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    綠萼梅抗β淀粉樣蛋白致阿爾茨海默病細胞模型活性部位的篩選及其化學(xué)成分分析

    2022-06-09 14:07:24甘宜杰歐金梅喬金為金傳山
    關(guān)鍵詞:綠萼神經(jīng)細胞批號

    甘宜杰,張 偉,2,3,歐金梅,2,喬金為,4,金傳山

    (1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038;3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,安徽 合肥 230061)

    阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病機制極其復(fù)雜,在疾病后期還會導(dǎo)致神經(jīng)細胞功能喪失和神經(jīng)細胞死亡,臨床表現(xiàn)為記憶損傷和行為失調(diào)[1]。目前臨床上用于治療AD的藥物只能在一定程度上改善或緩解AD患者的癥狀,但是未能緩解或阻止疾病的進程[2]。依據(jù)淀粉樣蛋白級聯(lián)假說,β淀粉樣蛋白(amyloid β,Aβ)是引起AD的主要原因,其在腦內(nèi)異常分泌和沉積毒害周圍的突觸和神經(jīng)細胞,最終造成神經(jīng)細胞損傷[3-4]。因此,抑制Aβ沉積是預(yù)防和治療AD的關(guān)鍵。

    綠萼梅是薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾,屬于理氣藥,性平,味微酸,歸肝、胃、肺經(jīng),具有疏肝和中、化痰散結(jié)之功效[5]?!侗静菥V目》中記載梅花具有“助雅致,清神思”的功效,《本草原始》記載綠萼梅能夠安神定魂。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn),綠萼梅對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護作用[6],提示綠萼梅對神經(jīng)退行性疾病具有預(yù)防和治療作用。人神經(jīng)母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)分化程度較低,繁殖快,其細胞形態(tài)、生理及生化功能與正常神經(jīng)細胞類似,軸突明顯,是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常用模型[7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),綠萼梅乙酸乙酯萃取部位分離得到的化合物對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞有保護作用[8]。本研究對綠萼梅水提物經(jīng)大孔樹脂不同洗脫部位的抗Aβ活性進行篩選,同時結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(ultraperformance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS)定性分析抗Aβ活性部位的化學(xué)成分,為綠萼梅的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

    1 儀器與材料

    1.1 試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y細胞):美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC);青霉素-鏈霉素(批號 71766505):聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT;批號 0123A18):北京雷根生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶(批號 112818181228):上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(fetal bovine saline,FBS):Hyclone公司;Aβ1-42(批號 J10M9E60422):上海源葉生物有限公司。

    乙醇(化學(xué)純):上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司;AB-8大孔樹脂(批號 C12115168):上海麥克林生化科技有限公司;綠原酸(批號 DST200520-021,純度≥98%)、蘆丁(批號 DSTDL001701,純度≥98%)、金絲桃苷(批號 DST200628-023,純度≥98%)、異槲皮苷(批號 DSTDY000601,純度≥98%):成都樂美天醫(yī)藥科技有限公司;乙腈(質(zhì)譜級)、甲酸(質(zhì)譜級)、甲醇(質(zhì)譜級):美國Fisher公司。

    1.2 主要儀器 Xevo G2 QTOF質(zhì)譜儀、ACQUITY Ⅰ型超高效液相系統(tǒng):美國Waters公司; 3K15型低溫高速離心機:Sigma公司;TCL-16G-A型高速冷凍離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠;Forma 3111型水套式CO2培養(yǎng)箱:賽默飛世爾科技有限公司;SW-CJ-2FD型超凈化工作臺:蘇州凈化設(shè)備有限公司;TriStar LB941微孔板式多功能酶標儀:德國Berthold公司;AB-135S型十萬分之一分析天平:德國梅特勒上海有限公司;Milli-Q型超純水儀:Millipore公司。

    1.3 藥材 藥材于2019年2月購買于安徽省歙縣,經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源中心劉守金教授鑒定為薔薇科植物綠梅花ArmeniacamumeSieb. f.viridicalyx(MakinoT). Y. Chen的干燥花蕾。

    2 方法

    2.1 綠萼梅抗Aβ活性部位的篩選

    2.1.1 樣品的提取與制備 取50 g綠萼梅藥材,按照12、8、6倍量加入蒸餾水加熱回流提取3次,每次1 h。合并濾液并濃縮至0.5 g/mL,流經(jīng)AB-8大孔樹脂,依次使用水、30%乙醇、60%乙醇、90%乙醇依次洗脫,減壓回收溶劑,分別得到水部位(ST-0)、30%乙醇洗脫部位(ST-30)、60%乙醇洗脫部位(ST-60)、90%乙醇洗脫部位(ST-90)。細胞實驗前,將各洗脫部位干浸膏用超純水超聲溶液,再用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,0.22 μm濾膜過濾除菌,4 ℃條件下保存。

    2.1.2 試劑的配制 Aβ1-42溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中,配制成1 mmol/L的母液,4 ℃保存。各綠萼梅洗脫部位分別溶于0.01 mol/L PBS緩沖液中,配制成1 mg/mL的母液,0.22 μm濾膜過濾除菌,4 ℃條件下保存。

    2.1.3 細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞采用含有10% FBS、青霉素(終濃度為100 μg/mL)、鏈霉素(終濃度為100 μg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基,置于5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng),隔天換液。選取對數(shù)生長期細胞,以每孔5×103接種于96孔培養(yǎng)板中。將細胞分成空白對照組(使用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng))、模型組(含5 μmol/L Aβ1-42的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng))、綠萼梅各濃度不同洗脫部位組(含5 μmol/L Aβ1-42和1、10、100 μg/mL綠萼梅洗脫部位的無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)),繼續(xù)孵育48 h。

