甘藍(lán)型油菜BnNF-YA1的克隆和功能鑒定

林科運(yùn) 段鈺晶 王高升 孫念禮 方玉潔 王幼平

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 2250009）

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）屬于十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）［1］，其不同部位具有不同的經(jīng)濟(jì)價(jià)值：油菜籽的出油率高，可作為食用油；油菜本身也含有大量蛋白質(zhì)，是動(dòng)物飼料重要來(lái)源；除此之外，發(fā)達(dá)國(guó)家也會(huì)利用油菜制成生物柴油來(lái)取代部分化石燃料［2-5］。我國(guó)油菜的種植面積和總產(chǎn)量均居世界前列，然而我國(guó)人口眾多，對(duì)菜籽油的需求量日趨增大，導(dǎo)致我國(guó)菜籽油每年的進(jìn)口量不斷上升［6］。近年來(lái)，全球生態(tài)環(huán)境持續(xù)惡化，自然災(zāi)害頻發(fā)，包括干旱、高鹽、極端溫度等在內(nèi)的環(huán)境脅迫對(duì)油菜的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重威脅［7］，使得我國(guó)食用油供求不平衡的狀況日益嚴(yán)峻。因此，挖掘油菜逆境應(yīng)答相關(guān)遺傳資源、提高油菜抗逆性對(duì)于油菜生產(chǎn)具有重要意義。

為更好地適應(yīng)不利的環(huán)境條件并得以生存，植物在進(jìn)化歷程中形成了一套完整且復(fù)雜的逆境應(yīng)答機(jī)制，植物在響應(yīng)非生物脅迫的過(guò)程中涉及多個(gè)層面的基因表達(dá)調(diào)控，包括激素調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)以及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)逆境相關(guān)基因等［8-10］。前人研究表明，MYB、AP2/ERF、bZIP、Zinc finger、NAC、WRKY、NF-Y等轉(zhuǎn)錄因子家族在植物逆境應(yīng)答調(diào)控中發(fā)揮著重要作用［11］。植物核因子Y（nuclear factor Y，NF-Y）類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)結(jié)構(gòu)保守的三聚體復(fù)合物，由NF-YA、NF-YB和NF-YC三亞基組成，對(duì)CCAAT-box元件具有高度特異性和高度親和力［12-13］。NF-YA的核心保守區(qū)域包含大約56個(gè)氨基酸［14］，可分成2個(gè)結(jié)構(gòu)域以及中間的連接區(qū)，其中一個(gè)A1結(jié)構(gòu)域是由20個(gè)氨基酸形成的α螺旋，位于蛋白N端，是與NF-YB/NF-YC互作所必需的；另一個(gè)A2結(jié)構(gòu)域位于蛋白C端，是由21個(gè)氨基酸組成的α螺旋，可以特異性結(jié)合啟動(dòng)子序列上的CCAAT-box［15］。NF-YB 亞基存在與 H2A 結(jié)構(gòu)域極相似的組蛋白折疊模體（histone fold motif，HFM），該區(qū)域由3個(gè)α螺旋和2個(gè)β鏈組成，以α1-β1-α2-β2-α3排列順序組成，α1主要負(fù)責(zé)與 CCAAT附近的DNA骨架結(jié)合，α2、α3區(qū)域與NF-YC結(jié)合形成二聚體，NF-YC的結(jié)構(gòu)特征與NF-YB相似［16］。NF-Y復(fù)合體在行使功能時(shí)，NF-YB亞基和NF-YC亞基通過(guò)組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域（histone folding domain，HFD），采用從頭到尾的組裝方式［17］，在細(xì)胞質(zhì)中先形成異源二聚體，隨后遷移到細(xì)胞核中與NF-YA亞基結(jié)合形成完整的異源三聚體，A2結(jié)構(gòu)域?qū)⒗肁1和A2之間的連接螺旋在DNA上滑動(dòng)，尋找CCAAT-box序列，隨后NF-YA插入到DNA雙螺旋的小溝中，DNA發(fā)生彎曲，使得其他轉(zhuǎn)錄因子更容易結(jié)合到DNA雙螺旋的大溝，進(jìn)而調(diào)控下游的靶基因［18-20］。NF-YA、NF-YB和NF-YC亞基自身也可以單獨(dú)行使特定的功能［21］。

