利用基因編輯技術(shù)研究BRANCHED1參與油菜分枝過(guò)程的調(diào)控

Olalekan Amoo 胡利民 翟云孤 范楚川 周永明

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.湖北洪山實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

植物分枝是指葉腋處的腋生分生組織起始并形成腋芽，腋芽快速生長(zhǎng)發(fā)育形成側(cè)枝的過(guò)程。分枝是植物株型的一個(gè)重要特征，參與植物很多重要的生長(zhǎng)過(guò)程，如植物葉面積的展開和分布，決定了光的截取和光合作用，進(jìn)而影響花和果實(shí)的數(shù)量、果實(shí)的填充和產(chǎn)量［1-2］；分枝還會(huì)影響植物與野草競(jìng)爭(zhēng)光源、影響害蟲的傳播等［3-4］。此外，對(duì)于一些觀賞植物，分枝決定了其觀賞品質(zhì)。

油菜是我國(guó)重要的油料作物，其單株產(chǎn)量由單株有效角果數(shù)、每角果粒數(shù)和千粒重三大產(chǎn)量因素構(gòu)成。植株株型形態(tài)特征如分枝數(shù)、分枝位置等性狀可以間接影響油菜產(chǎn)量。其中單株有效角果數(shù)與分枝密切相關(guān)，同時(shí)分枝還決定地上部分株型的形態(tài)。降低油菜分枝位置、增加有效分枝數(shù)不僅有利于植株抗倒性，還可以增加油菜單株產(chǎn)量［5-6］。目前關(guān)于油菜株型性狀的研究還較少，挖掘可利用的理想株型相關(guān)基因在油菜高產(chǎn)育種和實(shí)現(xiàn)機(jī)械化收割中具有重要的意義。

近些年，在分離和鑒定直接參與植株株型形成的基因方面的研究取得了較多進(jìn)展，特別在與控制腋芽起始和生長(zhǎng)、莖伸長(zhǎng)和花序構(gòu)型相關(guān)的基因研究方面。這些株型調(diào)控基因大部分在雙子葉植物和單子葉植物之間都是保守的，說(shuō)明這些植物可能通過(guò)相似調(diào)控途徑來(lái)調(diào)控株型［7］。在控制植物分枝的基因中，最突出的是TEOSINTE BRANCHED1（TB1），它的同源基因在許多物種中都非常重要［8-9］。TB1同源基因在水稻中被稱為OsTB1或FINECULM1；在擬南芥、豌豆和番茄中被稱為BRANCHED1（BRC1）。眾所周知，BRC1基因在腋芽中特異表達(dá)，被認(rèn)為是不同信號(hào)調(diào)控植物分枝的重要樞紐［10-14］。擬南芥中具有兩個(gè)BRANCHED基因，分別為BRC1和BRC2，它們編碼TCP（Teosinte branched/cycloidea/proliferating cell factor）轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥中，AtBRC1和 AtBRC2都負(fù)調(diào)控分枝［10，15］。然而，研究表明AtBRC1在腋芽發(fā)育中似乎比AtBRC2發(fā)揮更關(guān)鍵的作用［16］。目前在異源四倍體油菜中至今尚未有關(guān)于BRC1的研究報(bào)道，因此對(duì)該基因展開功能研究有助于揭示油菜中分枝形成的調(diào)控機(jī)理。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)是目前在農(nóng)作物遺傳改良中應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。本研究欲利用CRISPR/Cas9技術(shù)在油菜中靶向突變BRC1基因，以期獲得油菜BRC1突變體，為闡釋BRC1的基因功能奠定基礎(chǔ)，并為株型育種提供寶貴的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本實(shí)驗(yàn)所用的遺傳轉(zhuǎn)化受體材料為半冬性甘藍(lán)型油菜品系甲9707（J9707），由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周永明教授提供。遺傳轉(zhuǎn)化獲得的再生苗、繁殖的轉(zhuǎn)化苗后代和小區(qū)試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因基地試驗(yàn)田中進(jìn)行。