    2.1.4 MTT測定細胞存活率 孵育結(jié)束前4 h,每孔加入20 μL MTT溶液(PBS稀釋配置5 mg/mL)。孵育結(jié)束后,棄去各孔上清液,每孔加入150 μL DMSO,細胞振蕩儀上振蕩10 min,待結(jié)晶物充分溶解后使用酶標儀在570 nm測定各孔吸光度值OD570。

    2.2 UPLC-Q-TOF/MS鑒定活性部位成分

    2.2.1 供試品溶液的制備 分別取ST-60及ST-90適量,精密稱定。置于5 mL容量瓶中,加入50%的甲醇定容至刻度,超聲溶解,制成每毫升含1 mg的樣品溶液,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,續(xù)濾液作為供試品溶液。

    2.2.2 色譜條件 色譜柱為Thermo Syncronis C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速:0.2 mL/min;柱溫:30 ℃;流動相:乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。洗脫梯度:0~6 min,6%→9% A;6~12 min,9%→13% A;12~16 min,13%→13% A;16~26 min,13%→30% A;26~36 min,30%→40% A;36~38 min,40%→6% A;38~43 min,6% A;進樣量2 μL。

    2.2.3 質(zhì)譜條件 ESI離子源,正負離子模式,樣品錐電壓為40 V,源溫120 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,脫溶劑氣體積流量為800 L/h。采用MSE采集方式,采集時間30.0 min,質(zhì)荷比(m/z)100~1 200,掃描間隔0.1 s。碰撞能量:碰撞低能量6 V,碰撞高能量為10~35 V。碰撞氣為高純He,霧化氣為高純N2。Lockmass采用亮氨酸-腦啡肽,m/z556.276 6(正離子模式)、554.2615(負離子模式)。數(shù)據(jù)采集由MassLynx V 4.1軟件控制。采用Waters UNIFI軟件分析其中各化學(xué)成分的保留時間及其質(zhì)譜信息,并結(jié)合其分子離子峰與對照品、文獻報道的數(shù)據(jù)進行對比,再對其中的化學(xué)成分進行辨識。

    3 結(jié)果

    3.1 活性部位篩選實驗 綠萼梅抗Aβ毒性作用部位篩選實驗結(jié)果見圖1,與空白對照組比較,模型組細胞存活率顯著下降(P<0.05),說明Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞模型細胞存活率顯著降低。與模型組比較,綠萼梅各濃度不同洗脫部位組細胞存活率均顯著上升(P<0.05),且高濃度不同洗脫部位組細胞存活率大于中、低濃度不同洗脫部位組,說明綠萼梅不同洗脫部位的藥效具有濃度依賴性;ST-60和ST-90提高細胞存活率的效果強于ST-0與ST-30。因此選擇ST-60和ST-90進行化學(xué)成分分析。

    注:與空白對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

    3.2 綠萼梅活性部位辨識 在中國知網(wǎng)、PubChem等數(shù)據(jù)庫中查詢并匯總綠萼梅(含梅花)的化學(xué)成分,建立包含化合物名稱、分子式、相對分子質(zhì)量等信息在內(nèi)的綠萼梅成分的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫。根據(jù)綠萼梅抗Aβ活性作用部位實驗結(jié)果選取ST-60和ST-90進行定性分析。其中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷和異槲皮苷通過與標準品比對保留時間及二級質(zhì)譜信息進行結(jié)構(gòu)鑒定;其他化合物通過與UNIFI軟件和數(shù)據(jù)庫的自動匹配,結(jié)合前期研究基礎(chǔ)及文獻報道的特征質(zhì)譜信息進行結(jié)構(gòu)鑒定。從ST-60、ST-90中共鑒定出24個化合物,其中黃酮類16個,苯丙素類4個,其他類化合物4個;其中14個共有化合物,包括黃酮類10個,苯丙素類2個,其他類化合物2個。ST-60和ST-90正負模式總離子色譜圖(total ion chromatogram,TIC)見圖2,成分鑒定結(jié)果見表1。

    表1 ST-60和ST-90的化學(xué)成分解析結(jié)果

    注:A為ST-60正離子模式下TIC,B為ST-60負離子模式下TIC,C為ST-90正離子模式下TIC,D為ST-90負離子模式下TIC

    4 討論

    Aβ是由膜蛋白淀粉樣蛋白前體蛋白經(jīng)過β分泌酶和γ分泌酶依次水解產(chǎn)生,具有神經(jīng)毒性[14],能使自由基的產(chǎn)生增多[15],對神經(jīng)細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用,引起炎癥反應(yīng),是誘發(fā)AD的重要病因之一[16],因此降低Aβ對神經(jīng)細胞的損傷是治療AD的重要途徑。SH-SY5Y細胞常用來制備研究神經(jīng)細胞凋亡的擬神經(jīng)細胞模型,廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細胞退行性疾病的發(fā)病機制和治療方法的研究[17]。本實驗結(jié)果顯示,ST-60和ST-90對Aβ蛋白誘導(dǎo)的SH-SY5Y細胞模型活性強于其他洗脫部位,且藥效呈現(xiàn)濃度依賴性,說明綠萼梅具有抗Aβ活性作用。經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS辨識ST-60和ST-90的化學(xué)成分,共鑒定出24個化合物,其中黃酮類16個,苯丙素類4個,其他類化合物4個。從兩個洗脫活性部位中鑒定出14個共有成分,分別為蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷、水仙苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素和柚皮素等10個黃酮類化合物,綠原酸和反式羥基肉桂酸等2個苯丙素類化合物,以及腺苷和十六碳二烯酸等2個其他類化合物。結(jié)果表明,綠萼梅抗Aβ活性作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能是黃酮類化合物。

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