采用網(wǎng)絡藥理學方法預測蘇格木勒-10治療腎病綜合征的機制

良 良，鮑布日額，陳香梅，王秀蘭

（1.內蒙古民族大學 附屬醫(yī)院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學 蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028043）

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是由復雜病因致腎小球基底膜的通透性增加的常見腎小球疾病之一，主要表現(xiàn)為大量蛋白尿、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫［1］。NS發(fā)病機制復雜，主要與足細胞損傷與凋亡、脂質代謝紊亂和氧化應激等有關［2］。目前NS的治療以免疫抑制劑為主，作用尚可但其毒副極其嚴重［3］。尋求安全、有效、毒副作用小的藥物迫在眉睫。蒙醫(yī)具有辨證施治，蒙藥復方涉及多組分、多靶向治療作用等特點。

蘇格木勒-10是一味歷史悠久的蒙醫(yī)驗方，由味苦、辛、性溫、輕、躁、膩、銳，有祛腎寒、抑赫依、調胃火、消食、開胃、止吐之功效的蘇格木勒為君藥，具治療尿閉、祛腎寒功效，是蒙醫(yī)廣泛用于治療泌尿系感染、腎寒、腎炎、腎結石的常用藥物［4-10］。雖然蘇格木勒-10臨床療效顯著，但目前其分子機制研究少見。筆者以蘇格木勒-10的化合物為基礎，腎病綜合征疾病靶點為研究對象，采用中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺建立化合物-靶點-疾病靶點-通路網(wǎng)絡，初步探討蘇格木勒-10復雜成分、多作用靶點、多通路的作用機制，為深入研究蘇格木勒-10治療NS的作用機制提供方向。

1 材料與方法

1.1材料 中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺，見表1。

表1 中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺Tab.1 Integrated Pharmacology Research Platform of Traditional Chinese Medicine

1.2 蘇格木勒-10化合物數(shù)據(jù)庫建立 從TCMSP、BATMAN數(shù)據(jù)庫中獲取蘇格木勒-10的化學成分，輸入關鍵詞“益智、干姜、蓽茇、冬葵果、蓮子、榧子、苦石蓮、麝香、方海、白硇砂”及文獻檢索其化合物得到活性成分信息，再經(jīng)過口服生物利用度（OB）和類藥性（DL），篩選出同時滿足OB≥20%和DL≥0.1的化合物及文獻報道的有活性的成分［11-14］。

1.3 成分靶點篩選 將“1.2”項下化合物導入Pubchem數(shù)據(jù)庫，導出分子結構并以Canonical SMILES格式保存文件，導入Swiss、Sea數(shù)據(jù)庫，選定物種為“Homo sapiens”，篩選條件probablity＞0.1，得到成分的對應靶點，保存數(shù)據(jù)，篩選、整合、去重后得到化合物潛在作用靶點。

1.4 疾病靶點篩選 使用DisGeNET、OMIM、Gene Cards數(shù)據(jù)庫中輸入關鍵詞“Nephrotic syndrome”“Edema”“Proteinuria”進行檢索，搜索已報道與NS相關的基因，去除重復基因獲得作用靶點，將其導入Excel表格中，整合、去重后得到疾病的潛在作用靶點。

1.5 潛在作用靶點篩選及網(wǎng)絡模型構建及分析 利用Venny2.1.0軟件獲取蘇格木勒-10化合物和腎病綜合征交集靶點（即兩者共同靶標），即為潛在靶點。繼而將潛在靶點及其對應化合物分別導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建“成分-靶點”網(wǎng)絡，使用Network Analyzer功能對網(wǎng)絡進行分析，根據(jù)節(jié)點Degree、Betweenness、Closeness篩選出蘇格木勒-10防治NS的主要活性成分。

1.6 PPI網(wǎng)絡構建及分析 將“1.5”項篩選到的共同靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，選擇“homo sapiens”物種，設定最低相互作用閥值為0.15，其余參數(shù)保持默認設置，獲得蛋白相互作用信息，保留文件中的節(jié)點信息（node1、node2）并將其導入Cytoscape 3.6.0軟件，構建PPI網(wǎng)絡并進行拓撲分析，篩選出關鍵靶點。

1.7 富集分析 將篩選得到的關鍵靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫中，進行GO功能富集分析（包括生物過程、細胞組分、分子功能）和KEGG信號通路分析。

