骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生外泌體對(duì)脊髓損傷動(dòng)物治療作用的系統(tǒng)綜述

魏娟芳，王琳杰，崔艷如，岑秋宇，張安仁

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，四川成都市 610075；2.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都市 610031；3.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，上海市200434

0 引言

脊髓損傷通常包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷：原發(fā)性損傷指脊髓在直接作用力下造成的損傷；而繼發(fā)性損傷導(dǎo)致的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，損傷程度有時(shí)可大于原發(fā)性損傷，包括脊髓缺血水腫、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡和脫髓鞘、興奮性氨基酸和離子失衡及功能障礙[1-2]。脊髓原發(fā)性和繼發(fā)性損傷是脊髓產(chǎn)生不可逆損傷的關(guān)鍵性因素[2-4]；大量活性氧、谷氨酸和內(nèi)流Ca2+是產(chǎn)生細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡的主要原因之一[1-2]。各種病理變化相互聯(lián)系，共同作用，最后導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和脊髓組織破壞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)移植具有神經(jīng)再生、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)特性，有望成為治療脊髓損傷的突破口；但免疫排斥和可能的腫瘤形成限制其應(yīng)用。BMSC 的治療效果主要取決于可溶性旁分泌因子的釋放，外泌體(exosome,EXO)必不可少，BMSC 衍生的EXO (BMSC-EXO)有望替代BMSC 發(fā)揮作用[5]。BMSC-EXO 是BMSC起源的直徑30～150 nm膜囊泡，具有遞送率高、生物相容性高和免疫原性低等特性[6]；移植后可不同程度減輕病理變化和缺血缺氧，改善運(yùn)動(dòng)功能[7]。BMSC-EXO可通過改善運(yùn)動(dòng)功能和病理變化、促進(jìn)血管生成和軸突生長、維持血-脊髓微循環(huán)、抗炎、抗凋亡等機(jī)制發(fā)揮治療作用。見表1。BMSC-EXO 治療脊髓損傷的結(jié)局指標(biāo)和評(píng)定方法見表2。

表1 BMSC-EXO治療脊髓損傷的作用和機(jī)制

表2 BMSC-EXO治療脊髓損傷的結(jié)局指標(biāo)及評(píng)定方法

1 資料與方法

1.1 文獻(xiàn)檢索

計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫。檢索年限為建庫起至2021 年10 月。中文檢索詞：脊髓損傷、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、外泌體等。英文檢索詞：spinal cord injury、bone mesenchymal stem cells、exosome 等。檢索策略如下(以PuMed為例)：

#1 exosome

#2 spinal cord trauma

#3 spinal cord injury

#4 cord trauma,spinal

#5 trauma,spinal cord

#6 traumatic myelopathy

#7 spinal cord laceration

#8 spinal cord injuries

#9 laceration,spinal cord

#10 spinal cord contusion

#11 cord contusion,spinal

#12 #2 OR #3 OR #4 OR #5 OR #6 OR #7 OR #8 OR #9 OR#10 OR#11

#13 bone mesenchymal stem cells

#14 bone marrow mesenchymal stem cell

#15 bone marrow stromal cell

#16 bone marrow stromal cells,multipotent

#17 bone marrow stromal stem cells

#18 bone marrow mesenchymal stromal cell

#19#13 OR#14 OR#15 OR#16 OR#17 OR#18

#20#1 AND#12 AND#19

納入標(biāo)準(zhǔn)：①采用BMSC 治療脊髓損傷的動(dòng)物隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)；②疾病為脊髓損傷，動(dòng)物種屬和造模方法不限；③干預(yù)措施為BMSC-EXO 治療和安慰劑或其他對(duì)照；④主要結(jié)局指標(biāo)為運(yùn)動(dòng)功能、脊髓組織病理學(xué)、抗炎、抗凋亡、軸突和血管生長、血-脊髓屏障的滲透性等。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表；②非中、英文文獻(xiàn)；③無干預(yù)；④非對(duì)照研究；⑤無相關(guān)結(jié)局指標(biāo)；⑥數(shù)據(jù)不全；⑦灰色文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)篩選和資料提取

