KASP標(biāo)記技術(shù)在主要農(nóng)作物中的應(yīng)用及展望

楊青青 唐家琪 張昌泉 高繼平 劉巧泉

（植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省作物基因組學(xué)和分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心 揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

遺傳變異是農(nóng)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，農(nóng)作物育種的目的是創(chuàng)造和利用這些遺傳變異。在漫長(zhǎng)的農(nóng)作物育種歷史中，育種方式經(jīng)歷了原始育種、傳統(tǒng)育種和分子育種三個(gè)時(shí)代的跨越，形成了具有典型時(shí)代特征的各種技術(shù)版本［1-2］。我國當(dāng)下農(nóng)作物的育種方式主要包括傳統(tǒng)的常規(guī)育種、基于分子標(biāo)記的輔助選擇育種和基于基因遺傳修飾的轉(zhuǎn)基因育種等。其中常規(guī)育種依賴育種家根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)將所用育種材料的有利基因進(jìn)行隨機(jī)組合，效率較低。而分子標(biāo)記輔助選擇育種和轉(zhuǎn)基因育種通常針對(duì)個(gè)別性狀進(jìn)行精確改良，效率較高。但是由于轉(zhuǎn)基因育種涉及產(chǎn)品商業(yè)化問題，所以目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要以分子標(biāo)記為主［3］。眾所周知，生物性狀的遺傳調(diào)控是由眾多基因參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，農(nóng)作物品種的改良涉及一系列功能基因的利用，而高通量基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)與利用將能更有效地促進(jìn)農(nóng)作物品種的定向改良［4］。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，目前DNA分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展到第三代。第一代是基于分子雜交技術(shù)的標(biāo)記技術(shù)，包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）；第二代是基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記技術(shù)，包括序列標(biāo)志位點(diǎn)（sequence tagged sites，STS）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等；而單苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）被稱為第三代分子標(biāo)記：它是基于DNA芯片技術(shù)的一種分子標(biāo)記技術(shù)。與第一、第二代分子標(biāo)記相比，它具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性好、二等位基因型等特點(diǎn)，因此，更容易實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)［5］。近些年來，由于下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）等技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基于芯片的標(biāo)記平臺(tái)的開發(fā)，各種高通量基因分型技術(shù)也被開發(fā)和利用起來［6］，如英國政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室（Laboratory of the Government Chemist，LGC）基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（kompetitive allele-specific PCR，KASP）原理開發(fā)的KASP高通量SNP檢測(cè)技術(shù)［7］和美國富魯達(dá)公司（Fluidigm）基于微流體芯片技術(shù)開發(fā)的Fluidigm基因分型平臺(tái)［8］。其中KASP技術(shù)由于其高通量、低成本和可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而在農(nóng)作物性狀遺傳和改良研究領(lǐng)域備受關(guān)注，現(xiàn)已發(fā)展成為全球基準(zhǔn)技術(shù)［7］。本文主要從KASP技術(shù)的發(fā)展、原理和在水稻、小麥、玉米等主要農(nóng)作物的遺傳育種中的應(yīng)用等方面展開綜述，同時(shí)展望了其在作物遺傳育種中的應(yīng)用前景。

1 KASP技術(shù)的特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)原理

1.1 KASP技術(shù)的發(fā)展與特點(diǎn)

在過去30年中，分子標(biāo)記從低通量限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）開始，到最近達(dá)到的基于NGS技術(shù)的SNP標(biāo)記，已經(jīng)經(jīng)歷了三代。KASP是一種基于熒光的同質(zhì)基因分型技術(shù)，最初由英國的KBioscience公司所開發(fā)［7］。KBioscience公司成立于2002年，在優(yōu)化基因分型分析的相關(guān)技術(shù)以及KASP技術(shù)的開發(fā)方面擁有近10年的經(jīng)驗(yàn)。他們不僅開發(fā)了一套自己的SNP基因分型儀器，而且擁有約500 000個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的KASP分析庫存。隨后，該公司在2011年被英國的LGC公司收購。不久，LGC公司開發(fā)出了一套靈活、快速且高通量的SNPline儀器平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)方案，基于該公司的平臺(tái)，每天可檢測(cè)的SNP數(shù)量從20-500 000個(gè)，樣本數(shù)可從單個(gè)到數(shù)萬個(gè)以上，有很強(qiáng)的靈活性。