2 結果

2.1 蘇格木勒-10方中成分及靶點的篩選 通過借助名稱TCMIP（V2.0）、BATMAN數(shù)據(jù)庫及文獻檢索篩選出178個化合物，其中益智化合物11個、蓽茇15個、白硇砂化合物1個、冬葵果化合物14個、榧子化合物11個、干姜化合物19個、苦石蓮化合物26個、蓮子化合物22個、螃蟹化合物19個、麝香化合物40個，去重后得126個化合物，將蘇格木勒-10復方化合物Canonical SMILES結構輸入Swiss、Sea數(shù)據(jù)庫中檢索得到化合物靶點，篩選物種為“Homo sapiens”，propbolity＞0.1的，去重后基因共有997個。

2.2 疾病靶點篩選 通過DisGeNET、OMIM、Gene Card數(shù)據(jù)庫篩選“Nephrotic syndrome”“Edema”“Proteinuria”得到疾病靶點180個，去重后162個，將疾病和成分的靶點輸入Venny 2.1.0，獲取共同靶點35個，見圖1。

圖1 蘇格木勒-10和NS交集靶點Fig.1 Intersection targets of Sugemule-10 and NS

2.3化學成分-作用靶點網(wǎng)絡構建及分析 將化合物和35個潛在靶點導入Cytoscape軟件，繪制網(wǎng)絡圖，見圖2，并對網(wǎng)絡進行拓撲分析。結果顯示，亮氨酸、亞麻酸、6-methyl-1-（2-thenylidene）furo［3，4-c］pyridine-3，4（1H，5H）-dione分別能與11、7、6個以上靶點相連接，油酸、Vitexin-2-O-rhamnoside、芥酸、己酸、2，7-二甲基辛基-7-烯-5-炔-4-基酯、氯甲基3-氯辛酸分別與5個靶點連接，胡椒堿、豌豆素等與4個靶點連接，胡椒龍胺、姜黃素、諾卡酮、氧葉酮B、氧葉酮A分別與3個靶點連接，可能在防治腎臟疾病過程中發(fā)揮重要作用，同時亮氨酸、亞麻酸、姜黃素、姜黃醇、諾卡酮、胡椒堿、豌豆素、胡椒龍胺、白楊素、鼠李素、6-姜酚、β-谷甾醇、氧葉酮B、氧葉酮A等25個成分又可共同作用于靶點NOS2，體現(xiàn)了蘇格木勒-10多成分、多靶點的綜合調節(jié)特點。

圖2 蘇格木勒-10活性成分治療NS潛在靶點Fig.2 Potential targets of Sugemule-10 active ingredients for treatment of NS

2.4 PPI網(wǎng)絡構建 在STRING數(shù)據(jù)庫中錄入35個潛在作用靶點，得到蛋白相互作用信息，使用Cytoscape軟件對上述數(shù)據(jù)進行可視化分析，構建PPI網(wǎng)絡，并對網(wǎng)絡進行篩選，根據(jù)連接度（Degree）、介度（Betweeness）、緊密度（Closeness）篩選出35個關鍵靶點，見表2，其中度值最高的為TNF與33蛋白結合，其次為MMP9、ICAM1、CXCL8、PTGS2、VEGFA、IL6、ACE、REN、CASP3、RHOA、TGFB1、NOS2、PPARA、NR3C1能與25個以上蛋白發(fā)生相互作用。PPI網(wǎng)絡圖見圖3、圖4，靶點度值越高，節(jié)點越大；度值越低，節(jié)點越小。

圖3 35個蛋白之間相互作用圖Fig.3 Interaction diagram between 35 proteins

圖4 靶點與靶點之間相互作用圖Fig.4 Interaction diagram between target and target

表2 關鍵靶點信息Tab.2 Information of key targes

續(xù)表2

2.5 靶點通路分析 將35個關鍵靶點通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析，得到1 519個條目（P＜0.1），包括1 075個生物學過程、230個細胞組分、214個分子功能（篩選degree前20的條目繪制柱狀圖），可以看出蘇格木勒-10復方治療腎病綜合征的主要靶點顯著富集在細胞代謝過程的正調控、細胞對化學刺激和外部刺激的反應、防御、對內源性刺激的反應、分子功能的調節(jié)等生物過程（BP）。從細胞組分（CC）的富集結果可見，主要參與的有細胞質、細胞器、細胞內膜等；從分子功能（MF）主要富集結果可以看出，蘇格木勒-10防治腎病綜合征主要表現(xiàn)為蛋白質結合、催化活性、受體結合、水解酶活性、酶結合、受體配體活性、信號轉導活動、分子轉導活性等。