由2 名研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)，進(jìn)行資料和數(shù)據(jù)提取，并進(jìn)行交叉核對(duì)；若有意見不一，則進(jìn)行協(xié)商或由第三者協(xié)助判定。提取的資料包括：第一作者、發(fā)表年份、樣本量、動(dòng)物種屬、體質(zhì)量、動(dòng)物模型、造模方式、干預(yù)方式和結(jié)局指標(biāo)。篩選流程見圖1。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程

1.3 質(zhì)量評(píng)價(jià)

采用SYRCLE 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具(SYRCLE's risk of bias tool for animal studies)[24]進(jìn)行偏倚風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。SYRCLE 工具包括10 個(gè)條目，涉及選擇、實(shí)施、測量、失訪、報(bào)告和其他偏倚6種類型，結(jié)果以“是”“否”和“不確定”表示，分別代表偏倚風(fēng)險(xiǎn)“低”“高”和“不確定”。

證據(jù)質(zhì)量評(píng)估采用定性研究綜述證據(jù)評(píng)估(Confidence in the Evidence from Reviews of Qualitative research,CERQual)[25]，包括4 個(gè)方面：方法學(xué)局限性、相關(guān)性、一致性、數(shù)據(jù)充分性。信度分級(jí)為高、中、低、極低。

由2 名研究者獨(dú)立對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并進(jìn)行交叉核對(duì)；如意見不一，則進(jìn)行協(xié)商或由第三者協(xié)助判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

由于納入的動(dòng)物研究存在臨床異質(zhì)性和方法學(xué)異質(zhì)性，難以進(jìn)行定量分析，故進(jìn)行定性分析和Scoping分析[26-27]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

最終納入21篇文獻(xiàn)[5,10-11,13-15,17,19,21-22,28-38]，其中中文4篇，英文17篇。納入文獻(xiàn)一般情況見表3。

表3 納入研究的一般情況

2.2 文獻(xiàn)質(zhì)量

2.2.1 偏倚風(fēng)險(xiǎn)

21項(xiàng)研究數(shù)據(jù)均完整；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基線情況均有報(bào)道，具有可比性；21項(xiàng)研究均提及“隨機(jī)”或“隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)”，預(yù)期結(jié)果均得到報(bào)道；所有研究均對(duì)動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)化安置；所有研究均未明確交代對(duì)實(shí)施者和研究者盲法的使用；12項(xiàng)研究報(bào)告結(jié)果評(píng)估的隨機(jī)性；15 項(xiàng)研究報(bào)告評(píng)價(jià)者盲法；20 項(xiàng)研究無其他偏倚。見表4。

表4 納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)

2.2.2 證據(jù)質(zhì)量

根據(jù)CERQual評(píng)估結(jié)果見表5。

表5 CERQual評(píng)估結(jié)果

2.3 系統(tǒng)評(píng)價(jià)

18 項(xiàng)研究選用雄性或雌性Sprague-Dawley 大鼠[5,10-11,14-15,17,19,21-22,28-29,31-34,36-38]，2 項(xiàng)研究為雄性Wistar 大鼠[30,35]，1 項(xiàng)研究 為雄性C57BL/6 小鼠[13]。除了2 項(xiàng) 研究只報(bào)告年齡為6～8 周外[11,13]，其他研究均報(bào)告體質(zhì)量(200±50)g。損傷節(jié)段集中于T9-11，但損傷方式存在差異，1 項(xiàng)采用鉗夾模型[11]，1 項(xiàng)為橫斷模型[33]，其他研究均為挫傷模型，打擊器和力度有所差異。干預(yù)措施存在較大異質(zhì)性，外泌體類型、干預(yù)時(shí)間、頻率、濃度和劑量等均不相同；對(duì)照干預(yù)，2 項(xiàng)使用生理鹽水[28-29]，2 項(xiàng)使用磷酸鹽溶液[36-37]，其他研究均使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)。由于納入研究在動(dòng)物種屬、造模方式、干預(yù)方法和結(jié)局指標(biāo)測量等方面存在較大異質(zhì)性，無法進(jìn)行Meta分析。

