蒙藥光明鹽-4對功能性消化不良大鼠的治療作用及對胃腸激素的影響

包特日格樂，付明海，拉喜那木吉拉，風(fēng) 蘭，李國瑞，木西葉樂，塔 娜，陳永勝

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

功能性消化不良（Functional dyspepsia，F(xiàn)D）是一種功能性胃腸病，指胃腸道中的一種復(fù)雜癥狀，表現(xiàn)為上腹脹滿不適、餐后飽脹等。誘因包括急性胃腸炎、吸煙、女性、非甾體抗炎藥和幽門螺桿菌感染及精神因素等［1］。近年來，隨著人們生活壓力的增加以及因為不良飲食習(xí)慣，F(xiàn)D的發(fā)生率在逐漸遞增，對人們正常生活帶來了危害。根據(jù)羅馬Ⅲ診斷準則［2］：（1）應(yīng)當(dāng)滿足下列一項或多個條件：餐后飽脹、上腹燒灼感；（2）尚無能夠說明上述表現(xiàn)的器質(zhì)性疾?。唬?）檢查前病癥已經(jīng)存在6個月或更長時間，且近3個月病情發(fā)作。隨著人們生活方式的改變，消化與代謝疾病變得越來越普遍。慢性病的治療是蒙醫(yī)藥臨床的獨特優(yōu)勢。蒙醫(yī)理論認為，消化不良是所有“內(nèi)病”的根本原因。由“赫依、協(xié)日、巴達干”紊亂引起，主因為巴達干赫依。蒙藥光明鹽-4湯散，由光明鹽、生姜、蓽茇、訶子四味藥構(gòu)成，有消食、溫胃、降毒的功能；蒙醫(yī)臨床上一般用于治療消化不良，藥物、食品中毒等病癥。蒙醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作《甘露四部》記載，光明鹽-4（Molor Dabos-4，MD-4）治療巴達干引起的消化不良癥狀［3］。光明鹽-4的功能組方是治療消化不良病癥的傳統(tǒng)良藥，臨床療效顯著，并且沿用至今。

碘乙酰胺（Iodoacetamide，IA）灌胃法是目前國際上認可的FD造模方式。碘乙酰胺也是蛋白組學(xué)中半胱氨酸和組氨酸的烷基化成分，IA會抑制蛋白酶活性的降低但不會使蛋白質(zhì)變性。由于它還存在著誘導(dǎo)細胞的缺氧、黏膜破壞、緊張和抑郁等功能，基本能夠模擬FD的病理生理機制［4］。國內(nèi)外多項以IA誘導(dǎo)FD模型的研究表明，IA可使胃腸運動功能顯著變化，可模擬FD發(fā)病的方式反映FD發(fā)展的真實情況［5-7］。筆者采用ID誘導(dǎo)法復(fù)制了功能性消化不良大鼠模型，并用光明鹽-4灌胃治療，觀察其療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD新生大鼠72只，7日齡，購于遼寧長生生物科技股份有限公司，產(chǎn)品批準編號：211002300066692。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（20±2）℃，相對濕度約為60%，12 h周期性光照，在實驗期間母鼠自由飲水、攝食。本實驗對動物的處理方式，符合我國科學(xué)技術(shù)部制定的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 實驗藥品

光明鹽-4湯散（光明鹽、姜、蓽茇、訶子）由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥房提供。枸櫞酸莫沙必利片（魯南貝特制藥有限公司，規(guī)格：5 mg，批號：H19990317）。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠GAS ELISA檢驗試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：202105）；大鼠MTL ELISA檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：202105）；大鼠Ghrelin ELISA檢測試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：202105）；H&E染液（南京建成生物工程研究所）；ThermoFisher酶標儀（型號：Varioskan LUX）。