近年來(lái)，NF-YA在各種植物中的功能逐漸被挖掘，研究發(fā)現(xiàn)，NF-YA轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物對(duì)各種生物與非生物脅迫應(yīng)答以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。擬南芥NF-YA5受干旱脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)AtNF-YA5使轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片的氣孔孔徑變小、失水速率降低，同時(shí)激活脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，增加了擬南芥的抗旱性［22］。水稻OsNF-YA7受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，而不受脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)OsNF-YA7能夠提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性，說(shuō)明OsNF-YA7通過(guò)不依賴(lài)ABA的方式介導(dǎo)水稻的耐旱性調(diào)控［23］。棉花GhNF-YA10和GhNF-YA23受鹽脅迫、干旱脅迫和ABA處理誘導(dǎo)表達(dá)，在棉花中利用VIGS技術(shù)對(duì)GhNF-YA10和GhNF-YA23進(jìn)行沉默導(dǎo)致棉花幼苗在鹽脅迫條件下萎黃、耐鹽性顯著性降低［24］。大豆GmNF-YA3受ABA、PEG、NaCl和冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，過(guò)表達(dá)GmNF-YA3的轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性增強(qiáng)，而對(duì)鹽脅迫和ABA處理的敏感性增強(qiáng)［25］。GmNF-YA5在大豆的21個(gè)NF-YA基因中轉(zhuǎn)錄水平最高，過(guò)表達(dá)GmNF-YA5的轉(zhuǎn)基因大豆耐旱性增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因植株中ABA依賴(lài)型和ABA非依賴(lài)型基因表達(dá)水平升高，暗示著其能通過(guò)依賴(lài)和不依賴(lài)ABA的途徑介導(dǎo)大豆耐旱性調(diào)控［26］。研究者從耐鹽小麥品種SR3中鑒定到TaNF-YA10-1，組成型表達(dá)TaNF-YA10-1的擬南芥植株對(duì)鹽脅迫的敏感性提高，而耐旱性增強(qiáng)，說(shuō)明其在應(yīng)答干旱和鹽脅迫中的功能是相對(duì)獨(dú)立的［27］。Lian等［28］將毛果楊 PtNF-YA9在擬南芥中過(guò)表達(dá)獲得OxPtNA9材料，OxPtNA9株系在萌發(fā)階段對(duì)模擬干旱、ABA和鹽脅迫表現(xiàn)出敏感性，萌發(fā)后生長(zhǎng)停滯，而在苗期則通過(guò)促進(jìn)氣孔關(guān)閉、提高水分利用效率、減少失水表現(xiàn)出對(duì)干旱的耐受性增強(qiáng)；與對(duì)照相比，OxPtNA9系在含有NaCl的1/2 MS培養(yǎng)基中表現(xiàn)出較長(zhǎng)的初生根，在土培條件下也表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鹽性，說(shuō)明PtNF-YA9采取一種馴化策略來(lái)應(yīng)對(duì)不利的環(huán)境條件。甜橙CsNF-YA5在葉片和根系中對(duì)缺水的應(yīng)答表現(xiàn)出差異，在煙草中過(guò)表達(dá)CsNF-YA5能夠使轉(zhuǎn)基因植株在脫水條件下減少H2O2的產(chǎn)生，并在正常和干旱脅迫條件下提高植株的生長(zhǎng)和光合速率，這些生理生化反應(yīng)有助于甜橙應(yīng)對(duì)短期土壤缺水的環(huán)境［29］。除了調(diào)控植物對(duì)脅迫環(huán)境的應(yīng)答，NF-YA還被報(bào)道參與調(diào)控植物的根系發(fā)育［30］、開(kāi)花［31］、胚胎和種子發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程［32-33］。

NF-YA生物學(xué)功能的多樣性引起了學(xué)者們廣泛的關(guān)注，目前，研究者們已陸續(xù)在大豆、擬南芥、小麥、馬鈴薯、玉米等植物中鑒定出許多NF-YA家族成員［34-37］。前人對(duì)甘藍(lán)型油菜中NF-Y家族成員進(jìn)行了初步鑒定和表達(dá)分析［38-39］，但油菜中關(guān)于NF-YA的功能研究尚不深入。

