番茄4CL基因家族鑒定和氮素處理下的表達(dá)分析

馬馨馨 許洋 趙歡歡 火兆燕 王樹彬 鐘鳳林

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002）

番茄（Solanum lycopersicum L.）深受人們喜愛，但在種植過程中，各種生物脅迫及干旱、鹽堿、肥料等非生物脅迫都會對番茄的生長發(fā)育造成不良影響，進(jìn)而影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量。在實驗室前期的研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度的氮素處理下番茄葉片苯丙烷生物合成通路的最終產(chǎn)物多酚、類黃酮和木質(zhì)素等物質(zhì)含量具有顯著性差異。氮素處理下，飛機(jī)草［1］、小麥［2］、香蕉［3］等作物的木質(zhì)素、類黃酮等均會發(fā)生相應(yīng)的變化，從而進(jìn)一步影響植株生長與防御以及不同次生代謝物合成途徑之間的分配，以此來增加病蟲害的抵御能力［4-5］。苯丙烷代謝途徑是植物體內(nèi)重要的次生代謝途徑之一，每個細(xì)胞中至少有20% 的代謝途徑以此為基礎(chǔ)，其最終可以生成參與植物防御反應(yīng)的酚類、類黃酮、和生物堿等，使植物對外界環(huán)境具有一定的抵抗性［6-9］。4香豆酸輔酶A連接酶（4CL）是苯丙烷生物合成通路中起關(guān)鍵作用的催化酶，作用于苯丙烷生物合成途徑的最后一步，將各種羥基肉桂酸（香豆酸、咖啡酸和阿魏酸）催化為相應(yīng)的硫酯，進(jìn)一步調(diào)控木質(zhì)素、類黃酮、多酚等次生代謝物質(zhì)的合成［10-13］。因此，對苯丙烷生物合成途徑的關(guān)鍵基因4CL基因家族進(jìn)行生信分析，初步探究番茄4CL基因家族成員的作用機(jī)理至關(guān)重要。

本研究通過生信分析，對番茄4CL基因家族成員進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序、啟動子順式作用元件以及進(jìn)化樹的分析，以期闡明番茄4CL家族成員的理化性質(zhì)與基本功能，同時在不同濃度氮素處理下檢測其家族成員的表達(dá)量，進(jìn)一步探究不同濃度氮素對4CL基因家族成員表達(dá)量的影響，為苯丙烷生物合成通路關(guān)鍵基因4CL響應(yīng)氮素調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為‘Micro Tom’番茄。采用穴盤育苗，待幼苗長至5葉1心時，進(jìn)行水培緩苗，緩苗3 d后采用霍格蘭營養(yǎng)液配方進(jìn)行水培，其中控制氮素的濃度分別為：5.6 mg/L、22.4 mg/L、112 mg/L（正常氮素濃度）、224 mg/L、336 mg/L，每3 d更換一次營養(yǎng)液，在第9天進(jìn)行相關(guān)試驗。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)下載與番茄4CL基因家族成員鑒定與命名 利用番茄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲取4CL基因家族成員，將所獲成員與Ensembl數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)下載的番茄數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，最終確定番茄4CL基因家族成員。文中所使用的擬南芥數(shù)據(jù)和水稻數(shù)據(jù)均從UniProt數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)（https://www.uniprot.org/）下載。參考已公布的其他物種對4CL基因的命名方式，本研究將這類基因統(tǒng)稱為“4CL”，其前綴加上代表物種的特異性字母，根據(jù)基因座位置將番茄4CL基因命名為“Sl4CL”。

1.2.2 番茄4CL基因家族成員理化性質(zhì)分析 利用在線網(wǎng)站對番茄4CL基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析。其中Expasy網(wǎng)站（https://web.expasy.org）分析氨基酸分子量、等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、親疏水性、原子總數(shù)；NovoPro網(wǎng)站（https://www.novopro.cn）進(jìn)行蛋白信號肽的預(yù)測；Cell-PLoc 2.0（www.csbio.sjtu.edu.cn）進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測。