1.4 造模與給藥

10日齡SD新生大鼠灌胃6 d，模型組每日在2%蔗糖溶液中加入0.2 mL 0.1%碘乙酰胺（IA），正常組為2%蔗糖溶液0.01 mL·g-1。兩組大鼠進入成年期（8周齡）后開始給藥，將光明鹽-4湯劑配成CMC-Na混懸液，按照成人（70 kg）每天用光明鹽-4的等效劑量，以大鼠體重換算后的數(shù)值6倍做為低劑量；中、高劑量分別為低劑量的5倍、10倍。最后，低、中、高劑量分別為0.3、1.5、3.0 g·（kg·d）-1［8］。陽性對照組用同樣的方法，配制莫沙必利混懸液，給藥量為30 mg·kg-1，日一次，持續(xù)21 d。

1.5 3 h進食量、胃排空率及小腸推進率

末次給藥后，禁食、不禁水24 h，分為單籠給予20 g飼料，3 h后測量剩余食量。3 h進食量=20-剩余食量。胃排空率由半固體營養(yǎng)糊灌胃測定。取10 g羧甲基纖維素鈉溶于200 mL蒸餾水中，再添加16 g奶粉、8 g糖、8 g淀粉、4 mL碳墨與蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，混合后制?00 mL的黑色半固體營養(yǎng)糊，冰箱中冷藏，在試驗前2 h內(nèi)取出，并恢復(fù)至常溫。以10 mL·kg-1灌胃30 min后，麻醉并開腹，再結(jié)扎胃賁門與幽門，取胃，用濾紙吸干后稱全重，再沿胃大彎剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物后再拭去，即為胃凈重。胃排空率=1-（胃全重-胃凈重）/胃全重×100%。同時迅速分割出小腸攤在白紙（軟尺）上，測量幽門與盲腸距離作為小腸全長，測量幽門與黑色半固體糊前沿的距離。以幽門至黑色半固體糊前沿的距離與小腸全場的比值為小腸推進率。小腸推進率=（小腸全長-推進長度）/小腸全長×100%。

1.6 肝臟與脾臟指數(shù)

大鼠禁食后稱體重；處死大鼠，剖腹分離肝臟和脾臟，用濾紙吸干后稱重并計算肝臟與脾臟指數(shù)。臟器指數(shù)=（臟器重量/體重）×100%。

1.7 胃組織病理學(xué)觀察

大鼠處死后，肉眼觀察所有大鼠的胃黏膜情況：色澤、有無充血、潰瘍等。正常組與模型組大鼠處死后取胃組織，用生理鹽水清洗濾紙吸干后浸入10%多聚甲醛溶液中固定。將組織取出連續(xù)脫水，石蠟包埋后切割成5～7μm的石蠟切片。采用蘇木精-伊紅方法對組織切片進行染色，并在顯微鏡下觀察各組大鼠胃組織形態(tài)。

1.8 血清GAS、MTL、Ghrelin含量測定

收集腹主動脈血液，將全血樣本置于室溫下30 min后離心（3 000 r·min-1，15 min）以分離血清，并在-80℃下儲存?zhèn)溆?。按Elisa試劑盒說明書，稀釋標準品，加樣、溫育、洗滌、加酶、顯色、終止后450 nm波長下測定各孔的吸光度。繪制標準曲線，計算相應(yīng)濃度后乘以稀釋倍數(shù)得到血清GAS、MTL、Ghrelin實際濃度。

1.9 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用Graghpad Prism 9.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 碘乙酰胺對FD大鼠胃組織病理學(xué)的影響

據(jù)肉眼觀察，各組大鼠胃黏膜無出血、潰瘍等器質(zhì)性損傷；觀察對照組和模型組大鼠胃部的HE染色標本見圖1，與正常組相比，模型組胃組織未發(fā)現(xiàn)潰瘍及炎癥等器質(zhì)性改變，符合FD的無器質(zhì)性損傷的特點。

圖1 碘乙酰胺對FD大鼠胃組織病理的影響Fig.1 Effects of iodoacetamide on gastric histopathology in FD rats