本研究通過(guò)克隆BnNF-YA1的編碼序列，對(duì)其序列特征和表達(dá)特性進(jìn)行分析，獲得過(guò)表達(dá)BnNFYA1的甘藍(lán)型油菜植株，并對(duì)其進(jìn)行逆境脅迫表型鑒定，為深入研究BnNF-YA1在甘藍(lán)型油菜逆境應(yīng)答中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)化受體材料為甲9712（J9712），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周永明教授惠贈(zèng)。利用已測(cè)序甘藍(lán)型油菜Darmor-bzh的cDNA樣品作為基因片段擴(kuò)增的模板。Darmorbzh及用于瞬時(shí)表達(dá)分析的本氏煙草（Nicotiana benthamiana L.）種子由揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院油菜生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

大腸桿菌感受態(tài)Trans-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase、RNA isolater Total RNA Extraction Reagent、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、重組克隆試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司。引物合成及DNA測(cè)序委托南京擎科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 BnNF-YA1的生物信息學(xué)分析 通過(guò)Protpraram（https://web.expasy.org/protparam/）對(duì) BnNF-YA1蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用Expasy（https://web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親/疏水性分析；利用Expasy的TMHMM在 線(xiàn) 軟 件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；利用軟件 Netphos（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進(jìn)行蛋白磷酸化位點(diǎn)分析。分別利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和在線(xiàn)網(wǎng)站SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive#sequence）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；通過(guò)在線(xiàn)網(wǎng)站CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析；利用SignalP-5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。利用在線(xiàn)網(wǎng)站SWISS-MODEL進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。利用DNAMAN對(duì)BnNF-YA1及其同源蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析；利用MEGAX64對(duì)BnNF-YA1及其同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析［40］。

1.2.2 BnNF-YA1的克隆 利用油菜公共數(shù)據(jù)庫(kù)Brassica napus Genome Browser（http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/cgi-bin/gbrowse/colza/）獲取候選基因的序列信息。使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），委托南京擎科生物科技有限公司合成引物，擴(kuò)增BnNF-YA1編碼序列。

1.2.3 BnNF-YA1的表達(dá)分析 為了了解BnNF-YA1逆境表達(dá)模式，對(duì)4葉期的甘藍(lán)型油菜幼苗進(jìn)行不同逆境條件處理。干旱處理：15% PEG模擬干旱，分別在處理前、葉片輕度、中度、重度萎蔫時(shí)取樣；冷處理：4℃處理，分別在處理0、3、6 和12 h取樣；熱處理：42℃處理，分別在處理0、0.25、0.5和1 h取樣；ABA處理：噴施0.6 μmol/L ABA，分別在處理0、0.5、1和3 h取樣，檢測(cè)BnNF-YA1的表達(dá)量。為了獲得BnNF-YA1的時(shí)空表達(dá)模式，檢測(cè)BnNF-YA1在子葉（cotyledon）、幼葉（seedling leaf）、根（root）、莖（stem）、花苞（bud）、花（flower）、受精后20 d角果（20 DAP silique）、受精后30 d種子（30 DAP seed）等組織器官中的表達(dá)情況。

1.2.4 BnNF-YA1過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化 利用RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒抽提甘藍(lán)型油菜Darmor-bzh的總RNA，并使用HiScript? Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒對(duì)總RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。利用基因特異性引物（BnNF-YA1-F：5′-GCTTCACGGCTCTTCTAA-3′，BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），以 cDNA 為模板，用 Phanta Max Super-Fideity DNA Polymerase對(duì)BnNF-YA1的CDS片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用酶切連接法（Pac I、Asc I雙酶切）將測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的目標(biāo)片段構(gòu)建到pMDC83骨架載體上，構(gòu)建獲得BnNF-YA1過(guò)表達(dá)載體，命名為BnNF-YA1-OE。

使用電擊轉(zhuǎn)化法將BnNF-YA1-OE載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，利用含有卡那霉素（kanamycin，Kan）和利福平（rifampicin，Rif）的LA培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，并利用菌落PCR進(jìn)行陽(yáng)性鑒定（鑒定引物為 35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′），將陽(yáng)性農(nóng)桿菌菌株保存于-80℃?zhèn)溆?。利用農(nóng)桿菌侵染法將BnNF-YA1-OE載體轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜中，轉(zhuǎn)化過(guò)程在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法基礎(chǔ)上對(duì)激素濃度略有調(diào)整［41］。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 取轉(zhuǎn)基因植株的葉片抽提DNA［42］，并進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定（使用引物為：35S-F ：5′-CAAGACCCTTCCTCTAT-3′；BnNF-YA1-R ：5′-CTATTCCCCCATCTCTCG-3′）。 利 用 RNA isolater Total RNA Extraction Reagent試劑盒，對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和陰性對(duì)照植株抽提葉片總RNA，并使用HiScript? Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用qPCR檢測(cè)BnNF-YA1在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量（定量引物為BnNF-YA1-QF：5′-CTTCAGGTGCACCATAAT-3′；BnNF-YA1-QR ：5′-CTAACACCTAACATCACT-3′），以 BnActin 作為內(nèi)參基因（定量引物為Actin-F：5′-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3′；Actin-R ：5′-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3′），采用 2-△△CT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平［43］。