1.2.3 番茄4CL基因家族成員二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr）進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用Swiss-model（https://swissmodel.expasy.org）進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 番茄4CL基因家族成員染色體定位分析 利用Ensembl數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)獲得番茄4CL基因家族成員的位置信息，利用Tbtools進(jìn)行作圖。

1.2.5 番茄4CL基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析 利用Tbtools軟件分析番茄4CL基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)（內(nèi)含子和外顯子）信息，利用NCBI的Batch CD-Search獲取Moain進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域的分析，利用MEME網(wǎng)站（https://meme-suite.org）設(shè)定搜索15個Motif，獲取番茄4CL不同成員氨基酸序列的Motif，利用Tbtools工具進(jìn)行作圖。

1.2.6 番茄4CL基因家族成員的進(jìn)化樹分析 利用MEGA7軟件對番茄、擬南芥、水稻的4CL基因家族做多序列比對，采用臨近法（NJ）Boostrap=1 000進(jìn)一步構(gòu)建進(jìn)化樹，利用iTOL網(wǎng)頁（https://itol.embl.de/itol.cgi）進(jìn)行進(jìn)化樹的美化。

1.2.7 番茄4CL基因家族成員啟動子順式作用原件分析 利用Tbtools從番茄基因組數(shù)據(jù)庫中獲取啟動子（ATG）上游2 000 bp的序列，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）獲取啟動子TF結(jié)合位點的信息，利用PlantTFDB（http://planttfdb.gao-lab.org/prediction.php）獲得啟動子順式作用元件信息，最后利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計和作圖。

1.2.8 番茄4CL基因家族成員在氮素脅迫下的表達(dá)分析 在水培第9天分別取樣進(jìn)行RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量的測定。對番茄葉片進(jìn)行RNA提取的試劑盒購于上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于天根生化科技（北京）有限公司；熒光定量試劑盒購買于諾唯贊生物科技股份有限公司。引物（表1）由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成。以Actin為內(nèi)參基因?qū)Φ靥幚硐碌?CL基因的表達(dá)量進(jìn)行驗證，每個處理3個重復(fù)，根據(jù)單內(nèi)參算法2-ΔΔCt計算4CL基因的相對表達(dá)量，運用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 PCR所用到的引物Table 1 Primers for PCR

1.2.9 番茄Sl4CL03過表達(dá)載體的構(gòu)建 利用DANMAN8軟件設(shè)計基因上下游引物，加上pCAMBIA-1302載體接頭（F：GGACTCTTGACCATGG；R：CTTCTCCTTTACTAGT），進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增，反應(yīng)體系為 25 μL：2×Phanta Max Buffer 12.5 μL；dNTP Mix 0.5 μL ；Phanta Max Super Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL ；上游引物和下游引物各 1 μL ；cDNA 1 μL；ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min 40 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。利用賽默飛世爾科技公司的NcoI和BcuI酶將pCAMBIA1302質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用諾唯贊生物科技股份有限公司的ClonExpress? II One Step Cloning Kit試劑將其與pCAMBIA1302線性化載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)，涂板倒置37℃培養(yǎng)12 h，挑單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR，將陽性菌落大搖提質(zhì)粒送福州鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。將重組質(zhì)粒通過凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.10 番茄Sl4CL03蛋白的亞細(xì)胞定位 將農(nóng)桿菌菌液在5 000 r/min離心3 min，去掉上清，用一定體積的重懸液重懸沉淀，使OD600nm=0.6-0.8，靜置3 h，用1 mL注射器輕輕抵在煙草葉片背部，避開葉脈進(jìn)行注射，避光12 h，24 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光。用含有pCAMBIA1302空載的農(nóng)桿菌作為對照。

2 結(jié)果

2.1 番茄4CL基因家族成員鑒定和理化性質(zhì)分析

蛋白的理化性質(zhì)分析可以了解蛋白質(zhì)的特性，對番茄4CL基因家族進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析，結(jié)果如表2所示，6個家族成員氨基酸個數(shù)在538和957之間，分子量為58 930.46-102 255.02，有5個氨基酸的等電點小于7，為酸性氨基酸，僅有Sl4CL05為堿性氨基酸。6個基因的不穩(wěn)定指數(shù)均小于40，均為穩(wěn)定蛋白，且在6個基因中均無檢測出信號肽。此外，6個基因中有4個為疏水氨基酸，在亞細(xì)胞定位中預(yù)測到6個基因均在過氧化物酶體中表達(dá)，但Sl4CL01除了在過氧化物酶體外還可以在葉綠體中表達(dá)。6個家族成員均無信號肽。