2.2 光明鹽-4對FD大鼠3 h進食量、胃排空率及小腸推進率的影響

數(shù)據(jù)顯示，與正常組相比，模型組攝食量明顯下降（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量光明鹽-4可顯著增加進食量（P＜0.001），陽性對照組無顯著差異，見圖2（a）。與正常組比較，模型組胃排空率降低（P＜0.1）；與模型組相比，低、中、高劑量光明鹽-4均可增加胃排空率（P＜0.01），陽性對照組顯著上調(diào)大鼠胃排空率（P＜0.05），見圖2（b）。此外，與正常組比較，模型組的大鼠小腸推進率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組小腸推進率顯著上升（P＜0.01），陽性對照組顯著上升（P＜0.001），見圖2（c）。

圖2 光明鹽-4對FD大鼠3 h進食量、胃排空率、小腸推進率的影響Fig.2 Effects of MD-4 on 3 h food intake，gastric emptying rate and intestinal propulsive rate in FD rats

2.3 光明鹽-4對FD大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的影響

與正常組相比，模型組的脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），肝臟指數(shù)無顯著差異。與模型組相比，光明鹽-4低（P＜0.01）、中、高（P＜0.05）劑量組、陽性對照組（P＜0.01）脾臟指數(shù)顯著降低，見圖3（a）。光明鹽-4中、高劑量組大鼠的肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），陽性對照組無明顯差異，見圖3（b）。據(jù)肉眼觀察，各組大鼠的肝臟與脾臟形態(tài)沒有明顯差異。

圖3 光明鹽-4對FD大鼠脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)的影響Fig.3 Effects of MD-4 on spleen index and liver index in FD rats

2.4 光明鹽-4對FD大鼠血清胃腸激素MTL、GAS及Ghrelin水平的影響

胃腸道動力障礙與胃腸道促進激素和抑制激素之間均有直接聯(lián)系。本研究結(jié)果見圖4。與正常組相比，模型組大鼠血清GAS濃度明顯下降（P＜0.01），見圖4（a）；Ghrelin濃度無明顯差異，見圖4（b）；MTL濃度明顯提高（P＜0.05），見圖4（c）；采用光明鹽-4干預(yù)后，低劑量組GAS濃度明顯升高（P＜0.05）；各劑量組Ghrelin濃度明顯提高（P＜0.05）；各給藥組大鼠MTL無顯著差異；陽性對照組與模型組相比，均無顯著差異。

圖4 光明鹽-4對FD大鼠Gastrin、Ghrelin、Motilin水平的影響Fig.4 Effects of MD-4 on Gastrin，Ghrelin and Motilin levels in FD rats

3 討論與結(jié)論

蒙醫(yī)學(xué)理論中，F(xiàn)D屬于不良消化癥范疇，是指人們長期食用生冷的食物或者飲食不加以控制、進餐不規(guī)律、過度勞累等原因引起的三根紊亂、胃火衰退所致。食物入胃后，經(jīng)磨碎、腐熟后溶解為精華和糟粕，從而產(chǎn)生七素、三穢，此過程容易受各種因素的影響而造成消化吸收功能所必需的希拉過剩、巴達干增盛而導(dǎo)致三根失衡［9］，最終形成消化不良，臨床主要表現(xiàn)為胃部飽脹、體虛神萎、嘔吐白沫、遇寒加重等。蒙醫(yī)臨床上，診斷FD標準為上腹部不適、腹脹、惡心、食欲減退等癥狀并排除器質(zhì)性消化系統(tǒng)疾病。蒙藥治療FD依據(jù)消食健胃、調(diào)胃火、祛“巴達干”的原則進行施治。本研究結(jié)果中碘乙酰胺誘導(dǎo)的FD模型大鼠進食量、胃排空率、小腸推進率均顯著降低，而光明鹽-4干預(yù)后明顯促進了FD大鼠的進食量、胃排空率、小腸推進率，表明光明鹽-4可改善碘乙酰胺引起的FD大鼠食欲及胃腸運動功能，與李娜等［10-11］的研究結(jié)果一致，光明鹽-4湯對FD患者的治療有效性及安全性較好，值得進一步推廣研究。