1.2.6 甘藍(lán)型油菜逆境脅迫表型鑒定 選取BnNFYA1表達(dá)量較高的3個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性過(guò)表達(dá)T2代株系（分別命名為BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4），以J9712為對(duì)照，進(jìn)行子葉期逆境脅迫表型鑒定。選取狀態(tài)一致的J9712和BnNFYA1-OE種子接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h后將萌發(fā)狀態(tài)相對(duì)一致的種子轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1/2 MS培養(yǎng)基和分別含有15% PEG和20 μmol/L甲基紫精（methyl viologen，MV）的1/2 MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)罐平均分為4個(gè)區(qū)域，分別均勻接種J9712、BnNFYA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和BnNF-YA1-OE-4，每個(gè)培養(yǎng)罐中每個(gè)材料接種15顆種子，置于16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)7 d，記錄幼苗的生長(zhǎng)情況。

1.2.7 BnNF-YA1的轉(zhuǎn)錄激活活性分析 構(gòu)建pGBKT7-BnNF-YA1載體，利用酵母快速轉(zhuǎn)化方法將pGBKT7-BnNF-YA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母菌株感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并按梯度稀釋后打點(diǎn)于SD/-Trp、SD/-His/-Trp、SD/-Ade/-Trp和SD/-His/-Ade/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d，觀察酵母菌生長(zhǎng)情況。

1.2.8 BnNF-YA1的亞細(xì)胞定位分析 構(gòu)建C端融合GFP的BnNF-YA1表達(dá)載體，命名為35S∶BnNFYA1-GFP，將該載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞并挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行保種。利用農(nóng)桿菌侵染介導(dǎo)的煙草表皮瞬時(shí)表達(dá)體系對(duì)BnNF-YA1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，對(duì)照注射包含空載體35S∶GFP的GV3101農(nóng)桿菌菌液。利用Zeiss LSM 880NLO雙光子激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GFP熒光在煙草表皮細(xì)胞中的分布情況。

2 結(jié)果

2.1 BnNF-YA1生物信息學(xué)分析

2.1.1 理化性質(zhì)分析 通過(guò)Protpraram對(duì)BnNF-YA1進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果表明，BnNF-YA1開(kāi)放讀碼框?yàn)?58 bp；分子式為C1320H2046N412O435S13；編碼285個(gè)氨基酸，其中纈氨酸的含量最多，帶負(fù)電荷的殘基（Asp、Glu）一共有36個(gè)，帶正電荷的殘基（Arg、Lys和His）有43個(gè)；BnNF-YA1蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為31.064 kD；理論等電點(diǎn)為6.11。

2.1.2 親/疏水性分析和跨膜結(jié)構(gòu)分析 利用Expasy對(duì)BnNF-YA1蛋白親/疏水性進(jìn)行分析，如圖1-A所示，BnNF-YA1蛋白在第21個(gè)氨基酸的分值為-2.878，在第134個(gè)氨基酸的分值為1.500，分別表示最低值和最高值，從整體上分析，BnNF-YA1蛋白的氨基酸分值大部分為負(fù)值，即親水性氨基酸在肽鏈中的含量較高，親水性氨基酸的平均分值也大于疏水性氨基酸的平均分值，因此，推測(cè)BnNFYA1為親水性蛋白質(zhì)。對(duì)BnNF-YA1進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，BnNF-YA1整條肽鏈不存在跨膜區(qū)域，存在跨膜結(jié)構(gòu)的可能性低于0.001，可推測(cè)BnNF-YA1不屬于跨膜蛋白。

圖1 BnNF-YA1親/疏水性、磷酸化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Analysis of hydrophilicity/hydrophobicity，phosphorylation site，secondary structure and tertiary structure of BnNF-YA1