2.3.1 運(yùn)動(dòng)功能

21 項(xiàng)研究均報(bào)告運(yùn)動(dòng)功能，20 項(xiàng)采用BBB 評(píng)分，1 項(xiàng)研究采用Basso 小鼠量表評(píng)分[13]；3 項(xiàng)研究聯(lián)合BBB 和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位評(píng)估運(yùn)動(dòng)功能[11,13,19]，其中Huang等[19]還采用熱敏度和尿斑面積定量進(jìn)行評(píng)定；3 項(xiàng)研究聯(lián)合BBB 和斜板實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)定[35-37]。21 項(xiàng)研究均報(bào)告外泌體治療后運(yùn)動(dòng)功能改善，CERQual 信度分級(jí)高，結(jié)果可靠。

2.3.2 組織病理學(xué)

19 項(xiàng)研究報(bào)告脊髓組織病理，9 項(xiàng)采用HE 染色觀察脊髓組織形態(tài)[5,11,28-29,33-34,36-38]，9 項(xiàng)采用尼氏染色觀察神經(jīng)元損傷[5,15,21-22,28-30,36-37]，8 項(xiàng)采用免疫熒光觀察相應(yīng)蛋白和細(xì)胞表達(dá)[5,13,22,28-29,32,35,38]，2 項(xiàng)采用MRI 觀察病變總面積和體積[13,32]，2項(xiàng)采用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化[5,38]，2 項(xiàng)采用固藍(lán)染色觀察髓鞘病理變化[36-37]。19 項(xiàng)研究均報(bào)告，外泌體移植后脊髓組織病理改善，CERQual信度分級(jí)高，結(jié)果可靠。

2.3.3 凋亡

11 項(xiàng)研究報(bào)告脊髓組織細(xì)胞凋亡[5,10,14-15,19,21-22,28-30,38]，8 項(xiàng)采用TUNEL 染色觀察神經(jīng)元凋亡率[10,14-15,21-22,28-30]，外泌體干預(yù)后TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)量減少；2項(xiàng)觀察凋亡相關(guān)蛋白[14-15]，治療后促凋亡蛋白caspase-3/9 和Bax 下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2 上調(diào)，其中Luo 等[15]觀察到通過下調(diào)谷氨酸改善凋亡；1 項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)caspase-1 下調(diào)[38]。研究顯示，外泌體移植可對(duì)抗脊髓組織細(xì)胞凋亡，CERQual信度分級(jí)中等，結(jié)果較為可靠。

2.3.4 炎癥

11 項(xiàng)研究觀察脊髓損傷動(dòng)物的炎癥[5,10-11,13,19,21,31-32,34-35,38]，6 項(xiàng)觀察炎性因子[5,10,19,21,31,38]；3項(xiàng)觀察NF-κB[13,34-35]；3 項(xiàng)報(bào)告治療后小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向M2 表型極化[10,13,34]；3 項(xiàng)發(fā)現(xiàn)A1 型星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度減輕[11,32,38]。研究顯示，外泌體移植后，脊髓組織炎癥減輕，CERQual信度分級(jí)中等，結(jié)果較為可靠。

2.3.5 BSCB通透性

3 項(xiàng)研究觀察脊髓損傷后BSCB 通透性的變化[5,17,22]，均采用伊文思藍(lán)評(píng)估，還有研究聯(lián)合觀察claudin-5、occludin、ZO-1 等的水平[17]，3 項(xiàng)研究均顯示，外泌體移植抑制周細(xì)胞焦亡，從而減輕BSCB 滲漏和脊髓水腫，減少緊密連接蛋白丟失。外泌體移植可降低BSCB 的滲透性，CERQual 信度分級(jí)低，結(jié)果可靠性低。

