逍遙散對慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及NGF、p75NTR表達(dá)的影響?

張 錚， 洪妙瑩， 藍(lán)敏敏， 陳 嬡， 鄭于林， 肖華業(yè)△， 李曉紅,2△

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)基礎(chǔ)研究重點實驗室， 南寧 530200)

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、白術(shù)、白芍、茯苓、甘草、燒生姜、薄荷等8味藥物組成，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾之功效。逍遙散在宋代主要用于婦科，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于婦科、內(nèi)科、外科、兒科、皮膚科等臨床各科疾病，是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典名方，也是抗應(yīng)激損傷的經(jīng)典方劑之一。肝郁脾虛證是指肝失疏泄、脾失健運所致的中醫(yī)證候。情志異常是肝郁脾虛證的主要誘因，現(xiàn)今社會生活節(jié)奏快，競爭激烈，各方面的壓力不斷增加，再加上起居不規(guī)律等因素均可引起人們心理負(fù)荷加重，易導(dǎo)致情志抑郁、肝氣不舒，使得肝郁脾虛證成為臨床的常見證候。

慢性應(yīng)激病理生理過程與中醫(yī)情志疾病證候形成過程相似[1]。目前肝郁脾虛證動物模型常采用情志刺激造模，慢性束縛應(yīng)激是常用造模方法之一[2]。研究表明, 大鼠接受第21天慢性束縛應(yīng)激模擬從肝郁到脾虛的演變過程, 束縛應(yīng)激第7天 符合“肝郁證”表現(xiàn)，束縛應(yīng)激第21天符合“肝郁脾虛證”表現(xiàn)[3，4]。對海馬基因表達(dá)譜的研究則發(fā)現(xiàn)，大鼠束縛應(yīng)激第7天，海馬組織顯著激活“對刺激的反應(yīng)”這一生物過程的功能，而束縛應(yīng)激的第21天，海馬組織基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示出“海馬神經(jīng)元凋亡與增生平衡紊亂，神經(jīng)元凋亡加速，生長受到抑制”[5]。這些研究從宏觀表征觀察和微觀指標(biāo)檢測分析均提示，束縛應(yīng)激第7天的大鼠對應(yīng)激反應(yīng)增強，束縛應(yīng)激第21天由于應(yīng)激時間較長，大鼠進(jìn)一步耗盡機體貯存的能量，對應(yīng)激的抗拒減少，對應(yīng)激的反應(yīng)減退。在前期多項研究結(jié)果顯示，第21天慢性束縛應(yīng)激大鼠存在抑郁、焦慮、學(xué)習(xí)記憶功能減退等表現(xiàn)，并部分揭示出可能的發(fā)病機制，而逍遙散對應(yīng)激大鼠的上述癥狀表現(xiàn)均具有明顯的改善作用[4,6-9]。為進(jìn)一步探尋其發(fā)生機制及逍遙散的作用機理，本研究通過慢性束縛應(yīng)激方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，動態(tài)觀察了應(yīng)激大鼠血清神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75NTR(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)的含量變化及海馬和下丘腦組織中NGF、p75NTR的基因表達(dá)變化及逍遙散的調(diào)節(jié)作用。本研究通過廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號DW20190111-009)。

1 材料

1.1 動物

SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SCXK(桂)2009-0002。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心普通級動物房，常規(guī)喂飼飼料及飲用水，室溫20～22 ℃，相對濕度50%～60%，光照節(jié)律 12 L∶12 D(7∶00 ～19∶00)。

1.2 藥物

實驗所用中藥復(fù)方逍遙散選自《太平惠民和劑局方》，藥物購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院。藥物組成：柴胡30 g、白芍30 g、當(dāng)歸30 g、茯苓30 g、白術(shù)30 g，炙甘草15 g，薄荷10 g(后下)，燒生姜10 g，用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器

Trizol試劑盒(貨號15596026)，美國Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號639505)，TAKARA公司；YBR Green PCR 試劑盒(貨號KM4101)，KAPA Biosystems公司；Rat NGF、p75NTR ELISA試劑盒(貨號JYM0643Ra、JYM1161Ra)，基因美公司。