1.1.2 菌株與載體 構(gòu)建CRISPR/Cas9載體所用到的雙元載體pYLCRISPR/Cas9P35S-H（潮霉素抗性）和CRISPR/sgRNA載體pYLsgRNA-AtU3d/LacZ、pYLsgRNA-AtU3b、pYLsgRNA-AtU6-1 和pYLsgRNA-AtU6b-29（氨芐抗性）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光課題組提供；用于油菜轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 編輯載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)采用CRISPR-P 2.0（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)，靶點(diǎn)引物列于附表1。具體的構(gòu)建流程參照Ma等［17］所描述的方法構(gòu)建CRISPR/Cas9編輯載體，得到的編輯載體經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)，再通過(guò)油菜下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化油菜受體材料J9707。具體操作方法參考楊陽(yáng)［18］的方法。

1.2.2 突變體的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鑒定和編輯鑒定 對(duì)獲得再生苗采用CTAB法提取植物基因組DNA，采用載體上的引物PB-L/R（表1）進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性鑒定。對(duì)得到的陽(yáng)性單株按照Liu等［19］的方法進(jìn)行高通量測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)使用在線網(wǎng)站Hi-Tom（http://www.hi-tom.net/hi-tom/）分析每個(gè)單株的具體突變形式。

2 結(jié)果

2.1 甘藍(lán)型油菜BnaBRC1的基因克隆及序列分析

根據(jù)擬南芥ATBRC1（AT3G18550）序列信息，在甘藍(lán)型油菜基因組Darmor中blast比對(duì)到5個(gè)同源基因拷貝，分別為BnaC01g34090D、BnaA01g26700D、BnaC05g51920D、BnaCnng23770D和BnaA03g34820。設(shè)計(jì)引物（表1）對(duì)這5個(gè)拷貝進(jìn)行基因克隆，得到這5個(gè)拷貝的基因序列。進(jìn)一步構(gòu)建BnaBRC1同源基因系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)BnaC01g34090D和BnaA01g26700D相似性最高，在核苷酸和蛋白序列上相似性分別為97.9%和96.7%（圖1）。在受體材料J9707中進(jìn)行同源基因DNA克隆和cDNA克隆，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個(gè)同源基因都具有4個(gè)外顯子。通過(guò)MEME進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BnaBRC1中存在2個(gè)保守的motif，屬于glutamic acid-cysteine-glutamic acid motif（ECE）， 功能未知，位于保守TCP domain中（圖2-A），TCP domain位于第8-164個(gè)氨基酸之間（圖2-B）。

圖1 BnaBRC1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of BnaBRC1 protein

圖2 BnaBRC1基因的Motif分析及保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Motif analysis and conserved domain structures of BnaBRC1 gene

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

2.2 甘藍(lán)型油菜BnaBRC1的組織表達(dá)特異性分析

利用網(wǎng)上公開的甘藍(lán)型油菜中雙11的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://yanglab.hzau.edu.cn/BnTIR/expression_show）對(duì)BnaBRC1基因在不同組織中表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BnaA01g26700D和BnaC01g34090D的表達(dá)水平相對(duì)其他拷貝較高；且BnaBRC1基因的不同拷貝主要在花粉、花蕾和16 d-26 d的種子中有相對(duì)較高的表達(dá)，在其他組織中表達(dá)量很低或者不表達(dá)（圖3）。

圖3 BnaBRC1基因5個(gè)同源拷貝在油菜的不同組織中的轉(zhuǎn)錄豐度Fig.3 Transcript abundances of five BnaBRC1 copies in different tissues of B.napus

2.3 甘藍(lán)型油菜BnaBRC1多靶點(diǎn)的CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

在設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)時(shí)，根據(jù)BnaBRC1基因的5個(gè)同源拷貝之間序列相似性分成兩組，設(shè)計(jì)兩個(gè)CRISPR/Cas9載體，分別靶向不同的同源拷貝（圖4-a）。第一組設(shè)計(jì) 3個(gè) sgRNA 盒（S1-S3），分別靶 向BnaC01g34090D、BnaA01g26700D和BnaC-05g51920D，其中BnaC01g34090D命名為BnaC01.BRC1a（CC1），BnaA01g26700D 命 名 為 BnaA01.BRC1a（AA1），BnaC05g51920D 命 名 為 BnaC05.BRC1a（CC2）。該載體命名為P35s：Cas9-BnBRC1a（SBRC1a）（ 圖4-b）。 第 二 組 也 設(shè) 計(jì) 3個(gè) sgRNA盒（S4-S6）， 分 別靶向 BnaC05g51920D、BnaCnng23770D和BnaA03g34820，其中BnaCnng23770D命 名 為 BnaCnn.BRC1b（CC3），BnaA03g34820命名為BnaA03.BRC1b（AA2），該載體命名為P35s：Cas9-BnBRC1b（SBRC1b）（圖4-b）。其中 sgRNA 靶向基因的位置信息和與基因序列的匹配程度如圖4-a所示。這兩個(gè)載體的sgRNA分別用擬南芥啟動(dòng)子pU3d、pU3b和pU6-1啟動(dòng)表達(dá)（圖4-b）。

