甘蔗單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ShSTP7序列分析及組織表達特征測定

趙婷婷 王俊剛 王文治 馮翠蓮 馮小艷 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院 海南省熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用重點實驗室 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究中心，?？?571101）

甘蔗（Saccharum spp.）是禾本科C4植物，光合作用強，生物量高。甘蔗莖稈中積累大量的糖分，使其成為世界和我國重要的糖料及能源作物。甘蔗中光合作用合成的糖分從源到庫的長距離運輸、糖分在細胞內(nèi)的分配及莖稈中的積累決定著甘蔗的產(chǎn)量及品質(zhì)［1］。甘蔗中糖分從源到庫的運輸、分配、積累過程中涉及多次跨膜運輸，糖轉(zhuǎn)運蛋白在這個過程中扮演重要角色［1］。研究甘蔗中糖轉(zhuǎn)運蛋白基因功能對闡明甘蔗體內(nèi)糖分運輸、積累機制及甘蔗品質(zhì)遺傳改良具有重要意義。

植物中糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因（sugar transporter gene family，ST）屬于易化擴散超家族（major facilitator super family，MSF），易化擴散超家族蛋白具備典型的12跨膜結(jié)構(gòu)［2］。目前已鑒定的MSF超家族糖轉(zhuǎn)運蛋白基因包括蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因（sucrose transporter family，SUT） 和 單糖 轉(zhuǎn) 運蛋白家族基因（monosaccharide transporters family，MST）［3］。單糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因包括糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（sugar transporters，STPs）、己糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（hexose transporters，HXTs）、質(zhì)體葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（plastidic glucose transporters，pGlcTs）、液泡葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（vacuolar glucose transporters，VGTs）、液泡膜單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因（tonoplast monosaccharide transporters，TMTs）、肌醇轉(zhuǎn)運蛋白基因（inositol transporters，INTs/ITRs）、糖醇轉(zhuǎn)運蛋白基因（polyol transporters，PLTs/PMTs）、糖運輸?shù)鞍谆颍╯ugar-porter family protein，SFPs）［4］。

植物中蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因數(shù)量較少，單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因家族數(shù)量較多，糖轉(zhuǎn)運蛋白負責多種糖的裝載和卸載［5-6］。STPs單糖轉(zhuǎn)運蛋白，是一類位于細胞膜的具備12跨膜結(jié)構(gòu)的H+/糖同向轉(zhuǎn)運膜蛋白［7-8］。STPs是單糖轉(zhuǎn)運蛋白家族基因中目前功能鑒定較多的一類糖轉(zhuǎn)運蛋白，具備廣譜的底物糖吸收特性，如葡萄糖、戊糖、木糖、核糖、半乳糖、果糖、甘露糖等［7，9-10］，在不同的組織/器官及不同脅迫條件下表達模式不同。對擬南芥、水稻中的多個STPs家族基因功能分析結(jié)果表明STPs在植物糖分運輸、生長發(fā)育、脅迫抗性等多個生理學過程中發(fā)揮重要作用［10-11］，目前甘蔗中STPs基因功能還不清楚。研究表明在甘蔗割手密種基因組中發(fā)現(xiàn)105個糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，其中有35個STPs糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，割手密STP7基因表達響應(yīng)糖饑餓信號誘導［12］。本研究進一步從栽培種甘蔗ROC22植株葉片中分離出單糖轉(zhuǎn)運蛋白ShSTP7基因，并對其生物信息學特征、編碼蛋白生物學特性、基因表達模式、亞細胞定位情況進行系統(tǒng)分析，為闡明甘蔗體內(nèi)STP單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的功能及甘蔗遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本試驗所用甘蔗品種ROC22（蔗糖分：132.3 mg/g）、高糖熱帶種28NG251（蔗糖分：145.2 mg/g）、低糖品種MUCK CHE（蔗糖分：23.4 mg/g），種植于?？谥袊鵁釒мr(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所實驗基地。

1.1.2 菌株與試劑 本試驗所用大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α購自北京全式金生物公司，pMD-19T克隆載體、LA taq酶、Real time PCR試劑購自TaKaRa生物公司，RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司，cDNA第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶、快速限制性內(nèi)切酶購自Fermentas生物公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Axgen公司。