PCR儀(型號GE48527)，杭州柏恒科技有限公司；熒光定量PCR儀(型號CFX-Connect 96)，美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀(型號DNM-9602)，北京普朗新技術(shù)有限公司；BW-MWM101水迷宮(直徑150 cm、高70 cm，平臺直徑15 cm、高40 cm)，上海軟隆科技發(fā)展有限公司；ANY-MAZE動物行為學(xué)分析系統(tǒng)(版本號4.99 m)，美國Stoelting。

2 方法

2.1 分組與模型制備

將50只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、第7天模型組、第7天逍遙散組、第21天模型組、第21天逍遙散組每組各10只。采用慢性束縛應(yīng)激方法造模[9]，除正常組以外的各組大鼠均用束縛架進(jìn)行捆綁束縛，每日于18∶00～6∶00點間隨機束縛3 h，第7天模型組和第7天逍遙散組捆綁束縛7 d，第21天模型組和第21天逍遙散組捆綁束縛21 d；從造模第1天開始每日在捆綁前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據(jù)成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠用藥量為16. 7 g/(kg·d)，灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)7 d和21 d；正常組、模型組大鼠每日灌服同等換算量的0.9%氯化鈉溶液，造模期間根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

2.2 Morris水迷宮實驗

水迷宮實驗是通過觀察實驗動物學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中平臺的方法來測試其對空間位置覺和方向覺(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。水迷宮分4個象限，在第3象限設(shè)一平臺，記錄大鼠在 60 s 內(nèi)找到平臺的時間，實驗分為訓(xùn)練期和去平臺期。訓(xùn)練期將各組大鼠按第1、2、3、4象限的順序依次放入水中，大鼠在60 s內(nèi)能尋找到平臺則記錄其登上平臺所需要的時間。若大鼠在60 s內(nèi)未能找到平臺則由實驗者用手將其引導(dǎo)至平臺，時間記為60 s，隨后讓其在平臺上停留30 s，以根據(jù)4個象限的參照物進(jìn)行空間學(xué)習(xí)和記憶。每天每只大鼠訓(xùn)練4次共4 d，每只大鼠總計訓(xùn)練16次。去平臺期撤除水中平臺，以原平臺對角象限為入水點，將大鼠面朝池壁置入水中游泳60 s，記錄大鼠首次穿過原平臺區(qū)域的時間，若60 s內(nèi)未穿過記為60 s。本實驗在訓(xùn)練期對大鼠共進(jìn)行16次訓(xùn)練，造模期間不再進(jìn)行任何訓(xùn)練，在造模的第0、7、21天分別對大鼠進(jìn)行去平臺觀察，并記錄大鼠首次穿過原平臺區(qū)域的時間。

2.3 取材

造模第7天和第21天結(jié)束且各組大鼠水迷宮實驗測試完畢后處死大鼠取材。10%水合氯醛腹腔注射，深度麻醉后斷頭取腦、取血，冰上剝離下丘腦和海馬組織，-80 ℃保存，用于熒光定量PCR實驗。

2.4 大鼠血清NGF、p75NTR含量測定

采用ELISA法檢測血清NGF、p75NTR含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 熒光定量PCR檢測下丘腦、海馬組織NGF、p75NTR 的mRNA表達(dá)

Trizol 法從下丘腦、海馬組織中提取總RNA，微量核酸蛋白分析儀檢測RNA濃度、純度及完整性，將 RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用20 μL反應(yīng)體系行PCR擴增，所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。PCR引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。GAPDH上游：5′-CAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游：5′-CCAGTAGACTCCACGACAT-3′，產(chǎn)物長度138bp；NGF上游：5′-ACCCGCAACATCACTG-3′，下游：5′-TCTTATCTCCAACCCACA-3′，產(chǎn)物長度241bp；p75NTR上游：5′-ACGACCAGCAGACCCAT-3′，下游：5′-TTTCTCTACCTCCTCACGC-3′，產(chǎn)物長度104bp。采用2-△△Ct計算NGF、p75NTR 的mRNA相對表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠水迷宮實驗首次進(jìn)入平臺區(qū)域時間