以碘乙酰胺大鼠模型作為功能性消化不良研究對象的多項［5-7］研究表明，碘乙酰胺大鼠模型主觀因素和不確定因素較少，模型成功率高，且較全面的模擬功能性消化不良的癥狀，筆者采用此方法制備FD模型。實驗過程中觀察到，模型組大鼠自幼齡時造模起，逐漸開始出現(xiàn)精神萎靡、易怒暴躁、毛色枯槁、光澤減少等特征。食欲下降為FD疾病的最常見原因［11］，與正常組大鼠比較，模型組大鼠的攝食總量明顯下降；同時脾臟指數(shù)、胃腸排空量和小腸推進量明顯下降；說明FD大鼠模型的復(fù)制順利。成年后，通過3周光明鹽-4治療，上述現(xiàn)象明顯減輕，大鼠脾臟指數(shù)、攝食率均明顯提高，胃排空率、小腸推進率均明顯提高。研究證實，光明鹽-4對防治FD療效顯著，光明鹽-4能緩解因FD所致的胃腸動力不足及腸胃蠕動減弱等。另外，光明鹽-4治療FD可能與調(diào)節(jié)脾臟功能有關(guān)，需要進一步闡明其作用機理。

胃腸道動力受各種胃腸道激素調(diào)控，胃腸道病變的產(chǎn)生、發(fā)展與胃腸激素分泌水平密切相關(guān)。胃腸道激素又分為胃腸動力促進激素和胃腸道動力抑制激素，前者還包括了Motilin（MTL）、Gastrin（GAS）等。GAS一般由胃竇和十二指腸中的G細胞分泌，有提高胃酸、胃蛋白酶的功能，使胃竇和幽門括約肌緊縮、推動胃排空而增進消化吸收，并與神經(jīng)肽與增食因子產(chǎn)生協(xié)同作用，增進進食量［12-14］。GAS也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)、迷走神經(jīng)和腸神經(jīng)引起胃腸動力興奮功能的激素，是FD研究的重要指標之一［15］。本研究結(jié)果中，與正常組相比，模型組Gastrin顯著降低；與模型組相比，光明鹽-4低劑量組Gastrin含量明顯升高，但中、高劑量組無顯著差異，提示光明鹽-4改善FD大鼠的胃腸功能與促進Gastrin分泌而加速胃竇收縮、松弛幽門平滑肌有關(guān)，臨床等效劑量對Gastrin分泌最佳。MTL可調(diào)控胃腸道的移行復(fù)合運動，引起小腸強烈的時相性收縮，增加小腸的蠕動，從而清除腸道食糜殘渣及一些不能被正常消化的食物。本研究中，與正常組相比，光明鹽-4低劑量組MTL含量明顯升高；與模型組相比，各給藥組大鼠MTL無顯著差異，提示光明鹽-4對IA誘導(dǎo)FD大鼠的MTL無調(diào)節(jié)作用，其胃腸功能的改善與MTL無關(guān)。胃饑餓素（Ghrelin）是一種多功能胃腸激素。Ghrelin在整個胃腸道中均有表達，在胃底的含量最高，可以促進胃腸動力，調(diào)節(jié)小腸平滑肌收縮，增加進食量［16-17］。研究表明，電針可以提高體內(nèi)Ghrelin水平，促進胃排空而改善FD癥狀［18］。從本研究結(jié)果可見，與模型組相比，光明鹽低、中、高劑量組Ghrelin水平均顯著增加，與模型組無顯著差異，表明IA誘導(dǎo)大鼠FD模型對Ghrelin水平無影響。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用碘乙酰胺復(fù)制的FD大鼠模型有明顯的胃腸功能減退癥狀，血清中GAS水平以及胃排空率和小腸推進率明顯降低。經(jīng)光明鹽-4干預(yù)后，進食量明顯增加，胃排空率和小腸推進率均明顯加快。光明鹽-4能夠改善FD胃腸功能與其上調(diào)血清中GAS表達水平相關(guān)。