復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者絨毛中滋養(yǎng)層細(xì)胞的變化

錢利強(qiáng) 潘熠斌 王佩欣 竺海燕 金曉瑩 張松英

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指3 次及3 次以上的連續(xù)發(fā)生的自然流產(chǎn)，是普遍的妊娠并發(fā)癥，發(fā)病率約為1%～2%[1]。盡管RSA 的病理生理過(guò)程仍不是很清楚，但是絨毛中的滋養(yǎng)細(xì)胞在其中起著重要作用[2]。目前，有研究表明轉(zhuǎn)錄因子尾側(cè)型同源轉(zhuǎn)錄因子2（caudal type homeobox 2，CDX2）、GATA 結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）與轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白2C（transcription factor activator protein 2C，TFAP2C）參與囊胚分化和滋養(yǎng)層干細(xì)胞形成過(guò)程中的發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[3～5]。然而有關(guān)CDX2、GATA3、TFAP2C 在RSA病理狀態(tài)下的表達(dá)的研究還未見報(bào)道。本次研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)RSA 患者絨毛組織中CDX2、GATA3、TFAP2C 與腫瘤增殖抗原67（tumor proliferation antigen 67，Ki67）的表達(dá)，探討這些重要分子在RSA發(fā)病中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020 年8 月至2021 年5 月在湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科就診的RSA 患者8 例為RSA 組。納入標(biāo)準(zhǔn)包括：①單胎妊娠；②有腹痛、陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀，經(jīng)B 超檢測(cè)證實(shí)無(wú)胚胎心臟跳動(dòng)；③妊娠≤12 周，與同一伴侶流產(chǎn)≥3 次。排除標(biāo)準(zhǔn)包括：①有生殖系統(tǒng)異常、糖尿病、甲狀腺功能異常等全身性疾病患者；②有家族復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)病史、外科手術(shù)和醫(yī)療并發(fā)癥史患者；③有染色體、解剖、內(nèi)分泌感染、免疫方面問(wèn)題患者；④服用過(guò)藥物患者或男方精子質(zhì)量及活動(dòng)度不正常。本次研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象及家屬簽署知情同意書。選擇本院同期非意愿早期妊娠，要求行人工流產(chǎn)術(shù)正常早孕者8 例為正常流產(chǎn)組，兩組一般資料比較見表1。兩組的年齡、孕周、孕囊大小比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 兩組一般資料比較

1.2 絨毛組織采集與保存 RSA 組行清宮手術(shù)后留取絨毛組織。正常流產(chǎn)組行人工流產(chǎn)術(shù)時(shí)留取胎盤絨毛組織。絨毛組織用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗后，放入4%的福爾馬林溶液進(jìn)行固定，用于后續(xù)的石蠟包埋和切片。載玻片用多聚賴氨酸包被，組織切片厚度約為4 μm，55 ℃烤干，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化 常規(guī)進(jìn)行石蠟包埋和切片（4 μm），二甲苯進(jìn)行脫蠟后通過(guò)下行梯度酒精水化、320 W微波照射5 min 進(jìn)行抗原修復(fù)。漂洗后，加入山羊血清封閉液進(jìn)行封閉，20 min后依次加入一抗（室溫1 h）、二抗（37 ℃1 h），DAB 顯色（5 min），蘇木精復(fù)染（2 min），乙醇梯度脫水，中性樹膠封片，進(jìn)行鏡檢采集圖像。結(jié)果由專業(yè)醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行計(jì)數(shù)。隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)絨毛中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)，取平均值。細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕色顆粒表示該組織細(xì)胞內(nèi)有相應(yīng)的抗原（多肽和蛋白質(zhì)）為陽(yáng)性，沒(méi)有棕色表示該組織細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有相應(yīng)抗原為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組絨毛組織中CDX2、GATA3、TFAP2C 與Ki67蛋白表達(dá)示意圖見圖1

圖1 兩組絨毛組織中CDX2、GATA3、TFAP2C與Ki67蛋白表達(dá)示意圖（蘇木精染色，×40倍）

由封二圖1 可見，相較于正常流產(chǎn)組，RSA 組免疫組化結(jié)果顯示，CDX2 的特異性的表達(dá)分布在絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中；TFAP2C 的表達(dá)主要分布在絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中，但同時(shí)在部分合體滋養(yǎng)層細(xì)胞也有表達(dá)；GATA3 的表達(dá)主要分布在絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中，但合體滋養(yǎng)層細(xì)胞也有少量表達(dá)；Ki67 的表達(dá)主要分布在絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中，同時(shí)在部分絨毛柱中也有Ki67表達(dá)。