KASP技術(shù)具有靈活、便宜、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。一方面，它是以常規(guī)PCR和熒光檢測(cè)為基礎(chǔ)，能夠在普通實(shí)驗(yàn)室操作的基礎(chǔ)上滿足低、中、高通量基因分型的要求。因此，具有一定的靈活性，更容易實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化檢測(cè)［7］。另一方面，KASP作為TaqMan的替代品，在原理上與TaqMan類似（也是基于終端熒光讀取判斷），但它與TaqMan技術(shù)的不同之處在于：其采用的是通用探針，可以與各種不同的基因特異引物配合使用，而不需要針對(duì)每個(gè)特定的位點(diǎn)進(jìn)行探針合成，這極大降低了實(shí)驗(yàn)的試劑成本［9］。研究表明，采用KASP技術(shù)的商業(yè)服務(wù)成本比采用TaqMan探針法低約80%［10］。其次，基于KASP技術(shù)的基因分型是一種簡(jiǎn)單的不依賴于凝膠電泳檢測(cè)的方法，其不需要專門的設(shè)備，研究人員可以使用常規(guī)的qPCR儀器進(jìn)行SNP基因分型，具有良好的兼容性。通過設(shè)計(jì)兩個(gè)引物對(duì)等位基因特異性單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行不同方向的擴(kuò)增，可以將單核苷酸多態(tài)性轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)度多態(tài)性。此外，KASP實(shí)現(xiàn)了更高的分析設(shè)計(jì)成功率（98%-100%）和轉(zhuǎn)化為成功的工作檢測(cè)（93%-94%）（與TaqMan的72%和61%相比）（LGC Genomics應(yīng)用說明：http://www.kbioscience.co.uk/reagents/KASP_TaqMancomparison.pdf）。而將KASP與基于芯片的Illumina GoldenGate平臺(tái)相比，KASP對(duì)陽性對(duì)照DNA樣品中的平均基因分型誤差為0.7%-1.6%，低于使用GoldenGate觀察到的（2.0%-2.4%），具有較高的準(zhǔn)確性［7］。

從發(fā)展趨勢(shì)上看，高通量、低成本和操作友好型是分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展的主要方向，而KASP檢測(cè)技術(shù)能夠同時(shí)滿足這3個(gè)要求。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物和人類的遺傳學(xué)研究與群體分型［11-13］。研究人員可以選擇幾種簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行KASP分析，例如：可以直接向LGC公司或其他商業(yè)測(cè)試公司提供核酸樣本和引物進(jìn)行檢測(cè)；或者通過訂購KASP試劑，自行利用qRT-PCR儀進(jìn)行結(jié)果分析；又或者購買全套檢測(cè)設(shè)備，建立自己的高通量SNP分析平臺(tái)。

1.2 KASP技術(shù)的實(shí)驗(yàn)原理與步驟

KASP是一種基于熒光檢測(cè)的基因分型技術(shù)，能夠在復(fù)雜的基因組DNA樣品中對(duì)特定位點(diǎn)上的SNPs和插入缺失（insertion-deletions，InDels）序列進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因檢測(cè)。具體的檢測(cè)體系包括：DNA模板、2個(gè)通用熒光探針、2個(gè)通用淬滅探針、2個(gè)與目標(biāo)位點(diǎn)特異結(jié)合的引物以及共同的反向引物。該技術(shù)是基于引物末端堿基的特異匹配來對(duì)SNP以及InDel位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，即基于PCR反應(yīng)結(jié)束后的熒光讀取工作［10］。針對(duì)每個(gè)孔采用雙色熒光檢測(cè)，一個(gè)樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)，而每個(gè)位點(diǎn)都存在3種可能的基因型（純合1，純合2或雜合），極大地提高了檢測(cè)效率。

KASP技術(shù)的操作步驟可概括為三大步：第一步，引物和探針設(shè)計(jì)。首先設(shè)計(jì)針對(duì)特定SNP的2個(gè)正向PCR引物，每個(gè)引物通過調(diào)整3′末端來對(duì)應(yīng)一個(gè)SNP的等位基因［14］。例如圖1，等位基因1引物3′末端對(duì)應(yīng)A，等位基因2引物3′末端對(duì)應(yīng)C。其次，在每個(gè)正向引物的5′末端添加標(biāo)簽序列，如圖1中的標(biāo)簽序列1和2。此外，設(shè)計(jì)與標(biāo)簽序列對(duì)應(yīng)的熒光探針，如探針1和探針2。在探針1的5′端添加有FAM熒光基團(tuán)，探針2的5′端添加有HEX熒光基團(tuán)［15］。同時(shí)，對(duì)應(yīng)2個(gè)探針，各設(shè)計(jì)一個(gè)3′端帶淬滅基團(tuán)的淬滅探針。在實(shí)際操作中只需要針對(duì)特定SNP設(shè)計(jì)添加5′末端標(biāo)簽序列的普通引物即可，而探針通常由試劑盒提供。第二步，普通PCR擴(kuò)增。在第一輪PCR擴(kuò)增中，等位基因特異引物（3′末端能配對(duì)的）就可識(shí)別特定等位基因模板，完成等位基因識(shí)別（圖1）。從第2輪PCR擴(kuò)增開始，產(chǎn)物中出現(xiàn)攜帶通用標(biāo)簽序列的模板，這步完成把通用標(biāo)簽序列引入與SNP對(duì)應(yīng)的PCR產(chǎn)物中。隨后在PCR擴(kuò)增過程中，攜帶熒光的探針通過與通用序列互補(bǔ)的DNA鏈結(jié)合而添加到PCR產(chǎn)物中，經(jīng)多輪PCR擴(kuò)增，更多的熒光探針退火到新合成的、沒有淬滅基團(tuán)的互補(bǔ)鏈上，而逐漸增強(qiáng)PCR產(chǎn)物熒光強(qiáng)度。第三步，熒光檢測(cè)和分析。利用專用的熒光信號(hào)檢測(cè)儀或普通的熒光定量PCR儀（配有FAM和HEX檢測(cè)通道）進(jìn)行信號(hào)讀取并用軟件采集信號(hào)和判別等位基因類型。