2.1.3 磷酸化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)BnNF-YA1蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行在線(xiàn)預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖1-B）顯示，3S、5S、48S、55S、56S、65S、70S、90S、94T、98S、115S、143Y、148Y、173T、180T、185Y、232S、240T、261S、263T、265S、266S、268S、273T、278T被預(yù)測(cè)為潛在的磷酸化位點(diǎn)，分?jǐn)?shù)均高于閾值（0.500），其中232S的得分為0.995，表明BnNFYA1很可能存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

2.1.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 對(duì)BnNF-YA1二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1-C）顯示，BnNF-YA1主要由28.77%的α螺旋（包含82個(gè)氨基酸）、4.56%的延伸鏈（包含13個(gè)氨基酸）、3.16%的β轉(zhuǎn)角（包含9個(gè)氨基酸）以及63.51%的無(wú)規(guī)卷曲（包含181個(gè)氨基酸）等4個(gè)部分共同組成。對(duì)BnNF-YA1進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果如圖1-D所示，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，BnNF-YA1蛋白第180-285位氨基酸區(qū)段存在一個(gè)功能域，負(fù)責(zé)識(shí)別或者結(jié)合真核基因啟動(dòng)子區(qū)域的CCAAT順式作用元件，在特定的時(shí)間與空間激活或者抑制目的基因的表達(dá)。

2.1.5 功能域與信號(hào)肽預(yù)測(cè) 對(duì)BnNF-YA1保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BnNF-YA1在第180-235位氨基酸區(qū)域存在保守的CBFB_NFYA結(jié)構(gòu)域，屬于CCAAT結(jié)合蛋白家族。進(jìn)一步的信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，該蛋白不存在信號(hào)肽。

2.1.6 NF-YA1序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析 利用BnNF-YA1全長(zhǎng)蛋白對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在NCBI中進(jìn)行Blast檢索，獲取多個(gè)植物物種中NF-YA1的同源蛋白序列，選取包括甘藍(lán)、白菜、水稻、玉米、擬南芥、大豆等物種在內(nèi)的6條序列進(jìn)行多序列比對(duì)（部分比對(duì)結(jié)果如圖2），并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖3），BnNF-YA1與同為十字花科的甘藍(lán)中的BoNF-YA1親緣關(guān)系較近，而與其他植物中同源蛋白的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 BnNF-YA1同源序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignments of BnNF-YA1 and its homologs

圖3 NF-YA1系統(tǒng)發(fā)生分析Fig.3 Phylogenetic analysis of NF-YA1 proteins

2.2 基因表達(dá)分析

為探究BnNF-YA1的生物學(xué)功能，對(duì)BnNF-YA1在各種逆境脅迫處理?xiàng)l件下以及甘藍(lán)型油菜不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期各組織器官中的表達(dá)模式進(jìn)行分析（圖4-A），BnNF-YA1對(duì)多種逆境脅迫處理均表現(xiàn)出了不同程度的響應(yīng)：受NaCl、PEG處理、高溫脅迫和ABA處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而受冷脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明BnNF-YA1很有可能在甘藍(lán)型油菜響應(yīng)逆境的過(guò)程中發(fā)揮作用。在PEG模擬干旱脅迫處理?xiàng)l件下，BnNF-YA1的表達(dá)隨著脅迫程度的加深不斷上升，在重度脅迫條件下其表達(dá)達(dá)到峰值。在高溫脅迫和ABA處理?xiàng)l件下，BnNF-YA1的表達(dá)則表現(xiàn)出先上升后回落的趨勢(shì)。對(duì)BnNF-YA1時(shí)空表達(dá)模式分析，結(jié)果（圖4-B）顯示，BnNF-YA1在油菜各組織器官中均有不同程度的表達(dá)，其在幼葉、花苞和受精后20 d的角果中表達(dá)水平較高，暗示其可能在相應(yīng)的生長(zhǎng)發(fā)育階段發(fā)揮功能。

圖4 BnNF-YA1表達(dá)模式分析Fig.4 Expression profile of BnNF-YA1

2.3 過(guò)表達(dá)材料獲得

以甘藍(lán)型油菜下胚軸為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將BnNF-YA1-OE過(guò)表達(dá)載體（載體骨架如圖5-A）導(dǎo)入油菜中，依次經(jīng)過(guò)侵染、共培養(yǎng)、篩選、分化、生根等過(guò)程，獲得24株再生植株。對(duì)再生植株進(jìn)行PCR陽(yáng)性鑒定（圖5-B），除10、14外，其余的均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗，陽(yáng)性率為91.66%。