1.2 方法

1.2.1 甘蔗總RNA提取及cDNA第一鏈合成 分別稱取葉和莖節(jié)不同部位（未成熟葉片取未完全伸展幼嫩葉片計0葉；成熟葉片取完全伸展葉片從上至下計數(shù)+3葉；莖節(jié)取樣以莖尖生長點計為0，向下依次從第1節(jié)開始計數(shù)）的組織100 mg在液氮中充分研磨成粉末，然后根據(jù)Omega植物RNA提取試劑盒步驟提取甘蔗組織中的總RNA，提取完成的總RNA置于-80℃保存?zhèn)溆茫崛≠|(zhì)量經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計吸光值進行純度檢測。cDNA合成按照Fermentas RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書步驟進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 甘蔗ShSTP7基因全長序列擴增及測序 以甘蔗轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)序列為基礎(chǔ)，設(shè)計ShSTP7全長擴增引物（表1），以甘蔗葉片cDNA為模板進行ShSTP7全長序列擴增。PCR反應(yīng)體系為：buffer 25 μL，dNTP 4 μL，引 物 P1/P2 各 1 μL，cDNA 1 μL，LA taq 0.6 μL，ddH2O 14.4 μL。PCR 擴增程序為：95℃ 5 min ；95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃ 2 min，35 cycles；72℃ 15 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶使用試劑盒進行膠回收，并用TA克隆連入pMD-19T后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，對陽性菌落送上海生物工程生物公司進行測序。

1.2.3 甘蔗ShSTP7基因生物信息學分析 測序獲得的序列需進行核酸同源性分析、閱讀框ORF分析、編碼氨基酸序列分析及編碼蛋白特性及遺傳進化樹分析。核酸同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），ORF 分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），編碼氨基酸序列同源性分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），利用 ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）和 TMHMM Serverv.2.0 在線軟件預(yù)測ShSTP7基因編碼蛋白質(zhì)等電點、分子量及跨膜結(jié)構(gòu)，利用MEG 4.0軟件進行進化樹構(gòu)建。

1.2.4 甘蔗中ShSTP7基因表達分析 以Real time PCR技術(shù)分析8月齡甘蔗植株未成熟葉、成熟葉、1-3莖節(jié)、4-5莖節(jié)、9-10莖節(jié)、16-17莖節(jié)、19-20莖節(jié)中的ShSTP7表達模式。以甘蔗GADPH作為內(nèi)參基因［13］，ShSTP7和GADPH qPCR擴增引物見表1。qPCR反應(yīng)體系為：2 × SYBR PremixEx TaqTM，10 μL ；引物 P1/P2（4 μmol/L）各 2 μL ；50 × ROX Reference Dye，0.4 μL ；cDNA，1 μL ；ddH2O，6.6 μL。反應(yīng)程序為試劑盒推薦程序，設(shè)3個技術(shù)重復，3個生物學重復。結(jié)果以2-ΔΔCt法計算相對定量值［14］。

1.2.5 甘蔗ShSTP7-GFP融合表達載體構(gòu)建 設(shè)計ShSTP7基因閱讀框擴增引物，下游引物去除終止子（表1），并以含有ShSTP7全長序列的質(zhì)粒為模板進行ORF序列擴增，PCR反應(yīng)體系及程序同上，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳切膠回收。將pCAMBIA1302載體用Spe I單酶切線性化后進行凝膠電泳后切膠回收。將ShSTP7 ORF片段與載體片段通過無縫克隆技術(shù)進行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，選取陽性克隆提取質(zhì)粒進行酶切驗證，形成ShSTP7-GFP融合表達載體，并送測序以驗證連接片段序列正確。

表1 引物序列設(shè)計及用途Table 1 Design and application of primers

1.2.6 甘蔗ShSTP7在水稻葉片原生質(zhì)體中的亞細胞定位 取7-15 d大小的水稻幼苗莖葉，按照Yoo等［15］方法進行原生質(zhì)體提取及ShSTP7-GFP融合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及瞬時表達，并用激光共聚焦顯微鏡觀察定位結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 甘蔗總RNA純度鑒定結(jié)果

本試驗中不同甘蔗組織提取的RNA均經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和吸光值檢測。電泳結(jié)果顯示所提總RNA 28S、18S條帶完整清晰可見，沒有明顯降解，且A260/A280為1.8-1.9，表明所提總RNA質(zhì)量好，可用于進一步的試驗。

2.2 甘蔗ShSTP7基因cDNA序列克隆

以甘蔗葉cDNA為模板進行ShSTP7序列PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，在1 500 bp-2 000 bp之間存在一條特異的條帶（圖1），經(jīng)膠回收連接轉(zhuǎn)化測序后獲得1 619 bp ShSTP7 cDNA序列。

圖1 甘蔗ShSTP7 cDNA序列PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification electrophoresis of sugarcane ShSTP7 cDNA

2.3 甘蔗ShSTP7基因生物信息學分析

對ShSTP7基因cDNA核酸序列進行blast同源比對發(fā)現(xiàn)，與高粱STP7同一率達98%，與玉米STP7同一率達95%，與水稻STP7同一率達91%。對1 619 bp ShSTP7序列進行分析發(fā)現(xiàn)，其中包含1 557 bp完整閱讀框，編碼518個氨基酸。利用ProtParam軟件對ShSTP7編碼氨基酸序列進行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)編碼蛋白相對分子量55.6 kD，理論等電點pI為9.25，富含亮氨酸（12.2%）、丙氨酸（11.0%）、甘氨酸（10.4%）、纈氨酸（8.5%）、異亮氨酸（6.4%）、苯丙氨酸（6.2%）、絲氨酸（6.0%）等，不穩(wěn)定系數(shù)38.55，是一種穩(wěn)定蛋白。