圖1 KASP技術(shù)基因分型的基本原理示意圖Fig.1 Principal of the KASP genotyping assay

2 KASP技術(shù)在主要農(nóng)作物中的應(yīng)用

2.1 KASP技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用

種質(zhì)資源是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最基本的生產(chǎn)資料，是加速農(nóng)作物育種改良的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［16］。同時(shí)，種質(zhì)資源在持續(xù)提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)和保證糧食安全等方面發(fā)揮著重要作用。種質(zhì)資源的廣泛收集及妥善保存是確保種質(zhì)資源遺傳多樣性最有效的方法之一［17］。由于KASP標(biāo)記的高通量和低成本特性，近些年越來越多的研究利用該標(biāo)記開展了種質(zhì)資源的鑒定和應(yīng)用分析。

在水稻中，Shikari等［18］采用KASP技術(shù)對(duì)克什米爾河谷的溫帶水稻種質(zhì)資源的213個(gè)基因組位點(diǎn)進(jìn)行了分析。通過消除冗余，最終選擇了114個(gè)SNPs設(shè)計(jì)成KASP標(biāo)記。通過群體結(jié)構(gòu)分析，將該批材料分成了3個(gè)明顯的亞群。Yang等［19］借助已有的SNPs和InDels數(shù)據(jù)庫，成功開發(fā)了565對(duì)與水稻重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的KASP標(biāo)記，并將其中多態(tài)性較好的467對(duì)標(biāo)記用于481份水稻種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)KASP標(biāo)記基因分型結(jié)果，將該材料分為3個(gè)組群。此外，貴州禾是貴州省特有的一種原生態(tài)水稻品種，吳嫻等［20］利用120對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)貴州禾資源和一些其他地區(qū)的水稻品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，貴州禾的遺傳多樣性較為豐富，與貴州及江蘇地方粳稻的親緣關(guān)系更為密切。

在小麥中，謝靜敏等［21］設(shè)計(jì)了5 412對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)青海省一批小麥品種進(jìn)行了遺傳多態(tài)性分析。結(jié)果顯示KASP標(biāo)記多態(tài)性比率為90.4%，多態(tài)性結(jié)果顯示該批小麥品種可分為5個(gè)或12個(gè)類群。Federico等［22］用85對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)168份來自阿根廷和其他國家的硬粒小麥的遺傳多樣性進(jìn)行分析，得出遺傳分化系數(shù)值為0.139。這些品種可被分為兩個(gè)亞群，并且發(fā)現(xiàn)其分析結(jié)果與119份材料中使用AFLP標(biāo)記分析所獲得的信息是互補(bǔ)的。Zhang等［23］將與小麥籽粒產(chǎn)量、品質(zhì)、適應(yīng)性和抗逆性有關(guān)的44個(gè)SNPs開發(fā)成KASP標(biāo)記，進(jìn)而對(duì)207份面包小麥品種進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，將其分為兩個(gè)亞組：第一亞群主要指寧夏的地方品種和栽培品種；第二類主要是從國外和中國其他省份引進(jìn)的品種。

在玉米中，陸海燕等［24］利用不同來源的玉米自交系全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定出了一系列SNPs位點(diǎn)并開發(fā)出700對(duì)KASP分子標(biāo)記，從中選擇202對(duì)具有代表性KASP標(biāo)記進(jìn)一步用于系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及群體結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，基于KASP標(biāo)記位點(diǎn)的聚類分析結(jié)果和基于總SNPs位點(diǎn)的聚類分析結(jié)果高度吻合，兩者的遺傳距離相似性系數(shù)高達(dá)89.5%，能成功區(qū)分玉米的雜種優(yōu)勢(shì)群。因此，KASP標(biāo)記亦可在玉米種質(zhì)資源分析、以及雜種優(yōu)勢(shì)群劃分等方面發(fā)揮重要作用。

