柚皮苷對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠的療效及Notch信號(hào)通路的影響研究?

趙 偉 程玉婷 周海東 張中琳

（上海市第十人民醫(yī)院，上海 200443）

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種急腹癥，常伴有多系統(tǒng)、多器官功能損害或衰竭［1］。SAP的發(fā)病和發(fā)展特點(diǎn)是變化迅速，病情復(fù)雜，治療困難［2］。研究表明，急性胰腺炎的特征是間質(zhì)水腫、腺泡細(xì)胞空泡化［3］。約25%的急性胰腺炎患者會(huì)發(fā)展為SAP，死亡率約為22.7%［4］。這種疾病的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。Notch信號(hào)通路是一種高度保守的分子細(xì)胞信號(hào)通路，由Notch受體（1，2，3，4型）、Notch配體（DSL蛋白）和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子CSL蛋白（DNA結(jié)合蛋白）組成，其表達(dá)水平與多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)，并且參與機(jī)體血管的生成［5］。孔令宇等［6］研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch信號(hào)的激活，可減少急性胰腺炎小鼠胰腺組織胰腺腺泡細(xì)胞的壞死，減少炎癥反應(yīng)。Notch信號(hào)通路與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，有研究表明，Notch1的表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞發(fā)育相關(guān)，從而影響機(jī)體炎癥因子水平的變化［7］。柚皮苷屬于雙氫黃酮類化合物，其主要成分為葡萄糖、鼠李糖和柚配質(zhì)，具有防治心血管疾病、抗過敏、抗炎等功效［8］。王婷婷等［9］研究表明，柚皮苷可通過抑制細(xì)胞焦亡來(lái)減輕心肌缺血/再灌注損傷大鼠心肌細(xì)胞損傷及炎癥反應(yīng)。但柚皮苷對(duì)SAP是否有治療作用尚未有報(bào)道。因此，本研究通過建立SAP大鼠模型，探討柚皮苷對(duì)SAP大鼠及Notch信號(hào)通路的影響，為治療SAP的潛在藥物和治療靶點(diǎn)的開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)SD大鼠（雌雄各半），購(gòu)自北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院有限公司［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0047］，體質(zhì)量220～240 g，所有大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫20～25℃，濕度40%～60%，光照晝夜交替（12 h/12 h），自由飲水飲食。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 柚皮苷（河南萊爾茵生物科技有限公司，原料藥，純度99.95%，批號(hào)10387-19-4，將柚皮苷用生理鹽水溶解成質(zhì)量濃度為2.5、5、10 mg/mL的混懸液）；注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，規(guī)格：5萬(wàn)單位，批號(hào)20200405）。

1.3 試劑與儀器 ?；悄懰徕c（北京湯普森生物科技有限公司，批號(hào)205-479-4）；淀粉酶檢測(cè)試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、蘇木素-伊紅（HE）染色液（波音特生物科技南京有限公司，批號(hào)BYT-30477、BYT-2917、BYT-2903、BYT-30172、BYT-1055）；Notch1、DSL、CSL和β-actin單克隆抗體、兔抗鼠二抗（上海滬震生物科技有限公司，批號(hào)HZ-11357R、HZ-1047R、HZ-11859R、HZ-0146K、HZ-0174L）。酶標(biāo)儀（上?？迫A生物工程股份有限公司，型號(hào)ST-360）。顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)ECLIPSE Si）?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（北京托摩根生物科技有限公司，型號(hào)MG1500）。

1.4 分組與造模 各組大鼠在禁食、禁水12 h后，參照文獻(xiàn)［10］的方法，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，上腹正中出切開腹部，暴露胰膽管，血管夾夾閉肝門部位胰膽管，經(jīng)十二指腸刺入胰膽管，夾閉膽總管末端，注射1 mL/kg濃度為5%的?；悄懰徕c，觀察15～25 min，當(dāng)胰腺顏色變?yōu)榘导t，伴有腫大和出血時(shí)，表示SAP建模成功［10］。建模成功后，將大鼠傷口縫合。將建模成功的80只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（烏司他丁2×104U/kg）［11］和柚皮苷低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組［12］，每組16只。另外取16只大鼠僅上腹正中出切開腹部后縫合傷口設(shè)為假手術(shù)組。