圖4 BnaBRC1基因結(jié)構(gòu)與靶點(diǎn)序列及雙元質(zhì)粒載體示意圖Fig.4 BnaBRC1 gene structure with target sequences and schematics of binary plasmid vectors

2.4 BnaBRC1突變體的創(chuàng)建

將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9編輯載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜受體J9707。其中SBRC1a載體共獲得100株再生苗，SBRC1b載體共獲得90株再生苗。利用載體引物PB-L/R（表1）對(duì)所有再生苗進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性檢查，結(jié)果SBRC1a和SBRC1b載體分別獲得80和70株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性效率分別為80%和78%。

為進(jìn)一步確定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株的基因型，采用Hi-TOM兩輪PCR產(chǎn)物高通量建庫(kù)測(cè)序的方法［19］，分析每個(gè)單株的具體突變形式。結(jié)果SBRC1a和SBRC1b轉(zhuǎn)化載體分別檢測(cè)到11株和12株編輯單株，編輯效率分為13.8%和17.1%，其中SgRNA1（S1）和SgRNA5（S5）處沒(méi)有發(fā)生編輯。SBRC1a中BnaC01g34090D和BnaA01g26700D同時(shí)發(fā)生編輯的單株有11株，而BnaC01g34090D、BnaA01g26700D和BnaC05g51920D三個(gè)拷貝都發(fā)生編輯的單株僅有2株；SBRC1b中BnaCnng23770D和BnaA03g34820同時(shí)發(fā)生編輯的單株有11株，BnaCnng23770D單獨(dú)發(fā)生編輯的單株有1株，而沒(méi)有BnaCnng23770D、BnaA03g34820和BnaC05g51920D三個(gè)拷貝都發(fā)生編輯的單株。本研究中個(gè)別的靶點(diǎn)靶向不同同源拷貝的編輯效率有較大的差異，其中S2、S3靶點(diǎn)針對(duì)BnaC01g34090D和BnaA01g26700D的編輯效率明顯高于BnaC05g51920D，其余的靶點(diǎn)則沒(méi)有明顯的拷貝偏好性。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯在甘藍(lán)型油菜中引入的突變類型大多數(shù)為單個(gè)堿基的插入或缺失（圖5），少數(shù)情況為大片段缺失。

圖5 BnaBRC1突變體株系在T0代和T1代中S2和S3靶位點(diǎn)突變基因型Fig.5 Mutated alleles at the S2 and S3 target sites of BnaBRC1 mutants from T0 to T1 generation

2.5 BnaBRC1突變體表現(xiàn)為多主軸表型

由于疫情原因，只有部分T0代突變體材料得到自交種，其中在SBRC1a轉(zhuǎn)化載體中只獲得了BnaBRC1基因C01和A01同源拷貝同時(shí)突變的株系。而SBRC1b編輯轉(zhuǎn)化材料沒(méi)有收到種子，由于組織培養(yǎng)出來(lái)的再生苗表型受到很多因素的影響，故沒(méi)有收集T0代突變體的表型。對(duì)獲得的BnaC01g34090D和BnaA01g26700D拷貝突變體進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果表明突變基因型可以從T0代穩(wěn)定遺傳給T1代。在T1代對(duì)aa1AA2cc1CC2CC3突變體進(jìn)行表型考察，發(fā)現(xiàn)相較于野生型材料，突變體平均株高只有93.7cm，為野生型材料的53.5%（圖6-A）；苗期葉片數(shù)為野生型材料的3倍（突變體平均葉片數(shù)為33，野生型材料平均葉片數(shù)為11）（圖6-A）；相對(duì)于野生型材料只有一個(gè)主軸，突變體有2-4個(gè)主軸（圖6-C），突變體的多分枝表型在植株成熟期依舊保持和苗期一樣的數(shù)目。以上結(jié)果說(shuō)明，BnaBRC1同源基因中BnaC01g34090D和BnaA01g26700D拷貝對(duì)分枝數(shù)目的調(diào)控具有比較重要的作用。