在其它農(nóng)作物方面，Yang等［25］選擇了53對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)34份大白菜材料進(jìn)行基因分型，這53對(duì)標(biāo)記平均分布在每條染色體上。通過對(duì)該批材料的遺傳多樣性的評(píng)估，可將這34份材料根據(jù)抽穗類型分為三大類。Shen等［26］通過對(duì)西蘭花基因型進(jìn)行全基因組測(cè)序，選擇了100個(gè)SNPs用于KASP標(biāo)記的開發(fā)。隨后利用這些標(biāo)記對(duì)372份西蘭花材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)這些材料可分為兩個(gè)主要類群，但類群分化相對(duì)較弱。王富強(qiáng)等［27］使用一批葡萄種質(zhì)篩選出46對(duì)優(yōu)質(zhì)KASP標(biāo)記。而其中的25對(duì)標(biāo)記即可對(duì)這些材料進(jìn)行有效區(qū)分，鑒定效率達(dá)到95.69%。聚類分析結(jié)果顯示可將該批葡萄種質(zhì)細(xì)分為6個(gè)亞類。Wang等［28］利用成功開發(fā)的78對(duì)（轉(zhuǎn)化率為61.41%）KASP標(biāo)記將94份小扁豆材料分為兩個(gè)主要類群：國內(nèi)種質(zhì)和國外種質(zhì)，并且發(fā)現(xiàn)國內(nèi)種質(zhì)的聚類更為集中，而國外種質(zhì)的分布則更為廣泛。這與使用EST-SSR標(biāo)記的分類結(jié)果高度一致。此外，KASP技術(shù)還被用于咖啡［29］、花生［30］等農(nóng)作物的種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系等方面的研究。

2.2 KASP技術(shù)在分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用

傳統(tǒng)育種一般是通過對(duì)群體中大量個(gè)體進(jìn)行性狀觀測(cè)來選育優(yōu)良后代，這一過程不僅操作繁瑣、耗費(fèi)時(shí)間，而且效率低下。隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的有效工具［31-32］。在眾多的分子標(biāo)記中如何選擇高通量且低成本的分子標(biāo)記是現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助育種研究中所首要關(guān)注的?；贙ASP標(biāo)記在成本和通量方面的優(yōu)勢(shì)，其在農(nóng)作物的標(biāo)記輔助選擇育種中也得到了廣泛應(yīng)用。

在水稻中，Shao等［33］基于水稻基因組計(jì)劃（rice genome project，RGP）的3 000份重測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)控制稻米直鏈淀粉含量的Wx基因開展了等位變異分析，并成功開發(fā)了6對(duì)KASP標(biāo)記，這些標(biāo)記大致能夠區(qū)分現(xiàn)有的所有Wx等位基因材料。他們利用這些標(biāo)記對(duì)1976-2018年的雜交親本品種進(jìn)行了Wx基因分型發(fā)現(xiàn)，雜交稻親本中主要存在3種Wx等位類型：Wxa、Wxb和Wxlv。Wxb廣泛應(yīng)用于雜交水稻的父本；Wxa和Wxlv用于早期雜交稻的母本，并隨著雜交稻的選育進(jìn)程，逐漸被Wxb所取代。另外，根據(jù)Wxmq基因第4外顯子的SNPs信息，牛付安等［34］開發(fā)了Wxmq-KASP，用其對(duì)一些粳稻軟米品種和相關(guān)F2群體進(jìn)行了基因分型研究，證明Wxmq-KASP可以高效應(yīng)用于水稻低直鏈淀粉含量的分子標(biāo)記輔助選擇育種。Addison等［35］對(duì)2 932份水稻品種的香味基因Badh2的SNPs進(jìn)行了分析，開發(fā)出能區(qū)分Badh2單倍型的9對(duì)KASP標(biāo)記，并對(duì)一些美國水稻材料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Hap6能夠有效鑒定美國種質(zhì)中的香味品種。同年，Li等［36］開發(fā)了兩對(duì)與Badh2-E2（第2外顯子的7 bp缺失）和Badh2-E7（第7外顯子8 bp缺失及3 bp變異）等位基因變異相關(guān)的KASP-SNP標(biāo)記，并將其應(yīng)用于香稻種質(zhì)鑒定和F2群體篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，164份香米品種中有160份可以使用這兩對(duì)標(biāo)記進(jìn)行鑒定，并推測(cè)大多數(shù)香米品種攜帶Badh2-E2和Badh2-E7兩種等位類型。李瑤等［37］開發(fā)了SKC1NB（耐鹽性）-KASP，利用該標(biāo)記對(duì)一個(gè)BC3F2群體進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其能夠有效區(qū)分群體中純合個(gè)體和雜合個(gè)體。此外，在抗病性方面，一些研究證明KASP標(biāo)記能夠很好地鑒定水稻材料中抗病基因的不同等位基因類型［38-41］。