1.5 給藥方法 各組大鼠均于術(shù)后1 h開始給藥，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腹腔注射2×104U/kg烏司他丁，柚皮苷低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射25、50、100 mg/kg柚皮苷，模型組和假手術(shù)組腹腔注射等量生理鹽水，各組大鼠注射體積均是10 mL/kg，每天給藥1次。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）血清淀粉酶和炎癥因子水平。48 h后于大鼠心臟采集血液3 mL，4℃2 500 r/min離心15 min，分離血清，檢測(cè)血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。2）胰腺病理組織。采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，解剖取胰腺組織，采用生理鹽水清洗組織表面血漬，然后放于甲醛溶液中固定48 h，最后制作HE染色切片并在顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)變化情況。3）胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平。取0.5 g大鼠胰腺組織放入玻璃研磨器中，加入1 mL放射免疫沉淀裂解緩沖液充分研磨，離心提取蛋白上清液，調(diào)節(jié)蛋白濃度使其為3 μg/mL，每孔上樣量為10 μL后進(jìn)行電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，5%脫脂奶粉溶液對(duì)硝化纖維素膜封閉2 h后，加入特異性抗體Notch1、DSL、CSL和β-actin一抗1∶2 000稀釋，孵育12 h（4℃），然后加入二抗（1∶3 000）孵育2 h，最后使用顯影劑在凝膠成像系統(tǒng)上顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間采用單因素方差分析比較，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清淀粉酶水平與炎癥因子水平比較 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組血清淀粉酶水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，柚皮苷低、中、高劑量組血清淀粉酶水平依次降低（P<0.05）；柚皮苷高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組血清淀粉酶水平無(wú)明顯差異（P>0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，柚皮苷低、中、高劑量組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平依次降低（P<0.05）；柚皮苷高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較，血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清淀粉酶及炎癥因子水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，?P<0.05；與模型組比較，◇P<0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，△P<0.05；與柚皮苷低劑量組比較，#P<0.05；與柚皮苷中劑量組比較，□P<0.05。下同。

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組柚皮苷低劑量組柚皮苷中劑量組柚皮苷高劑量組n 16 16 16 16 16 16血清淀粉酶（U/L）1 307.62±173.14 7 712.38±846.24*3 126.77±397.88◇6 072.84±703.52◇△4 542.77±521.19◇△#3 149.16±405.75◇#□TNF-α（pg/mL）19.15±2.17 57.12±6.52*26.17±3.05◇46.54±5.06◇△35.14±4.07◇△#26.25±3.13◇#□IL-1β（pg/mL）21.77±3.08 59.11±6.29*29.03±3.21◇47.42±5.17◇△38.52±4.94◇△#29.18±3.38◇#□IL-6（pg/mL）24.97±3.19 42.73±5.07*31.11±3.54◇39.05±4.57◇△35.92±3.91◇△#31.28±3.58◇#□

2.2 各組大鼠胰腺組織病理結(jié)構(gòu)比較 見圖1。假手術(shù)組大鼠胰腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、未見異常。模型組大鼠胰腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，邊界模糊并伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域有出血。柚皮苷和烏司他丁治療后，病理改變較模型組緩解，其中陽(yáng)性對(duì)照組和柚皮苷高劑量組最為明顯。