表2 番茄4CL基因家族蛋白理化性質(zhì)Table 2 Physico-chemical properties of 4CL family proteins in tomato（Solanum lycopersicum）

2.2 番茄4CL基因家族二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)的序列結(jié)構(gòu)可以反映蛋白的功能，為蛋白三級結(jié)構(gòu)模式奠定基礎(chǔ)，對番茄4CL蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析（表3）發(fā)現(xiàn)，番茄4CL蛋白二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲四部分構(gòu)成，其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例最大，分別為30.67%-41.69%和34.8%-42.28%，接下來依次為延伸鏈（15.57%-20.71%）和β-轉(zhuǎn)角（6.84%-9.01%）。在二級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析三級結(jié)構(gòu)（圖1），結(jié)構(gòu)表明Sl4CL01、Sl4CL02、Sl4CL03、Sl4CL05和Sl4CL06均以5bsr.1.A為模型，其相似度 分 別 為 63.02%、89.29%、91.13%、40.68%和81.48%，僅Sl4CL04以5bsw.1.A為模型，相似度為37.07%。

圖1 番茄4CL基因家族三級結(jié)構(gòu)Fig.1 Tertiary structure of tomato 4CL gene family

表3 番茄4CL基因家族二級結(jié)構(gòu)Table 3 Secondary structure of tomato 4CL gene family

2.3 番茄4CL基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育分析

為更好的探究番茄4CL基因家族的發(fā)展，用番茄4CL基因家族的6條基因，擬南芥的20條基因，水稻的7條基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示33條4CL基因共分為三大亞族，番茄4CL基因均在第Ⅲ亞族，番茄Sl4CL01與擬南芥At1g65060、水稻Os02g46970親緣性較近，Sl4CL05與At4g05160，Sl4CL04與At4g19010均具有較近的親緣關(guān)系，Sl4CL01、Sl4CL02和Sl4CL06與擬南芥的At3g21240、At1g51540親緣性較近，且三者相互之間具有較高的同源性，而第 I和第 II亞族的水稻、擬南芥和番茄4CL的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 番茄、擬南芥和水稻4CL基因家族成員系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 4CL gene family in Solanum lycopersicum，Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.4 番茄4CL基因家族成員染色體定位分析

對番茄4CL基因家族進(jìn)行染色體定位分析，結(jié)果如圖3所示：6條基因共分布到5條染色體上，數(shù)量最多的是3號染色體，共有2條基因，分別為Sl4CL01和Sl4CL02。剩余4條基因分別位于6號、8號、11號、12號染色體上。在染色體的定位圖上可以發(fā)現(xiàn)4CL基因多分布于染色體的3′端，且所有的染色體上均無基因簇存在。

