDNA的克隆。為便于進(jìn)化和比較分析，研究同時(shí)還從14個(gè)已完成基因組測(cè)序的代表性單子葉植物中鑒定到19個(gè)同源基因，其中，基因以單拷貝居多，約占64.29%。在含有2個(gè)拷貝的5種植物中，康藏嵩草隸屬于禾本目莎草科，二穗短柄草、水稻和玉米屬于禾本目禾本科，香蕉屬于芭蕉目；康藏嵩草的2個(gè)拷貝均含有1個(gè)內(nèi)含子，這與其他莎草科的螢藺、沼澤蘆葦、豬毛草和短葉水蜈蚣一致，而另外4種植物的2個(gè)拷貝均無(wú)內(nèi)含子，這與擬南芥和其他多數(shù)單子葉植物一致，暗示莎草科植物ALS基因的內(nèi)含子可能是在科分化后獲得，屬于莎草科特異的，而無(wú)內(nèi)含子的SmALS3可能通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生［22］。事實(shí)上，將克隆到的CeALS轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到油莎豆的基因組也證實(shí)該物種同樣也含有1個(gè)內(nèi)含子。與康藏嵩草、螢藺、沼澤蘆葦和豬毛草不同的是，油莎豆僅含有1個(gè)拷貝，暗示油莎豆在莎草科的分化過(guò)程沒(méi)有經(jīng)歷多倍化事件或者基因加倍后又發(fā)生了丟失。

基于葉綠體基因的進(jìn)化分析顯示油莎豆可歸為禾本目［26］。然而，前期的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與分析顯示，在獲得的57 849條高質(zhì)量序列中，除將近30%的注釋為禾本科植物外，另有約40%的被注釋為油棕和椰棗［8］。為進(jìn)一步揭示油莎豆的分類(lèi)學(xué)地位，研究利用ALS蛋白構(gòu)建了包括擬南芥在內(nèi)的21種植物的無(wú)根進(jìn)化樹(shù)。與前期分類(lèi)學(xué)一致的是，擬南芥位于進(jìn)化樹(shù)的基部，天南星目、微子目、芭蕉目、棕櫚目和禾本目都形成獨(dú)立的分支。隸屬于粉狀胚乳目的菠蘿（Ananas comosus）雖然與禾本目聚在一支，但主要原因可能與低樣本量有關(guān)，適當(dāng)增加粉狀胚乳目的物種數(shù)有望較好解決上述問(wèn)題。在禾本目分支中，進(jìn)化樹(shù)明顯支持莎草科與禾本科的姊妹科關(guān)系。

研究克隆到的CeALS編碼645個(gè)氨基酸，其理論分子量為69.94 kD、等電點(diǎn)為6.10、脂肪族指數(shù)為89.36、總平均疏水指數(shù)為-0.156，屬于葉綠體定位的親水性蛋白，這與其他物種類(lèi)似。CeALS蛋白含有乙酰乳酸合酶特有的PLN02470結(jié)構(gòu)域，其中 包 含TPP_enzyme_N、TPP_enzyme_M和TPP_enzyme_C三個(gè)完整的功能域，可與TPP、FAD和Mg2+三種輔助因子結(jié)合。序列比對(duì)和SNP分析證實(shí)，熱研1號(hào)及本團(tuán)隊(duì)收集的其他55份種質(zhì)不存在抗藥性突變，這與生產(chǎn)實(shí)踐中ALS抑制劑可高效殺死這些種質(zhì)是一致的。根據(jù)表達(dá)分析結(jié)果，CeALS的表達(dá)水平隨著葉片的發(fā)育而顯著增加；值得注意的是，CeALS在塊莖中的表達(dá)豐度與幼嫩葉片相當(dāng)，暗示其在該組織的分支氨基酸積累中可能起著重要的作用。

4 結(jié)論

完成了油莎豆參與支鏈氨基酸合成的CeALS基因的克隆、序列特征、進(jìn)化及表達(dá)特性分析，較好地揭示了油莎豆的分類(lèi)學(xué)地位，同時(shí)也證實(shí)團(tuán)隊(duì)收集的56份油莎豆種質(zhì)不存在抗藥性變異。