圖6 BnaBRC1突變體的表型觀察Fig.6 Phenotypes of BnaBRC1 mutants

2.6 BnaBRC1編輯材料的脫靶檢測(cè)

為了檢測(cè)本研究中6個(gè)靶位點(diǎn)的脫靶情況，對(duì)S1-S6所有靶點(diǎn)進(jìn)行脫靶檢測(cè)。利用CRISPR-P在線軟件預(yù)測(cè)每個(gè)靶點(diǎn)可能存在的小于5個(gè)堿基錯(cuò)配的潛在脫靶位點(diǎn)。S1-S6分別對(duì)應(yīng)有9、14、11、18、18個(gè)脫靶位點(diǎn)，我們對(duì)這70個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（附表1），分別對(duì)72、72、72、54、54株編輯單株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用PCR產(chǎn)物通過(guò)高通量測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)這70個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)都沒(méi)有基因編輯發(fā)生（表2），說(shuō)明這些靶點(diǎn)特異性較高，均沒(méi)有脫靶。

表2 在T0代突變體中檢測(cè)每個(gè)sgRNA的脫靶活性Table 2 Detection of potential off-target effects for each sgRNA target site in T0 mutated plants

3 討論

獲得特定基因的突變體并對(duì)其進(jìn)行表型分析是鑒定基因功能非常有效的一種方式。而采用物理和化學(xué)誘變等傳統(tǒng)的方法創(chuàng)建突變體，不僅耗時(shí)費(fèi)力、缺乏目標(biāo)性，而且在突變體基因組中還存在大量的隨機(jī)突變［20-21］。油菜為異源四倍體油料作物，大多數(shù)基因都具有功能相似的多個(gè)同源拷貝。因此，要獲得具有表型變異的突變體，往往需要將這些功能冗余的拷貝同時(shí)突變才可能實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步增加了利用傳統(tǒng)誘變方法鑒定油菜基因功能的難度。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能靶向特定的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，很好的克服了傳統(tǒng)誘變方法的缺點(diǎn)，而且該技術(shù)易于掌握和操作，為油菜等多倍體作物的突變體創(chuàng)建和基因功能研究提供了強(qiáng)有力的工具［22-23］。

在本研究中，共設(shè)計(jì)了6個(gè)sgRNA表達(dá)盒靶向BnaBRC1基因，在T0代共獲得23株突變體，表明該方法的有效性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)各個(gè)靶點(diǎn)的編輯效率存在較大差異。這可能與Cas9和sgRNA的表達(dá)水平、靶點(diǎn)GC含量、靶向背景和靶向sgRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素相關(guān)［22-24］。

在創(chuàng)建的BnaBRC1突變體中，我們觀察到BnaC01g34090D和BnaA01g26700D雙基因純合突變體具有多分枝的表型，說(shuō)明BnaBRC1基因的BnaC01g34090D和BnaA01g26700D同源拷貝對(duì)分枝數(shù)目的調(diào)控具有比較重要的作用。由于本研究中未能獲得該基因其它拷貝的純合突變體，因此這些拷貝是否具有調(diào)控分支的功能仍然未知。在后續(xù)研究中需要通過(guò)分離或聚合得到更多同源拷貝的單基因和多基因突變體，并對(duì)其進(jìn)行表型考察以明確該基因各個(gè)同源拷貝的功能。此外，需要對(duì)獲得的BnaBRC1多主軸突變體進(jìn)行綜合農(nóng)藝性狀考察，明確該多主軸表型是否具有增產(chǎn)效益。

本研究驗(yàn)證了BRC1的基因功能在不同物種中具有保守性，都參與腋芽的發(fā)育，從而調(diào)控分枝形成。研究表明BRC1的表達(dá)受到多種激素包括細(xì)胞分裂素、獨(dú)角金內(nèi)酯及赤霉素的調(diào)控［25-27］。而油菜中BRC1的表達(dá)主要由哪些激素調(diào)控還未知，對(duì)BnaBRC1的調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)甘藍(lán)型油菜中的BnaBRC1進(jìn)行了定點(diǎn)突變。其中，BnaC-01g34090D和BnaA01g26700D雙拷貝純合突變體表現(xiàn)出明顯的多分枝表型，表明該基因的這兩個(gè)拷貝參與油菜中的分枝和株型調(diào)控。本研究為后續(xù)研究油菜的株型調(diào)控分子機(jī)理提供了重要研究材料。

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