圖3 番茄4CL基因家族成員染色體定位Fig.3 Localization of 4CL in chromosomes of tomato

2.5 番茄4CL基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步分析番茄4CL基因家族的基因結(jié)構(gòu)特征，了解其生物學(xué)功能，對番茄的6條基因進(jìn)行相關(guān)內(nèi)含子、外顯子的分析。結(jié)果如圖4所示，所有4CL基因的核苷酸序列基本可以分為3個部分：內(nèi)含子、外顯子以及UTR區(qū)。所有基因序列的第一個內(nèi)含子均位于成熟編碼序列內(nèi)部，有利于區(qū)別信號序列和編碼序列。番茄4CL基因家族中4個成員具有5個內(nèi)含子，Sl4CL02和Sl4CL04分別有6個內(nèi)含子和11個內(nèi)含子，且Sl4CL02無3′端UTR。利用MEME網(wǎng)頁，采用15個Motif對基因序列進(jìn)行蛋白質(zhì)保守基序分析，6個家族成員里Motif的個數(shù)為 11-14，且 Sl4CL01、Sl4CL02、Sl4CL03和Sl4CL06的Motif排列順序較為固定，均為Motif5、7、11、12、3、13、8、10、6、4、1、2， 但 是 在Sl4CL02的3′端具有Motif15，說明其均有高度的保守性。Sl4CL04的5′端具有Motif15基序，3′端缺少了Motif9，在Motif7和Motif3之間缺少了Motif11和Motif12，由Motif14代替了Motif6，在Sl4CL05的Motif7和Motif12之間缺少了Motif11，Motif3和Motif8之間缺少了Motif13，同時和Sl4CL04一樣由Motif14代替了Motif6。但是在所有的成員中均發(fā)現(xiàn)了AMP-binding enzyme。番茄4CL家族成員中共有5個結(jié)構(gòu)域，其中PLN02246最多，分別存在于Sl4CL01、Sl4CL02、Sl4CL03和Sl4CL06中，但只有Sl4CL02的3′端有2個IBR結(jié)構(gòu)域。Sl4CL04的結(jié)構(gòu)域為AFD-class-I superfamily，Sl4CL05的結(jié)構(gòu)域為4CL。此外，我們發(fā)現(xiàn)，4CL基因家族中的結(jié)構(gòu)域成員為單個結(jié)構(gòu)域的占66.7%（4條），通過上述結(jié)果，我們猜測番茄4CL基因家族具有較高的脅迫響應(yīng)機(jī)制。

圖4 番茄4CL基因家族基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域分布分析Fig.4 Gene structure and conserved domain analysis of 4CL gene family in tomato

2.6 番茄4CL基因家族成員啟動子順式作用元件分析

獲取番茄4CL基因家族成員起始密碼子ATG上游2 000 bp序列對啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點進(jìn)行預(yù)測以及對環(huán)境脅迫和激素調(diào)控的TF結(jié)合位點分析，鑒定參與多重脅迫的順式作用元件，結(jié)果（圖5）顯示4CL家族共檢測出19種核心啟動子原件，分別為AP2、ARF、BBR-BPC、bHLH、bZIP、C2H2、CPP、Dof、E2F/DP、GATA、HD-ZIP、HSF、MIKC_MADS、MYB、MYB_related、NAC、NF-YB、Trihelix和WRKY，其中MYB的含量最多，共有80個，占所有作用元件的36.1%，接下來分布最多的依次是Dof、MIKC_MADS，分別為49個和20個，HDZIP、HSF、MYB_related和Trihelix次之，數(shù)量均為2個。數(shù)量最少的為ARF、BBR-BPC、CPP、E2F/DP、GATA和NF-YB，均為1個。對番茄4CL基因家族進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)4CL基因家族在光照、干旱、防御和應(yīng)激反應(yīng)、晝夜節(jié)律、厭氧誘導(dǎo)；脫落酸、生長素、赤霉素、茉莉酸；胚乳表達(dá)、玉米醇溶蛋白代謝等方面均可以產(chǎn)生響應(yīng)，6個基因家族成員均可以對光照進(jìn)行響應(yīng)，且在Sl4CL03中具有9個光響應(yīng)的元件，防御和應(yīng)激反應(yīng)在Sl4CL01發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)水楊酸的元件僅在Sl4CL02中發(fā)現(xiàn)，胚乳表達(dá)僅在Sl4CL03中發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律控制僅在Sl4CL04中發(fā)現(xiàn)，玉米醇溶蛋白代謝僅在Sl4CL05中發(fā)現(xiàn)，其他順式作用元件則會在2個以上基因中發(fā)現(xiàn)。

圖5 番茄4CL基因家族啟動子順式調(diào)控元件類型和數(shù)量Fig.5 Type and number of cis-regulatory elements in the promoter of tomato 4CL gene family