利用TMHMM軟件對ShSTP7編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)ShSTP7具有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，跨膜螺旋位于27-51位、85-104位、115-139位、144-162位、171-190位、205-224位、288-312位、325-344位、353-372位、387-411位、426-450位、455-474位，是一種膜蛋白（圖2-B）。氨基酸同源序列比對發(fā)現(xiàn)ShSTP7編碼蛋白氨基酸序列與甘蔗屬割手密STP7同源性達到99%，與高粱、玉米STP7同源性達到98%和96%，與雙子葉擬南芥STP同源性為78%，屬于MFS超家族，在231-283位氨基酸處含有MFS家族STP糖轉(zhuǎn)運蛋白保守結(jié)構(gòu)域（圖2-A）。根據(jù)不同植物物種間STP7單糖轉(zhuǎn)運蛋白遺傳進化樹聚類分析表明，ShSTP7與割手密SsSTP7、高粱SbSTP7聚為一小類，雜交種甘蔗ShSTP7是SsSTP7和SbSTP7的進化類型，ShSTP7與其它禾本科作物STP7單糖轉(zhuǎn)運蛋白聚為一大類（圖2-C）。

圖2 甘蔗ShSTP7氨基酸序列同源性（A）、跨膜結(jié)構(gòu)（B）及遺傳進化樹分析（C）Fig.2 Amino acid sequence homology（A），transmembrane structure（B）and phylogenetic tree analysis（C）of sugarcane ShSTP7

2.4 甘蔗ShSTP7基因表達模式分析

對栽培種甘蔗ROC22植株不同組織中的ShSTP7表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，ShSTP7主要在甘蔗葉片中表達，特別是在成熟葉片中的相對表達量最高，莖節(jié)中表達量低（圖3-A）。進一步對高糖（28NG251）和低糖（MUCK CHE）熱帶種甘蔗不同組織中ShSTP7的表達量進行分析發(fā)現(xiàn)，在高糖熱帶種葉片和第4-24莖節(jié)中ShSTP7的表達低于低糖熱帶種，而在高糖熱帶種莖尖第1-3節(jié)幼嫩莖節(jié)中的ShSTP7的表達略高于低糖熱帶種（圖3-B）。

圖3 不同甘蔗品種中ShSTP7表達模式分析Fig.3 Expression pattern analysis of ShSTP7 in different sugarcane cultivars

2.5 甘蔗ShSTP7-GFP融合蛋白亞細胞定位分析

采用無縫連接技術(shù)將去除終止子的ShSTP7基因閱讀框序列連入沒有起始密碼子的GFP序列的N端，形成ShSTP7-GFP融合表達載體，經(jīng)酶切證實插入序列大小與目的片段大小一致（圖4-A），測序證實插入序列沒有發(fā)生突變或移碼。進一步將pCAMBIA1302空載體和ShSTP7-GFP融合表達載體在水稻葉肉細胞原生質(zhì)體中進行瞬時表達發(fā)現(xiàn)，僅含有GFP的空載體在細胞核、胞質(zhì)、細胞膜中均出現(xiàn)綠色熒光定位信號，而ShSTP7-GFP融合蛋白綠色熒光信號僅存在于細胞膜區(qū)域（圖4-B），證實ShSTP7是一種細胞膜定位蛋白。

圖4 甘蔗ShSTP7-GFP融合蛋白水稻葉肉細胞原生質(zhì)體亞細胞定位結(jié)果Fig.4 Subcellular location result of ShSTP7 -GFP fusion protein in protoplast of rice mesophyll cells

3 討論

從ROC 22葉片中克隆獲得ShSTP7含有完整閱讀框的cDNA序列，對其編碼蛋白生物信息學分析結(jié)果表明，ShSTP7基因編碼蛋白質(zhì)屬于MFS超家族STP家族成員，具有MFS超家族典型的12跨膜結(jié)構(gòu)，含有MFS-STP單糖轉(zhuǎn)運蛋白保守結(jié)構(gòu)域，ShSTP7與近源種割手密、高粱、玉米STP7高度同源，遺傳進化樹結(jié)果顯示甘蔗ShSTP7與單子葉禾本科作物STP7親緣關(guān)系較近，與雙子葉植物擬南芥中STP7親緣關(guān)系較遠，這些研究表明甘蔗ShSTP7編碼一個單糖轉(zhuǎn)運蛋白。植物中單糖轉(zhuǎn)運蛋白的不同亞細胞定位決定著它們的作用部位，已有研究表明植物中單糖轉(zhuǎn)運蛋白定位于細胞膜、液泡膜、質(zhì)體膜中，分別負責質(zhì)外體、液泡、質(zhì)體中單糖的轉(zhuǎn)運［4］，在水稻原生質(zhì)體細胞瞬時表達ShSTP7-GFP融合蛋白表明ShSTP7為一種細胞膜定位單糖轉(zhuǎn)運蛋白，可能參與吸收質(zhì)外體空間中的單糖，與其它植物中報道的 STPs定位結(jié)果一致［4，16］。