在小麥方面，KASP技術(shù)多用于與小麥抗病性和抗非生物脅迫相關(guān)的基因方面的研究。例如，Rasheed等［42］開發(fā)并鑒定了152對(duì)與普通小麥適應(yīng)性、產(chǎn)量、品質(zhì)、生物和非生物脅迫抗性相關(guān)的KASP標(biāo)記，并利用這些標(biāo)記對(duì)4個(gè)小麥分離群體的基因型進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示所有的KASP標(biāo)記都與栽培品種以及雙親群體中的相關(guān)表型顯著關(guān)聯(lián)。該研究還發(fā)現(xiàn)KASP標(biāo)記的檢測(cè)效率是基于凝膠電泳的傳統(tǒng)PCR標(biāo)記的45倍，并且能有效提高雜交親本和高代品系的鑒定效率。2018年，Qureshi等［43］借助20對(duì)KASP標(biāo)記證實(shí)了小麥抗條銹病Yr34和Yr48為同一個(gè)基因。而在這之后，F(xiàn)ang［44］就小麥抗葉銹基因Lr34開發(fā)了兩對(duì)KASP標(biāo)記：Lr34-E11-KASP和Lr34-E22-KASP，這兩對(duì)標(biāo)記可在小麥育種工程中加速對(duì)Lr34基因的選擇。Rehman等［45］選擇與小麥耐旱性相關(guān)的16個(gè)基因座的等位基因開發(fā)了KASP標(biāo)記，對(duì)47份小麥材料進(jìn)行了等位變異與籽粒產(chǎn)量的相關(guān)性分析。該批KASP標(biāo)記的轉(zhuǎn)化率＞98%，并且其對(duì)材料的分析結(jié)果與基于凝膠的PCR標(biāo)記的分析結(jié)果一致。此外，王志偉等［46］利用3對(duì)抗旱基因的KASP標(biāo)記（TaDreb_SNP、fehw3_SNP、CWI4A_SNP）和3對(duì)抗穗發(fā)芽基因的KASP標(biāo)記（PHS_646、SDR_SNP、Vp1b1-83_IND）對(duì)云南育成的小麥品種（系）進(jìn)行了基因型檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這6對(duì)標(biāo)記能夠有效區(qū)分抗穗發(fā)芽和易穗發(fā)芽的品種以及抗旱和非抗旱品種。Su［47］就小麥赤霉病（fusarium head blight，F(xiàn)HB）開發(fā)了TaHRC-KASP標(biāo)記，并對(duì)來自中國和日本的幾個(gè)抗赤霉病的地方品種進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)在不同背景下，TaHRC-KASP標(biāo)記均可鑒定Fhb1基因。另外，Khalid等［48］利用124對(duì)KASP標(biāo)記，對(duì)一批六倍體小麥品系進(jìn)行分析，以研究87個(gè)具有育種價(jià)值的功能基因的等位變異規(guī)律。從而為進(jìn)一步調(diào)控小麥重要農(nóng)藝性狀的表達(dá)提供了一套目標(biāo)基因。Anuarbek等［49］利用32對(duì)KASP標(biāo)記分析了來自哈薩克斯坦的四倍體硬粒小麥材料，并對(duì)主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其中有8對(duì)KASP標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果與小麥的5個(gè)農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)。

在玉米方面，Jagtap等［50］開發(fā)了100對(duì)與高溫脅迫響應(yīng)（heat stress response，HSR）有關(guān)基因的KASP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其中71%的標(biāo)記具有多態(tài)性，21%的標(biāo)記只產(chǎn)生一種基因或只有雜合型基因，其余的8%未能產(chǎn)生有用的擴(kuò)增信號(hào)。通過比較，發(fā)現(xiàn)該研究中的KASP標(biāo)記開發(fā)有效率（71%）高于小麥［51］（67%）和水稻［52］（49.9%），但低于鷹嘴豆［11］（80.6%）。此外，BoлкoBa等［53］以玉米為例，介紹了KASP基因分型的結(jié)果及其在遺傳育種和種子生產(chǎn)中的應(yīng)用，證明通過KASP基因技術(shù)進(jìn)行的基因組選擇能夠有效提升玉米抗旱性遺傳改良。

在其它作物中，Ongom等［54］利用開發(fā)的17個(gè)豇豆KASP標(biāo)記對(duì)225個(gè)雜交組合產(chǎn)生的1 436個(gè)F1代植株進(jìn)行了分子指紋圖譜和雜合性檢測(cè)，結(jié)果表明KASP標(biāo)記能夠?qū)Ω锥褂H本和雜合體有效區(qū)分，為缸豆的分子育種提供了重要信息。王鵬等［55］設(shè)計(jì)了抗番茄黃花曲葉病毒病基因Ty-1和抗根結(jié)線蟲基因Mi-1的KASP標(biāo)記，并結(jié)合已報(bào)道的抗番茄花葉病毒病基因Tm-22、抗番茄斑萎病毒病基因Sw-5和抗鐮刀菌頸腐根腐病基因Frl的KASP標(biāo)記，進(jìn)行了番茄抗病基因KASP分型檢測(cè)，所得檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果一致。張敬敬等［56］開發(fā)了西瓜抗枯萎病、抗炭疽病、抗白粉病性狀相關(guān)的3對(duì)KASP，對(duì)130份西瓜材料進(jìn)行了分析，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將試驗(yàn)材料分為攜帶不同抗病基因的4類。棕色中脈（bmr）表型是高粱的一種隱性性狀，會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素的總體減少［57］。Burow等［58］開發(fā)了15對(duì)KASP標(biāo)記（6對(duì)用于bmr6，9對(duì)用于bmr12），用于在高粱苗期對(duì)bmr6和bmr12的等位變異進(jìn)行研究。因?yàn)閎mr6和bmr12表現(xiàn)出隱性上位型基因互作，因此，這些KASP標(biāo)記有助于從單個(gè)突變體中鑒定出雙突變類型。孟君仁等［59］利用5對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)桃的自然群體和分離群體進(jìn)行了檢測(cè)，表明開發(fā)的KASP標(biāo)記可高效檢測(cè)桃果實(shí)外觀、抗性、肉質(zhì)等重要性狀相關(guān)基因的等位變異。此外，KASP技術(shù)在馬鈴薯［60］、蘋果［61］、辣椒［62］和向日葵［63］等作物中也進(jìn)行了相關(guān)的育種研究。