2.7 氮素處理下番茄4CL基因的表達(dá)量分析

由圖6可知，6個4CL基因在不同濃度的氮素處理下均呈現(xiàn)出差異表達(dá)，其中Sl4CL01、Sl4CL03、Sl4CL04和Sl4CL05隨著氮素濃度的升高而升高，四者均在氮素濃度224 mg/L時表達(dá)量最高，到氮素濃度為336 mg/L時顯著下降，但與其他3個處理存在明顯的差異，說明Sl4CL02基因在氮素濃度過高時能促進(jìn)其表達(dá)，對氮素脅迫具有較強(qiáng)的抵抗能力。Sl4CL06基因在低氮（22.4 mg/L）和高氮（224 mg/L）處理下表達(dá)量均顯著高于5.6 mg/L、112 mg/L和336 mg/L，說明其基因在受到高、低濃度的氮素脅迫均能夠提高表達(dá)量。以上分析表明6個番茄4CL基因?qū)Ρ奖樯锖铣捎酗@著的影響。

圖6 番茄4CL基因在不同濃度氮素下的表達(dá)模式Fig.6 Expression patterns of tomato 4CL genes under different concentrations of nitrogen

2.8 Sl4CL03蛋白的亞細(xì)胞定位分析

以番茄葉片cDNA為模板，擴(kuò)增得到Sl4CL03的CDs全長1 683 bp（圖7-A），將目的基因膠回收后與pCAMBIA1302線性化載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑選單克隆菌落利用基因上游引物和載體下游引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果符合試驗預(yù)期，說明載體構(gòu)建成功。將含有重組載體的農(nóng)桿菌注射煙草葉片觀察亞細(xì)胞定位，結(jié)果（圖8）表明：轉(zhuǎn)入pCAMBIA1302空載的對照組GFP熒光信號在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上均可觀察到，pCAMBIA1302-35S-Sl4CL03-GFP融合蛋白可以在過氧化物酶體、細(xì)胞膜中進(jìn)行表達(dá)，此外，綠色熒光信號與葉綠體自發(fā)產(chǎn)生的紅色熒光信號重疊，說明Sl4CL03還可以在葉綠體中進(jìn)行表達(dá)。

圖7 Sl4CL03基因的克?。ˋ）及Sl4CL03基因大腸桿菌菌液PCR（B）Fig.7 Cloning of Sl4CL03 gene（A）and Escherichia coli bacteria liquid PCR of Sl4CL03 gene（B）

圖8 Sl4CL03蛋白在煙草葉片細(xì)胞的亞細(xì)胞定位Fig.8 Subcellular localization of Sl4CL03 in Nicotiana tabacum leaf cells

3 討論

3.1 番茄4CL基因家族成員的分子特性

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，4CL基因家族成員已在毛竹［14］、龍眼［15］、苧麻［16］、柑橘［17］、煙草［18］、梨［19］、苜蓿［20］、陸地棉［21］等作物中有一定的研究，碭山酥梨4CL基因家族被鑒定出29個成員，陸地棉基因組中被鑒定到34個成員，龍眼體胚被鑒定出43個成員，煙草中被鑒定出20個成員，但是在番茄的轉(zhuǎn)錄組中僅鑒定出6個4CL基因家族成員，這說明了在不同物種間4CL基因家族數(shù)目確實存在較大差異。一個物種中4CL基因家族核酸的分化有效地防止了交叉雜交，特異性表達(dá)模式和低信使豐度有效地阻止了基因家族的鑒定，甚至人們幾乎知道擬南芥全部基因組序列，但4CL基因家族的真正范圍仍未可知［22］。

根據(jù)4CL基因家族所編碼蛋白的功能可以將其分為兩組：Class I和Class II，其中Class I與木質(zhì)素合成有關(guān)，Class II與類黃酮的生物合成有關(guān)［23］，將番茄的4CL基因家族與擬南芥、水稻的進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)番茄的6個家族成員均在同一大類中，說明其6個成員在番茄的生長發(fā)育過程中可能存在功能冗余但并不明晰其所編碼蛋白的功能。對蛋白Motif進(jìn)一步分析表明，所有的成員中都發(fā)現(xiàn)了Box I（AMP-binding enzyme結(jié)構(gòu)域），所有已知的4CL氨基酸序列中BoxI（SSGTTGLPKGV）在4CL蛋白質(zhì)序列中絕對保守，編碼AMP-binding enzyme結(jié)構(gòu)域的基序是決定這些蛋白功能的主要結(jié)構(gòu)域，同時Box I作為底物結(jié)合區(qū)域（SBP）參與了底物的識別［22］。此外，所有成員中也發(fā)現(xiàn)了作為酶催化位點的BoxII，多肽序列BoxII（GEICIRG）在所有4CL中絕對保守，其中心的Cys殘基被認(rèn)為直接參與催化，說明4CL家族成員均可以直接參與催化反應(yīng)。