2.3.6 軸突生長

1 項(xiàng)研究觀察軸突生長[11]，并通過神經(jīng)絲蛋白和β-Tubulin 評(píng)估神經(jīng)再生，發(fā)現(xiàn)外泌體干預(yù)促進(jìn)PC12細(xì)胞中神經(jīng)絲生成，促進(jìn)軸突再生，減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成。CERQual信度分級(jí)低，結(jié)果可靠性低。

2.3.7 血管生長

1 項(xiàng)研究觀察血管生長[21]，采用免疫熒光染色測定，發(fā)現(xiàn)血管數(shù)在外泌體治療后增多。CERQual信度分級(jí)低，結(jié)果可靠性低。

3 討論

脊髓組織損傷后，會(huì)發(fā)生脊髓出血水腫、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和脫髓鞘、興奮性氨基酸與離子失衡及功能障礙等一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致腦脊液中膠質(zhì)纖維酸性蛋白和白細(xì)胞介素-6 增多，進(jìn)一步產(chǎn)生活性氧和谷氨酸，過多的谷氨酸與其受體N-甲基-D-天冬氨酸、D-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑丙酸、紅藻氨酸離子和代謝性受體等結(jié)合，持續(xù)產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，加快神經(jīng)元凋亡和壞死；加速Ca2+和Na+內(nèi)流，進(jìn)一步加快細(xì)胞死亡和軸突去極化脫髓鞘[1-2]。其各種病理變化相互作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和脊髓組織破壞。

BMSC 是具有多種分化潛能的多能干細(xì)胞，可分泌大量外泌體，稱為BMSC-EXO。外泌體含有大量復(fù)雜分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等[39]，其中蛋白質(zhì)主要參與代謝、能量通路、細(xì)胞生長、通信和運(yùn)輸[40]，核酸包括mRNA、microRNA 和其他非編碼RNA(ncRNA)。外泌體可作為有效載體將特定的蛋白、脂質(zhì)或核酸傳遞給受體細(xì)胞，從而參與生理和病理過程[41]；外泌體通過促進(jìn)血管生成和軸突生長，調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡，維持BSCB 的完整性，單純外泌體移植比單純干細(xì)胞移植效果更好[16]。

本研究顯示，BMSC-EXO移植可促進(jìn)脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，減少脊髓受損程度，增加殘存組織體積，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；可能的機(jī)制包括抗凋亡、抗炎、減輕BSCB 通透性、促進(jìn)軸突和血管生長等。BMSC-EXO 的抗炎作用還可能與microRNAs 相關(guān)，如microRNA-21、microRNA146a-5p等[42]。

BMSC-EXO 可上調(diào)血管生成關(guān)鍵基因的表達(dá)[43]，誘導(dǎo)軸突生長和減少硫酸軟骨素蛋白聚糖的產(chǎn)生，緩解神經(jīng)傳導(dǎo)障礙。

本研究納入的文獻(xiàn)有較大異質(zhì)性，造模方法是異質(zhì)性產(chǎn)生的基本原因；干預(yù)措施除劑量、時(shí)間、濃度不同外，還存在外泌體類型差異，包括單純外泌體和以不同microRNA修飾的外泌體。

本研究只納入公開發(fā)表的中、英文文獻(xiàn)，對(duì)灰色文獻(xiàn)檢索不夠，可能會(huì)產(chǎn)生偏倚；納入研究沒有進(jìn)行功效分析以確定樣本量大小；部分研究未報(bào)告分組隱蔽和施盲，可能產(chǎn)生盲法偏倚；納入研究存在異質(zhì)性，無法進(jìn)行定量分析。

綜上所述，BMSC-EXO可改善脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能，減少脊髓組織受損，增加殘存體積，可能通過抗凋亡、抗炎、減輕BSCB 通透性、促進(jìn)軸突和血管生長等多種作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)。受納入研究數(shù)量和質(zhì)量限制，上述結(jié)論尚待更多高質(zhì)量研究予以驗(yàn)證。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。