2.3 KASP技術(shù)在遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位中的應(yīng)用

遺傳圖譜的構(gòu)建是基因定位和克隆的前提，其在數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）的遺傳鑒定中發(fā)揮關(guān)鍵作用［64-65］。早期的遺傳圖譜構(gòu)建所采用的分子標(biāo)記主要是第一代和第二代分子標(biāo)記，由于這些分子標(biāo)記在基因組中分布密度較低，基于這些標(biāo)記所定位到的QTL往往因?yàn)榫扔邢薅鵁o法開展后續(xù)的QTL精細(xì)定位和克隆。近些年來，隨著技術(shù)的進(jìn)步和測(cè)序成本的降低，大規(guī)模重測(cè)序已經(jīng)成為可能。利用廣泛的重測(cè)序可以挖掘大量的遺傳標(biāo)記，這為構(gòu)建高密度遺傳圖譜提供了強(qiáng)有力的數(shù)據(jù)支持［66］。其中SNP陣列是一種強(qiáng)大而有效的QTL作圖方法，而KASP技術(shù)作為SNP標(biāo)記基因分型的一種，能夠在保證基因分型準(zhǔn)確性的情況下，大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)所消耗的時(shí)間［6］。

在水稻方面，Cheon等［67］開發(fā)了771對(duì)KASP標(biāo)記并成功地用于韓國溫帶粳稻品種的遺傳圖譜構(gòu)建和抗病性及穗發(fā)芽抗性的QTL分析。其中，利用239對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)包含160個(gè)系的重組自交系（RIL）進(jìn)行了抗穗發(fā)芽的QTL檢測(cè)。Ghosal等［68］通過所構(gòu)建的兩個(gè)F2水稻群體，分別獲得了170個(gè)和179個(gè)多態(tài)性SNPs，并將這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)成KASP標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，共鑒定出5個(gè)分別位于染色體3、5、6、7和8上的與存活率有關(guān)的QTL，以及4個(gè)分別位于染色體1、3和7上的控制幼苗高度的QTL。有氧水稻生產(chǎn)（aerobic rice production，AP）是減少水稻栽培用水的有效方式，具有窄根錐角（narrow root cone angle，RCA）基因被認(rèn)為是AP的一個(gè)關(guān)鍵特征。研究表明，qRCA4對(duì)于RCA變異起重要作用［69］。Vinarao等［70］構(gòu)建了3種不同遺傳背景的水稻F2群體，利用9對(duì)KASP標(biāo)記（其中兩對(duì)標(biāo)記：snpOS00933和snpOS00944被設(shè)計(jì)用于QTL兩側(cè)，而另外7對(duì)標(biāo)記被設(shè)計(jì)在QTL內(nèi)），最終將qRCA4精細(xì)定位在720 kb的區(qū)域內(nèi)。另外，Lei等［71］在7號(hào)染色體上檢測(cè)到一個(gè)與相對(duì)地上部長(zhǎng)度（RSL）相關(guān)的主效QTL：qRSL7，并根據(jù)親本之間的SNP，在QRSL7附近開發(fā)了25對(duì)KASP標(biāo)記，最終將QRSL7定位在222 kb的距離內(nèi)。

在小麥方面，蔣鈺婕等［72］用小麥無芒品種中國春為父本，有芒品系MK147為母本構(gòu)建了F2分離群體，利用58對(duì)KASP標(biāo)記將控制芒的QTL定位在0.81 cM的區(qū)間內(nèi)。Zhan等［73］利用20對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)小麥品種T.ponticum × Taichung 29的F2分離群體，進(jìn)行抗小麥白粉病基因PmCH7087的定位分析，最終將目標(biāo)基因定位在9.68 Mb的區(qū)間內(nèi)。Xiong等［74］利用突變體eh1和LX987雜交獲得的RIL進(jìn)行遺傳作圖，檢測(cè)到37個(gè)與抽穗期、株高、千粒重、穗長(zhǎng)等農(nóng)藝性狀有關(guān)的QTL，并利用成功開發(fā)的25對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)這些QTL進(jìn)行了驗(yàn)證，從而將染色體4B和3A上的QTL分別限定在0.8 Mb和2.5 Mb的物理間隔內(nèi)。通過將KASP技術(shù)與構(gòu)建遺傳圖譜相結(jié)合，Wu等［75-76］分別利用17對(duì)和18對(duì)KASP標(biāo)記在染色體2BS、3BS和6BL上鑒定了3個(gè)與抗條銹病性相關(guān)的QTL，并將6BL染色體上的QTL最終定位在KASP標(biāo)記IWB71602和IWB55937之間，其遺傳距離為1.4 cM。