圖1 各組大鼠胰腺組織病理圖（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平比較 見表2，圖2。與假手術(shù)組比較，模型組胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，柚皮苷低、中、高劑量組胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平依次降低（P<0.05）；柚皮苷高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表2 各組大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽(yáng)性對(duì)照組柚皮苷低劑量組柚皮苷中劑量組柚皮苷高劑量組n 16 16 16 16 16 16 Notch1/β-actin 0.25±0.04 1.73±0.26*0.54±0.07◇1.17±0.19◇△0.84±0.14◇△#0.57±0.08◇#□DSL/β-actin 0.61±0.09 2.08±0.31*0.74±0.12◇1.70±0.24◇△1.09±0.17◇△#0.77±0.13◇#□CSL/β-actin 0.59±0.08 1.52±0.22*0.78±0.13◇1.19±0.20◇△0.97±0.16◇△#0.75±0.12◇#□

圖2 各組大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白印跡圖

3 討論

SAP可引起多器官功能發(fā)生障礙，當(dāng)疾病進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，可導(dǎo)致器官功能發(fā)生衰竭，甚至死亡［13］。Agh?dassi等［14］研究顯示，腺泡細(xì)胞蛋白酶的激活會(huì)對(duì)胰腺組織造成直接損傷，引起急性炎癥反應(yīng)。此外胰腺組織中的中性粒細(xì)胞多型體和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)胰腺，釋放自身的蛋白酶、自由基和細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活胰腺外的中性粒細(xì)胞多型體和巨噬細(xì)胞，釋放更多的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征和器官損傷［2］。因此，探索SAP發(fā)生后，保護(hù)胰腺免受過激的炎癥反應(yīng)引起的全身?yè)p傷，是本文致力研究的一個(gè)方向。本研究旨在探討柚皮苷在SAP中的免疫調(diào)節(jié)作用，這可能對(duì)治療SAP具有較高的價(jià)值。本研究在SAP大鼠模型中，觀察到大鼠胰腺形態(tài)和功能的致命損傷，表現(xiàn)為胰腺組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，邊界模糊并伴有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域有出血，血清淀粉酶顯著上升；柚皮苷給藥以后，發(fā)現(xiàn)柚皮苷各組以劑量依賴的方式逆轉(zhuǎn)改變。表明柚皮苷可減輕機(jī)體免疫損傷引起的胰腺功能障礙。

已有研究證實(shí)，柚皮苷具有抗炎作用，一定劑量下的柚皮苷可顯著減輕脂多糖誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥反應(yīng)［15］。TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子與胰腺的受損程度密切相關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在SAP大鼠模型中，血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著增加，炎癥因子的過表達(dá)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生自身免疫性損傷。柚皮苷給藥后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均下調(diào)，且柚皮苷劑量越高，血清炎癥因子水平越低。表明SAP可引起機(jī)體免疫損傷，柚皮苷可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫力，降低過強(qiáng)炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。

目前已有研究證實(shí)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白具有免疫調(diào)節(jié)作用，Notch1、DSL和CSL蛋白是關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)量的改變與機(jī)體T、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育密切相關(guān)，同時(shí)也可以影響相關(guān)炎癥因子的分泌［17］。Notch信號(hào)通路與人類某些重要疾?。ɡ绺伟┑陌l(fā)病進(jìn)程具有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性［18］。鑒于它的重要性，目前靶向Notch信號(hào)的藥物研發(fā)成為眾多疾病治療的研究熱點(diǎn)。姚弘毅等［19］研究顯示，羥基紅花黃色素A能抑制Notch信號(hào)通路，從而降低骨性關(guān)節(jié)炎大鼠血清及滑膜中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，減輕軟骨損傷。本研究結(jié)果顯示，SAP大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白呈高表達(dá)，進(jìn)行柚皮苷給藥以后，柚皮苷呈劑量依賴性地抑制SAP大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白的表達(dá)，這與降低免疫應(yīng)激反應(yīng)，減輕大鼠免疫損傷密切相關(guān)。

綜上所述，柚皮苷對(duì)SAP大鼠具有一定的治療作用，其機(jī)制可能是柚皮苷通過靶向Notch信號(hào)通路，抑制SAP大鼠胰腺組織Notch1、DSL和CSL蛋白的表達(dá)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕大鼠胰腺損傷，Notch可能成為臨床上SAP治療的潛在靶點(diǎn)。