已有研究表明擬南芥基因組中有14個STPs家族基因［4］，木薯基因組中有20個STPs家族基因［17］，玉米中有 23 個 STPs［11］，高粱中有 22 個STPs［11］，水稻中有 28 個 STPs家族基因［8］，甘蔗割手密基因組中有35個STPs家族基因［12］，植物中STPs家族成員基因表達模式不同，表明不同類型STPs在植物中所起作用不同。擬南芥中AtSTP2、AtSTP6、AtSTP9、AtSTP11在花粉中特異表達［9］，AtSTP4在花粉、葉、根中表達［9］，AtSTP1在萌發(fā)的種子、幼苗根中高表達［18］，AtSTP7在根、葉、花、花藥中均有表達［16］，這些STP單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因在庫組織中表達，表明它們在庫組織的發(fā)育過程中起重要作用。AtSTP13和AtSTP14在源葉中表達［9］，表明它們參與源葉中質(zhì)外體己糖吸收。水稻中OsSTP4、OsSTP8、OsSTP19在不同組織中組成型表達，OsSTP3、OsSTP10、OsSTP14主要在根中表達，OsSTP13、OsSTP20、OsSTP26 在未成熟葉中高表達［8］。木薯中的MeSTPs主要在儲藏塊根中表達［17］，表明STPs在木薯塊根營養(yǎng)生長及糖分積累方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明割手密和熱帶種甘蔗中STP7主要在葉片中表達，受糖饑餓誘導表達，而其共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)卻出現(xiàn)了差異［12］，本研究對含熱帶種血緣栽培種甘蔗ROC22中的ShSTP7表達模式進行分析，研究表明ShSTP7同樣主要在葉片中高表達，尤其是成熟葉片，表明甘蔗中單糖轉(zhuǎn)運蛋白STP7主要在葉片糖分裝載過程發(fā)揮重要作用。而已有的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運蛋白研究表明ShPST2a、ShHXT4、ShHXT6均為庫組織表達特性［19-21］。進一步研究結(jié)果顯示高糖熱帶種甘蔗葉片和4-24莖節(jié)中的STP7表達量低于低糖品種，已有研究表明植物中STPs單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因主要在涉及存在質(zhì)外體單糖吸收部位表達，在主要以蔗糖吸收利用為主的組織中表達較低或沒有表達，如在擬南芥發(fā)育的種子中沒有STPs的表達［9］，表明在甘蔗高糖品種幼嫩莖節(jié)中STP7高表達有利于糖分的快速利用，在葉片和蔗糖積累莖節(jié)中的低表達可能促進蔗糖積累。

甘蔗作為一種產(chǎn)糖作物，糖轉(zhuǎn)運蛋白基因直接調(diào)控甘蔗糖分積累及品質(zhì)形成。植物中糖轉(zhuǎn)運蛋白基因家族中關(guān)于蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因功能研究較單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因功能深入，甘蔗割手密基因組中僅存在6個蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因［22］，而存在105個單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因［12］，表明在甘蔗自然進化及人工選擇過程中，單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因必然在維持甘蔗高糖種性扮演著重要角色，因此本研究在前期對甘蔗蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白ShSUT4基因［23］、單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因ShPST2a、ShHXT4、ShHXT6 功能研究基礎(chǔ)上［19-21］，進一步對甘蔗STP單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因功能進行研究，可為建立甘蔗糖轉(zhuǎn)運模型及揭示甘蔗糖分積累機制奠定基礎(chǔ)，為甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)遺傳改良提供新的基因資源。

4 結(jié)論

從甘蔗中克隆到一個ShSTP7單糖轉(zhuǎn)運蛋白基因，編碼一個518個氨基酸的蛋白ShSTP7，相對分子量55.6 kD，理論等電點9.25，含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域和糖轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域，ShSTP7是一種細胞膜定位單糖轉(zhuǎn)運蛋白，ShSTP7基因主要在甘蔗葉片中表達，且在高糖品種葉片中的表達低于低糖品種，表明甘蔗中ShSTP7可能負責質(zhì)外體中單糖的吸收，在甘蔗葉片糖分吸收及轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。