在玉米方面，Nair等［77］利用KASP標(biāo)記技術(shù)對(duì)CML206 × CML312的F2群體，進(jìn)行玉米條紋病抗性基因Msv1的精細(xì)定位，定位區(qū)間為0.87 cM。玉米致死性壞死（maize lethal necrosis，MLN）是撒哈拉以南非洲地區(qū)玉米的一種主要疾病，嚴(yán)重感染時(shí)，產(chǎn)量損失可達(dá) 100%［78］。對(duì)此，Awata等［79］開發(fā)了500對(duì)可能影響MLN表型的KASP標(biāo)記，通過對(duì)7個(gè)群體的F3后代進(jìn)行分析，檢測(cè)到了至少有7個(gè)抗MLN的QTL。其中，3號(hào)染色體上的2個(gè)SNP位 點(diǎn)（PHM15449_10和 PZA00920_1） 與 MLN抗性密切相關(guān)。此外，Wang等［80］在3號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了與高莖稈斷裂角度（影響莖稈的柔韌性和抗倒伏性）有關(guān)的2個(gè)候選基因：Zm00001d039769和Zm00001d039913，根據(jù)這2個(gè)候選基因設(shè)計(jì)的2對(duì)KASP標(biāo)記，經(jīng)過驗(yàn)證也顯示出與莖稈斷裂角度有顯著的相關(guān)性。

在其它作物方面，Kante等［81］構(gòu)建了西非高粱的 POPCD（CK60A × DT-298）、POPFD（FambeA ×DT-298）和 POPFL（FambeA × Lata）的 3 個(gè) F2分離群體，鑒定了7個(gè)與育性恢復(fù)基因Rf相關(guān)的QTL，并利用開發(fā)的11對(duì)KASP標(biāo)記在POPCD和POPFL的F2：3群體中進(jìn)行了QTL位點(diǎn)的驗(yàn)證。Cheng等［82］通過遺傳作圖在6號(hào)染色體上檢測(cè)到與大豆鐮刀菌抗性有關(guān)的3個(gè)抗性候選基因，針對(duì)其中一個(gè)基因（Glyma.06g206900）設(shè)計(jì)了KASP標(biāo)記并在不同遺傳群體中進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記與病原菌反應(yīng)之間存在著很強(qiáng)的相關(guān)性。提高水分利用效率可以有效減少干旱脅迫造成的生產(chǎn)損失，為了確定蘋果中與調(diào)控水分利用效率有關(guān)的位點(diǎn)，Wang等［83］利用Honeycrisp和Qinguan兩個(gè)品種構(gòu)建的F2群體進(jìn)行了干旱脅迫QTL的鑒定，隨后用開發(fā)的3個(gè)KASP標(biāo)記對(duì)其中的3個(gè)QTL進(jìn)行了穩(wěn)定性驗(yàn)證。Scholten等［84］利用1 100對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)所構(gòu)建的洋蔥種間三交群體進(jìn)行基因分型，最終將鱗狀葡萄孢桿菌（botrytis squamosa）的抗性位點(diǎn)定位于6號(hào)染色體上。此外，KASP技術(shù)還被用于大白菜［85］、花生［86］等農(nóng)作物在遺傳圖譜構(gòu)建與基因定位中的研究。

2.4 KASP技術(shù)在種子純度鑒定中的應(yīng)用

傳統(tǒng)上對(duì)種子純度的鑒定主要依賴于表型鑒定，效率低下。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的作物開始使用不同類型的分子標(biāo)記來鑒別種子的真?zhèn)魏图兌龋?7］，但AFLP、SSR、InDel等標(biāo)記存在數(shù)量少、操作復(fù)雜等不足。而SNP標(biāo)記具有穩(wěn)定性好、密度高、分布廣泛、適于規(guī)模化篩選等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于辣椒、黃瓜等作物的品種鑒定以及種子純度檢測(cè)等方面［88-90］。目前KASP標(biāo)記技術(shù)在種子純度鑒定方面也得到了越來越多的應(yīng)用（表1）。

表1 KASP技術(shù)在主要農(nóng)作物中的應(yīng)用Table 1 Application of KASP technology in crops