2.2 兩組絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中CDX2、GATA3、TFAP2C與Ki67表達(dá)比較見表2

表2 兩組絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中CDX2、GATA3、TFAP2C與Ki67表達(dá)比較

由表2 可見，與正常流產(chǎn)組比較，CDX2、GATA3與Ki67 在RSA 組絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)均明顯減少（t分別=10.49、11.59、10.71，P均＜0.05），而TFAP2C 在兩組滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯差異（t=0.50，P＞0.05）。

3 討論

RSA發(fā)病原因復(fù)雜。絨毛組織中滋養(yǎng)細(xì)胞作為胎盤組織的主要細(xì)胞類型，其增殖、分化、侵襲和遷移能力的異常與妊娠失敗密切相關(guān)[6]。近年來(lái)許多學(xué)者指出發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞的功能異常與某些蛋白的表達(dá)異常相關(guān)。

CDX2 屬尾型同源框轉(zhuǎn)錄因子，目前已有研究證實(shí)其是滋養(yǎng)外胚層早期特化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，對(duì)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞起維持的作用[7]。利用基因敲除技術(shù)，降低CDX2 的表達(dá)，促進(jìn)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎不能著床[8]。最近研究結(jié)果證明轉(zhuǎn)錄因子GATA3 在促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞命運(yùn)中與CDX2 起平行作用[3]。進(jìn)一步的研究顯示，下調(diào)GATA3 可降低CDX2 在小鼠胚胎中的表達(dá)，抑制桑葚胚向囊胚的轉(zhuǎn)化[9]。本次研究結(jié)果顯示，CDX2 與GATA3在RSA的絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)明顯減少（P均＜0.05），表明CDX2、GATA3可能是導(dǎo)致絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力降低，孕卵發(fā)育受阻，妊娠失敗的原因。

TFAP2C 是AP2 家族成員之一，存在于著床前胚胎的所有細(xì)胞中。在體外，胚胎干細(xì)胞系以未分化狀態(tài)表達(dá)TCFAP2C，以及在向滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)TCFAP2C。進(jìn)一步的研究證明TCFAP2C 和CDX2 協(xié)同覆蓋多能性程序，并在小鼠胚胎中對(duì)胚胎外滋養(yǎng)層起維持作用[10]。本次研究結(jié)果顯示，TCFAP2C 在兩組的絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），提示TCFAP2C 的表達(dá)可能與RSA 的發(fā)生無(wú)明顯相關(guān)。值得注意的是，部分合體滋養(yǎng)層細(xì)胞中觀察到TFAP2C 和GATA3的表達(dá)，其原因有待進(jìn)一步的研究。

最近研究表明，滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖的過(guò)程是妊娠進(jìn)展的重要調(diào)節(jié)因素，增殖過(guò)度或不足都會(huì)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。Ki67作為一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)記物可準(zhǔn)確地反映細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞分裂活躍即可見其大量表達(dá)。Elsalam 等[11]發(fā)現(xiàn)Ki67 的表達(dá)在自然流產(chǎn)的滋養(yǎng)層細(xì)胞中明顯低于同時(shí)期選擇性流產(chǎn)病例。本次研究結(jié)果顯示，Ki67 的表達(dá)主要分布在絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞核中，同時(shí)在部分絨毛柱中也有Ki67 表達(dá)，RSA 組患者的絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞中Ki67表達(dá)明顯減少（P＜0.05），表明絨毛組織滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖減弱，Ki67 與RSA 有一定的相關(guān)性。

綜上所述，CDX2、GATA3 與Ki67 在RSA 患者絨毛組織中的表達(dá)明顯低于正常流產(chǎn)患者，表明CDX2、GATA3 與Ki67 可望成為RSA 有價(jià)值的生物標(biāo)記物，為RSA 的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。本次研究中也存在一定的不足之處。首先，沒(méi)有評(píng)估CDX2、GATA3 與Ki67 軸對(duì)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)控作用。第二，臨床樣本較小，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)誤差，需要進(jìn)一步進(jìn)行更多樣本的研究來(lái)證實(shí)結(jié)果。