表1示，各組大鼠第0天首次進(jìn)入平臺區(qū)域時間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。第7天各組大鼠進(jìn)入平臺區(qū)域時間均較第0天下降，其中以第7天和第21天模型組下降最為明顯，但與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；第7天逍遙散組與第7天模型組及第21天逍遙散組與第21天模型組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與正常組比較，第21天模型組大鼠首次進(jìn)入平臺區(qū)域時間顯著增加(P<0.01)；與第21天模型組比較，第21天逍遙散組首次進(jìn)入平臺區(qū)域時間顯著下降(P<0.01)。

表1 各組大鼠水迷宮首次進(jìn)入平臺區(qū)域時間比較

3.2 各組大鼠血清NGF、p75NTR含量

表2示，與正常組比較，第7天模型組大鼠血清NGF、p75NTR含量均顯著增加(P<0.01)，第21天模型組大鼠血清NGF含量顯著下降，p75NTR含量顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與第7天模型組比較，第7天逍遙散組血清NGF、p75NTR含量均顯著下降(P<0.01)；與第21天模型組比較，第21天逍遙散組血清NGF含量顯著上升，p75NTR含量顯著下降(P<0.05，P<0.01)。

3.3 各組大鼠下丘腦、海馬組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)比較

表3、4示，與正常組比較，第7天模型組大鼠下丘腦和海馬組織NGF、p75NTR的 mRNA表達(dá)均顯著增加(P<0.01)，第21天模型組大鼠下丘腦和海馬組織NGF的 mRNA表達(dá)均顯著下降，下丘腦p75NTR mRNA表達(dá)顯著下降，海馬p75NTR mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.05，P<0.01)。與第7天模型組比較，第7天逍遙散組下丘腦和海馬組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.01)；與第21天模型組比較，第21天逍遙散組下丘腦、海馬NGF和下丘腦p75NTR 的mRNA表達(dá)均顯著上升，海馬p75NTR 的mRNA表達(dá)顯著下降(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠血清NGF、p75NTR含量比較

表3 各組大鼠下丘腦組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)比較

表4 各組大鼠海馬組織NGF、p75NTR mRNA表達(dá)比較

4 討論

應(yīng)激是機體受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)。海馬是學(xué)習(xí)、記憶以及與認(rèn)知、情感有關(guān)的關(guān)鍵性腦區(qū)，下丘腦是情緒表達(dá)系統(tǒng)中的重要組成部分，是調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動和內(nèi)分泌活動的高級神經(jīng)中樞，海馬與下丘腦都是介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)最重要的腦區(qū)之一。NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中第一個被發(fā)現(xiàn)也是到目前為止研究得最清楚的一個神經(jīng)營養(yǎng)因子，在神經(jīng)元的存活、發(fā)育和維穩(wěn)、軸突的生長、突觸的形成以及損傷神經(jīng)的再生修復(fù)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，被視為認(rèn)知障礙的治療靶點[10，11]。如Wang等[12]發(fā)現(xiàn)，胚胎期缺乏NGF會增加小鼠神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。 Song 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NGF的表達(dá)增加可能有助于在急性腦損傷和中風(fēng)早期觀察到神經(jīng)炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。 趙軍等[14]的研究表明，海馬NGF的表達(dá)增加可改善1型糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。NGF主要通過與2種不同類型受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，一種是高親和力的酪氨酸激酶受體A(tyrosine kinase receptor A，TrkA)，另一種是低親和力的神經(jīng)營養(yǎng)因子受體p75NTR。TrkA與p75NTR均為跨膜蛋白受體，參與調(diào)節(jié)以神經(jīng)元為主的某些細(xì)胞的生長、分化、存活、凋亡以及修復(fù)等多種生物學(xué)效應(yīng)。TrkA是NGF的功能受體，一般介導(dǎo)正向信號傳導(dǎo)作用，如促進(jìn)神經(jīng)元生長并維持其存活；p75NTR為腫瘤壞死因子超家族成員之一，能與所有類型的NGF相結(jié)合，具有多向性功能，介導(dǎo)正向和反向信號2種效應(yīng)，除可促進(jìn)神經(jīng)元存活生長外，還可抑制神經(jīng)元軸突生長并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。p75NTR 可協(xié)助TrkA 受體發(fā)揮功能，當(dāng) p75NTR和TrkA 同時存在時，p75NTR 可增加TrkA 與NGF 的親和力，同時還能加快TrkA與NGF的結(jié)合速率[15]，從而發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)生長與存活的作用；當(dāng)TrkA缺如時，NGF與p75NTR的結(jié)合則會介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[16]，同時p75NTR可與sortilin受體形成復(fù)合物，以更高的親和力與proNGF相結(jié)合，以誘導(dǎo)凋亡信號通路的激活[17]。