Ertiro等［91］使用了191對(duì)KASP標(biāo)記和257 268對(duì)GBS（genotyping by sequencing，通過測(cè)序進(jìn)行基因分型）標(biāo)記對(duì)來自玉米品種的16個(gè)自交系的2-9個(gè)種子源的遺傳純度和同一性水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)分析。研究結(jié)果表明基因分型平臺(tái)的類型和用于分析的標(biāo)記數(shù)量對(duì)于不同來源的種子純度及同一性方面均存在一定差異，但兩種方法得出的總體結(jié)論基本相似。說明相較于高標(biāo)記密度的GBS技術(shù)，使用低標(biāo)記密度的KASP技術(shù)就可輕松完成材料的質(zhì)控分析。此外，尹祥佳等［92］采用KASP技術(shù)對(duì)甘肅省內(nèi)推廣的6份玉米雜交種進(jìn)行了純度鑒定，結(jié)果顯示4對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)品種的純度鑒定結(jié)果在95.83%-98.96%。王蕊等［93］篩選獲得在玉米染色體上分布均勻、多態(tài)性較好的60個(gè)候選位點(diǎn)，并轉(zhuǎn)化為KASP標(biāo)記，轉(zhuǎn)化成功率為95%。綜合考慮標(biāo)記雙親互補(bǔ)率、多態(tài)性、穩(wěn)定性和分型效果等多項(xiàng)指標(biāo)，最終確定20個(gè)標(biāo)記作為玉米雜交種純度鑒定的核心標(biāo)記，這些標(biāo)記能夠有效鑒定99.7%供試樣品純度。馮子珊等［94］利用3對(duì)KASP標(biāo)記對(duì)短棒瓠瓜雜交種的92份F1及其父、母本材料進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示F1種子純度為97.8%，與田間種植純度鑒定結(jié)果一致?？锩偷龋?5］利用棉花63K全基因組SNP芯片對(duì)代表性品種進(jìn)行了篩選與綜合評(píng)估，并基于KASP技術(shù)開發(fā)了一套適用于我國棉花雜交種純度高通量檢測(cè)的核心SNP組合（合計(jì)26個(gè)），從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大量樣品的品種純度的快速檢測(cè)。為了確定大麥預(yù)混麥芽樣品“麥特卡夫”的樣品純度，蔣培基等［96］篩選鑒定了4個(gè)能夠區(qū)分7個(gè)大麥麥芽品種的SNP位點(diǎn)，開發(fā)了對(duì)應(yīng)的KASP標(biāo)記。進(jìn)一步的分析表明這些標(biāo)記能夠成功分辨出預(yù)混麥芽樣品。此外，Kim等［97］使用50對(duì)KASP標(biāo)記在102個(gè)蘿卜自交系中進(jìn)行品種純度驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，這些自交系的純合性在56%-96%。

3 展望

隨著分子生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的農(nóng)作物品種和品系的基因組重測(cè)序使得SNP標(biāo)記日益豐富?；谶@些豐富的SNP數(shù)據(jù)，以SNP芯片陣列和重測(cè)序SNP分型技術(shù)為主的基因分型平臺(tái)得到了快速發(fā)展［98-99］。KASP作為目前主要的SNP分型檢測(cè)技術(shù)之一，相較于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記（RFLP，STS、SSR等）有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［7，100］。它是一種簡(jiǎn)單的無凝膠熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，能夠在普通實(shí)驗(yàn)室操作的基礎(chǔ)上滿足低、中、高通量基因分型的要求，具有一定的靈活性，適用于目標(biāo)位點(diǎn)和樣本數(shù)量變化很大的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。此外，相較于其他的SNP基因分型平臺(tái)如：TaqMan和Illumina GoldenGate，它又能很大程度上降低實(shí)驗(yàn)成本以及提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確率。該技術(shù)目前已在農(nóng)作物分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和種子純度鑒定等領(lǐng)域得到了廣泛的利用。

從分子標(biāo)記的利用看，傳統(tǒng)的SSR等標(biāo)記仍然是大多數(shù)研究者常用的標(biāo)記技術(shù)［101］。究其原因，雖然現(xiàn)有SNP數(shù)據(jù)非常豐富，但是這其中包括了大量冗余信息，研究人員很難快速準(zhǔn)確的獲得有用的SNP信息。其次，大量的SNP信息還難以與功能基因位點(diǎn)關(guān)聯(lián)，這限制了其在以功能基因利用為主的遺傳育種中的應(yīng)用［19］。就技術(shù)本身而言，由于SNP位點(diǎn)的限制，在KASP引物設(shè)計(jì)時(shí)會(huì)受到SNP附近序列的限制而造成所設(shè)計(jì)的引物無法有效進(jìn)行PCR擴(kuò)增［14］。此外，模板DNA質(zhì)量的高低對(duì)于KASP檢測(cè)成功率也有重要影響。因此，為了提升KASP技術(shù)的利用效率，在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)當(dāng)注重基因功能位點(diǎn)的收集和匯總，建立相關(guān)功能基因多態(tài)性位點(diǎn)的KASP數(shù)據(jù)庫。為提高KASP對(duì)未知樣本的檢測(cè)效率，在開發(fā)功能性KASP標(biāo)記的同時(shí)，應(yīng)當(dāng)建立相配套的陽性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。從KASP技術(shù)的具體操作來看，實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模檢測(cè)條件下應(yīng)當(dāng)保證模板DNA的質(zhì)量并調(diào)整到相似的濃度。當(dāng)前分子設(shè)計(jì)育種已經(jīng)被作為一項(xiàng)高效和精準(zhǔn)的育種技術(shù)手段，而在多種作物中被提出和實(shí)施。隨著功能基因序列信息的積累和KASP分子標(biāo)記數(shù)目的增加，該技術(shù)將成為種質(zhì)資源鑒定、群體分析和分子設(shè)計(jì)育種等研究的重要輔助手段。