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行通路（KEGG）分析，以P＜0.005為條件，共篩選出17條信號通路，應用Omicshare對17條通路富集分析，結果見表3、圖5。表3顯示了前幾條重要通路，圖5的氣泡圖是根據(jù)P值的大小進行排列的，P值越小表示該路徑與疾病的相關性越強，可以看到癌癥信號通路（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白聚糖通路（Proteoglycans in cancer）、類風濕關節(jié)炎信號通路（Rheumatoid arthritis）、恰加斯?。绹F蟲?。–hagas disease（American trypanosomiasis））、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、百日咳（Pertussis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD））、瘧疾（Malaria）、結核（Tuberculosis）、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（Renin-angiotensin system）、NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）、腎素分泌（Renin secretion）等通路參與腎病綜合征的病理改變。由此可知，蘇格木勒-10化合物相關靶點是同時作用于不同的路徑來防治腎病綜合征。

表3 KEGG通路富集重要路徑Tab.3 Important pathways in KEGG pathway enrichment

圖5 KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

3 討論

本研究通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以藥物口服生物利用度≥20%、類藥性≥0.1為篩選條件，篩選出符合條件的126個化合物，其中與關鍵靶點連接拓撲學分析中Degree值高的亮氨酸、亞麻酸、油酸通過口服補充可以對類風濕性關節(jié)炎、前列腺炎、特異性皮炎起到一定的治療和預防效果，也可促進乳腺癌、前列腺癌細胞的凋亡，降血脂、血壓［15-18］；姜黃素、胡椒堿具有治療炎癥、風濕、代謝紊亂等作用［19-21］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，其君藥蘇格木勒具有抗氧化應激及改善腎臟病理功能［22-25］、利尿和抗利尿作用［26］，生姜提取物（10-DHGD）具有抗炎及減輕腎臟纖維化作用［27］。蓮子［28］降低糖尿病鼠的血糖。通過cytoscape對潛在作用靶點得到的蛋白相互作用信息進行拓撲學分析，篩選出關鍵靶點35個，靶點間通過394條相互作用協(xié)同影響疾病的防治。

通過35個交集靶點的GO分析可知，BP、CC、MF等生物過程貫穿于藥物治療疾病的整個作用機制中，表明蘇格木勒-10可通過調控多個生物學過程來發(fā)揮防治腎病綜合征的作用。

KEGG富集結果表明，關鍵靶點主要富集于癌癥、類風濕關節(jié)炎、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌、TNF信號、NOD樣受體等信號通路，表明蘇格木勒-10可通過作用于不同的通路來防治腎病綜合征。其中，TNF信號通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、腎素分泌、NOD樣受體信號通路在腎小球疾病的防治過程中起重要作用。腎小球疾病盡管有非免疫因素的參與，但大多數(shù)被認為是免疫介導的炎癥性疾病，免疫反應常為腎小球疾病的始發(fā)機制。NOD2是一種胞質受體，根據(jù)報道發(fā)現(xiàn)，外源微生物如細菌胞壁肽聚糖等可通過NOD2途徑激活核因子-κB、MAPK和半胱氨酸天冬氨酸酶-1途徑啟動促炎因子如TNF-α、白細胞介素以及各種抗微生物因子，繼而激活機體的先天性免疫反應［29］，從而保護機體避免受過度炎癥的損傷。NS的水腫是與腎小球濾過率降低，腎小管重吸收增加，腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）、抗利尿激素分泌增加相關。RAS通過維持腎動脈血管壓力、調整血壓，平衡體液和鈉離子、鉀離子等電解質及細胞對大分子物質的攝入而影響免疫復合物沉著［30］，進而影響腎臟的生理功能，在腎臟病的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。根據(jù)相關研究發(fā)現(xiàn)［31］，TNF-α是與慢性腎臟病發(fā)病機制密切相關的細胞因子之一，通過改變內皮細胞黏附力刺激成纖維細胞增生，促進纖維化。TNF等炎癥因子同時也是糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展的主要因素。

綜上所述，本研究首次借助網(wǎng)絡藥理學方法，初步探討了蘇格木勒-10復方防治腎病綜合征的活性成分及可能作用機制，發(fā)現(xiàn)其化合物在炎癥防御方面療效顯著，且主要作用于炎癥通路、癌癥通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)，這些發(fā)現(xiàn)為蘇格木勒-10后續(xù)進一步研究提供了思路及理論依據(jù)。