3.2 番茄4CL基因家族功能的分析

4CL基因在植物的生長發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，在植物的不同部位以及不同時期具有不同的表達(dá)模式。有研究表明boxP（CCTTCACCAACCCCC）、boxA（CCGTTC）、boxL（TCTCACCAACC） 這3個是決定木質(zhì)部特異性定位表達(dá)所必須的調(diào)控元件，在對番茄4CL基因家族啟動子順式作用元件分析時發(fā)現(xiàn)，Sl4CL02中含有boxL（TCTCACCAACC）的結(jié)合位點MYB，Sl4CL03中含有boxA（CCGTTC），而在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)這兩個成員的同源性較近，因此，推測這兩個基因可能會在木質(zhì)部特異性表達(dá)。沈晚霞［17］對柑橘的3個4CL家族成員研究發(fā)現(xiàn)其均在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，灰氈毛忍冬的兩個4CL基因分別在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體類囊體進(jìn)行表達(dá)，馬鈴薯中的4CL主要分布在葉綠體的類囊體膜上，說明4CL基因在不同植物中可以在不同部位進(jìn)行表達(dá)［24-25］。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，所有番茄4CL家族成員在過氧化物酶體中進(jìn)行表達(dá)，通過煙草瞬時轉(zhuǎn)化對Sl4CL03蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位驗證，發(fā)現(xiàn)除了在過氧化物酶體還可以在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中進(jìn)行表達(dá)。過氧化物酶體存在于一切真核細(xì)胞內(nèi)，含有豐富的酶類，可以調(diào)節(jié)氧濃度、氧化脂肪酸、參與氮物質(zhì)的代謝，這很好的說明了番茄4CL可以對氮素進(jìn)行響應(yīng)，在不同濃度氮素的處理下，4CL基因家族成員表達(dá)量均發(fā)生明顯的差異，同時定位于葉綠體也表明Sl4CL03蛋白在番茄中可以進(jìn)行光響應(yīng)，這與啟動子順式作用元件的結(jié)果相一致。

番茄4CL基因家族成員具有不同種類和數(shù)目的作用元件，從而導(dǎo)致不同成員間功能的差異性和復(fù)雜性。該家族可以響應(yīng)多種植物激素元件、光響應(yīng)元件，這些對植物的生長發(fā)育和生殖發(fā)育具有調(diào)控作用，湯崴［26］、王星淇［27］、Park 等［28］分別對葡萄、非洲菊、柳樹進(jìn)行研究，結(jié)果均表明4CL基因在不同部位具有不同的表達(dá)量。此外，番茄4CL基因家族還有較多的防御和應(yīng)激作用元件，這與植物抵抗非生物脅迫能力有著直接或間接的關(guān)系。Muna Alariqi［29］研究發(fā)現(xiàn)，Gh4CL3超表達(dá)株系對真菌的抗性增強(qiáng)，Sun Shichao的研究發(fā)現(xiàn)陸地棉Gh4CL7基因在耐干旱脅迫中起著積極的作用，擬南芥At4CL基因的表達(dá)也可被創(chuàng)傷、紫外線、致病菌感染等脅迫所激活［21，30-31］。在本試驗中不同濃度氮素處理下4CL家族成員產(chǎn)生了顯著的變化表明4CL基因家族可以對氮素脅迫進(jìn)行響應(yīng)。

4 結(jié)論

從番茄全基因組中共鑒定出6個番茄4CL家族成員，不同成員間具有較高的同源性。在不同濃度氮素處理下，所有成員表達(dá)量均具有顯著性差異，對Sl4CL03蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其可以在過氧化物酶體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行表達(dá)，4CL基因家族在番茄的生長發(fā)育過程中具有重要的作用。