本實驗結(jié)果表明，大鼠應(yīng)激第7天后，NGF、p75NTR在下丘腦和海馬組織中的mRNA表達(dá)及血清中的含量均顯著增加，而應(yīng)激第21天后，NGF在下丘腦和海馬組織中的mRNA表達(dá)及血清中的含量均出現(xiàn)顯著降低，p75NTR在血清中的含量和海馬中的mRNA表達(dá)仍然顯著升高，在下丘腦中的mRNA表達(dá)則顯著降低。水迷宮實驗顯示，在第7天應(yīng)激時大鼠出現(xiàn)了記憶能力的增強，第21天則學(xué)習(xí)記憶能力減退。本次研究結(jié)果與Aloe、BS、汪洋等結(jié)果一致。Aloe等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，新兵首次跳傘后血清NGF水平增加了107%，同時跳傘應(yīng)激還增強了外周血單個核細(xì)胞中p75NTR和TrkA受體的分布。BS等[19]發(fā)現(xiàn)，在急性而非慢性強光曠場應(yīng)激中，成年和老年大鼠海馬CA1和CA3區(qū)NGF細(xì)胞密度增加。汪洋等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者血清NGF含量降低。至于慢性應(yīng)激影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶，以往已有大量的文獻(xiàn)報道，因此結(jié)合文獻(xiàn)報道和前期研究，推斷大鼠應(yīng)激第7天時，NGF水平在海馬和下丘腦出現(xiàn)的顯著上升為保護(hù)性上升，其目的可能是在急性應(yīng)激狀態(tài)下增加神經(jīng)元突觸的發(fā)生，以確保機體在面對應(yīng)激時具有較強的抵抗力；而p75NTR顯著上升則可能有助于TrkA與NGF相結(jié)合，加快其結(jié)合速率，為機體抵抗應(yīng)激做準(zhǔn)備。大鼠應(yīng)激第21天后，NGF在海馬和下丘腦顯著下降，提示應(yīng)激大鼠海馬與下丘腦的神經(jīng)元密度可能較正常大鼠減少；而海馬p75NTR在NGF下降的情況下顯著上升，可能更加速了海馬神經(jīng)元的凋亡與海馬功能的損害；而下丘腦p75NTR與NGF的同步下調(diào)，可能減弱了Trk與NGF的結(jié)合速率，因此維持下丘腦神經(jīng)元的活性必定受到影響，更進(jìn)一步導(dǎo)致下丘腦功能受損。長期的臨床和實驗研究表明，逍遙散對肝郁脾虛證及應(yīng)激性疾病具有很好的療效[21-23]，本實驗中逍遙散也表現(xiàn)出良好的作用，能明顯提高應(yīng)激大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，逆轉(zhuǎn)應(yīng)激大鼠海馬、下丘腦和血清中NGF、p75NTR的異常表達(dá)，使其趨于正常水平。

綜上所述，第21天慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠下丘腦、海馬組織NGF、p75NTR的表達(dá)異常，可能是應(yīng)激大鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能減退、焦慮、抑郁的機制之一，而調(diào)節(jié)NGF、p75NTR的異常表達(dá)亦可能是逍遙散改善應(yīng)激大鼠學(xué)習(xí)記憶和焦慮、抑郁的機制之一，但其具體機制均有待于進(jìn)一步的研究。此外研究表明，NGF和p75NTR 在神經(jīng)系統(tǒng)之外也發(fā)揮著重要作用，如調(diào)控炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等。前期的研究也發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激大鼠出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、免疫功能失調(diào)、多條與腫瘤相關(guān)的通路被激活等表現(xiàn)，那么應(yīng)激大鼠體內(nèi)NGF和p75NTR的表達(dá)異常是否也參與了這些病理機制，亦有待于今后更深入的研究。