對(duì)轉(zhuǎn)基因植株抽提RNA（圖5-C）并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（圖5-D），利用qPCR對(duì)陰性對(duì)照植株和部分陽(yáng)性植株中BnNF-YA1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)（圖5-E），與對(duì)照相比，BnNF-YA1在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中的表達(dá)量均有不同程度的升高。

圖5 BnNF-YA1-OE過(guò)表達(dá)材料獲得Fig.5 Generation of BnNF-YA1-OE transgenic rapeseed plants

2.4 子葉期表型鑒定

為了研究BnNF-YA1在甘藍(lán)型油菜逆境應(yīng)答中的作用，選取BnNF-YA1表達(dá)水平較高的3個(gè)株系 BnNF-YA1-OE-1、BnNF-YA1-OE-2和 BnNF-YA1-OE-4進(jìn)行繁種，并對(duì)T2代材料進(jìn)行了培養(yǎng)基上的脅迫處理試驗(yàn)。如圖6-A所示，在正常條件下，對(duì)照J(rèn)9712與BnNF-YA1-OE轉(zhuǎn)基因株系幼苗的根長(zhǎng)、下胚軸以及鮮重沒(méi)有明顯差異；但在15% PEG和20 μmol/L MV處理7 d后，與對(duì)照相比，BnNF-YA1-OE幼苗的下胚軸顯著長(zhǎng)于對(duì)照，說(shuō)明15% PEG模擬的干旱脅迫和20 μmol/L MV的氧化脅迫對(duì)BnNF-YA1-OE材料生長(zhǎng)的抑制程度比對(duì)J9712生長(zhǎng)的抑制程度輕，說(shuō)明過(guò)表達(dá)BnNF-YA1使甘藍(lán)型油菜對(duì)滲透脅迫和氧化脅迫的耐受性增強(qiáng)，BnNF-YA1正調(diào)控甘藍(lán)型油菜對(duì)PEG和氧化脅迫的耐受性。

圖6 BnNF-YA1-OE T2代轉(zhuǎn)基因植株子葉期表型鑒定Fig.6 Phenotypic identification of T2 generation of BnNFYA1-OE transgenic plants at the cotyledon stage

2.5 亞細(xì)胞定位

為研究BnNF-YA1蛋白的特性，構(gòu)建了C端融合GFP的BnNF-YA1亞細(xì)胞定位載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，利用煙草表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，培養(yǎng)36 h后，利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)GFP熒光信號(hào)位于細(xì)胞核（圖7），說(shuō)明BnNF-YA1蛋白定位在細(xì)胞核中。

圖7 BnNF-YA1蛋白亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of BnNF-YA1 protein

2.6 轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)

為了分析BnNF-YA1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性，構(gòu)建pGBKT7-BnNF-YA1載體并利用酵母系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性分析（圖8），包含pGBKT7-BnNF-YA1質(zhì)粒的陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子在SD/-Trp培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)正常，而在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His/-Ade缺陷型培養(yǎng)基上均不能生長(zhǎng)，說(shuō)明BnNF-YA1全長(zhǎng)蛋白沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖8 BnNF-YA1全長(zhǎng)蛋白自激活活性分析Fig.8 Transactivation activity analysis of BnNF-YA1 fulllength protein

3 討論

NF-YA類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道在植物逆境應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，然而，該家族轉(zhuǎn)錄因子在油菜逆境應(yīng)答中的功能研究還十分有限，有待深入。本研究中克隆的BnNF-YA1編碼的蛋白質(zhì)在第180-235位氨基酸區(qū)域存在保守的CBFB_NFYA結(jié)構(gòu)域，屬于NF-YA家族轉(zhuǎn)錄因子。從系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系來(lái)看，BnNF-YA1與同為十字花科的甘藍(lán)XP_013611224.1親緣關(guān)系較近，而與其他植物的NF-YA1蛋白親緣關(guān)較遠(yuǎn)，推測(cè)BnNF-YA1與XP_013611224.1在進(jìn)化上具有相同的祖先。

根據(jù)前人的研究報(bào)道，NF-YA蛋白通常定位于細(xì)胞核中［44］。為了明確BnNF-YA1的定位情況，本研究利用煙草表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析了BnNFYA1蛋白在亞細(xì)胞水平的分布，發(fā)現(xiàn)BnNF-YA1蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，這也與生物信息學(xué)分析表明該蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)域的結(jié)果相符，說(shuō)明BnNFYA1在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生作用，符合典型的轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位特征。為了進(jìn)一步了解BnNF-YA1蛋白的特性，利用酵母系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性檢測(cè)，結(jié)果顯示，BnNF-YA1全長(zhǎng)蛋白并不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。前人研究結(jié)果表明NF-YA是組成NF-Y三聚體蛋白的一個(gè)亞基，完整的NF-Y因子常常具有轉(zhuǎn)錄激活活性［12］。因此，推測(cè)NF-Y三聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能很可能需要NF-YA和NF-YB/C的協(xié)同作用，BnNF-YA1亞基無(wú)法獨(dú)立發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能。此外，還存在另外一種可能性，即BnNF-YA1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制子。

通過(guò)對(duì)BnNF-YA1進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)BnNFYA1對(duì)多種非生物脅迫和ABA處理均表現(xiàn)出響應(yīng)，在PEG、高溫脅迫和ABA處理?xiàng)l件下其表達(dá)水平上調(diào)，而在冷脅迫處理?xiàng)l件下其表達(dá)水平下調(diào)，暗示該基因在甘藍(lán)型油菜對(duì)干旱、高溫和低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。進(jìn)一步轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證的結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)BnNF-YA1的T2代植株在面臨15% PEG模擬干旱脅迫和20 μmol/L MV氧化脅迫時(shí)，下胚軸顯著長(zhǎng)于對(duì)照植株的下胚軸，說(shuō)明其過(guò)表達(dá)植株在脅迫條件下受到的氧化損傷較輕，說(shuō)明過(guò)表達(dá)BnNF-YA1在一定程度上增強(qiáng)了甘藍(lán)型油菜對(duì)滲透脅迫和氧化脅迫的抗性。已有研究證實(shí)，利用NF-YA基因能夠有效提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性。例如：在擬南芥中異源過(guò)表達(dá)BnNFYA9使得轉(zhuǎn)基因植株對(duì)NaCl和甘露醇等非生物脅迫以及ABA處理的抗性增強(qiáng)，在NaCl和ABA處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)BnNF-YA9擬南芥種子的萌發(fā)速度、根的伸長(zhǎng)率、植株的根系等指標(biāo)均比野生型的相應(yīng)指標(biāo)表現(xiàn)更好［45］。異源過(guò)表達(dá)SiNF-YA5可提高擬南芥的抗鹽性，在高鹽處理?xiàng)l件下，與野生型擬南芥相比，過(guò)表達(dá)SiNF-YA5的轉(zhuǎn)基因材料種子萌發(fā)率提高，苗期根表面積、植株鮮重顯著增加［46］。菊花DgNF-YA1基因可以調(diào)控抗寒相關(guān)基因的表達(dá)，從而正調(diào)控菊花的耐寒性［47］。本研究結(jié)果顯示，BnNFYA1正調(diào)控甘藍(lán)型油菜對(duì)滲透脅迫和氧化脅迫的抗性，有望作為提高油菜抗逆性的有利遺傳資源。目前，BnNF-YA1參與甘藍(lán)型油菜逆境應(yīng)答的分子機(jī)制尚未明確。BnNF-YA1在甘藍(lán)型油菜中能夠與哪些NFYB/NF-YC因子發(fā)生相互作用？BnNF-YA1通過(guò)調(diào)控哪些下游靶基因來(lái)參與油菜逆境應(yīng)答？這些都是在后續(xù)研究中值得關(guān)注的問(wèn)題。

4 結(jié)論

從甘藍(lán)型油菜中克隆到BnNF-YA1基因，開(kāi)放讀碼框序列為858 bp，編碼285個(gè)氨基酸，存在保守的CBFB_NFYA結(jié)構(gòu)域，屬于NF-YA家族。BnNF-YA1受PEG處理、高溫脅迫和ABA處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，且在幼葉、花苞以及受精后20 d的角果中表達(dá)水平較高。BnNF-YA1蛋白定位在細(xì)胞核中，其全長(zhǎng)蛋白沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活活性，過(guò)表達(dá)BnNF-YA1能夠在一定程度上增強(qiáng)甘藍(lán)型油菜對(duì)PEG和MV處理的耐受性，BnNF-YA1參與調(diào)控甘藍(lán)型油菜對(duì)滲透脅迫和氧化脅迫的抗性。