血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多向分化及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

李 琳，蔡宇藝，何江峰，扈梓悅，葛劍平

(同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓病教研室，上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，上海 200072)

牙髓再生是治療牙髓感染或損傷的新方法，通過趨化內(nèi)源性細(xì)胞歸巢來替代外源性細(xì)胞移植，可以避免體外細(xì)胞培養(yǎng)和體內(nèi)細(xì)胞移植等復(fù)雜的程序，是牙髓再生研究的熱點(diǎn)之一。

血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)是一種多種細(xì)胞可以產(chǎn)生的多肽生長(zhǎng)因子，研究證明PDGF能促進(jìn)小鼠牙髓樣組織的異位再生[1],具有促進(jìn)細(xì)胞增殖以及募集周圍干細(xì)胞，促進(jìn)血管生成和成骨的潛力,是趨化作用最強(qiáng)的骨生長(zhǎng)因子[2-3]，在促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞介導(dǎo)的牙本質(zhì)-牙髓組織再生方面具有強(qiáng)大的功能[4]。因此PDGF-BB可能在牙髓再生中趨化間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和促進(jìn)細(xì)胞增殖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作為一種多向分化的干細(xì)胞，已被證實(shí)可感受外界信號(hào)刺激，趨化至受損部位，進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞分化而發(fā)揮組織修復(fù)再生作用。自噬是是真核細(xì)胞面對(duì)應(yīng)激時(shí)自我修復(fù)過程，在進(jìn)化過程中高度保守，通過基于溶酶體的胞內(nèi)降解發(fā)揮維持細(xì)胞和生物體穩(wěn)態(tài)平衡的作用[5]。自噬水平以自噬小體的形成為特征，而自噬蛋白ATG5(autophagy related gene-5，ATG5)和LC3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)直接參與調(diào)控自噬小體從形成到降解的整個(gè)過程。其中ATG5是自噬核心蛋白，參與自噬前體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成；LC3是在高等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第一種自噬體膜蛋白，為監(jiān)測(cè)自噬活動(dòng)的標(biāo)志性分子[6]。過往研究表明，自噬在牙髓炎、根尖周感染、牙組織的發(fā)育、修復(fù)中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7]。在犬牙異位牙髓血運(yùn)重建過程中，自噬在基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)介導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞遷移和牙髓再生中參與[8]。

本研究基于細(xì)胞歸巢原理，通過PDGF-BB聯(lián)合Collagen Type Ⅰ支架進(jìn)行異位牙髓再生，探討PDGF-BB對(duì)牙髓再生過程中的自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用大鼠購自斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(中國(guó))。PDGF-BB購自美國(guó)R&D Systems公司；KIT-9710免疫組化試劑盒、AEC-0037免疫組化顯色劑購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；proteintech ATG5 Antibody、proteintech LC3 Antibody購自美國(guó)Proteintech公司；標(biāo)記山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物技術(shù)公司；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司。組織處理儀STP120購自Thermofisher，石蠟包埋機(jī)(LEICAEG1150H)、石蠟切片機(jī)(LEICARM2235)、烤片機(jī)(LEICAHI1120)購自德國(guó)leica公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購自美國(guó)Thermo公司。

1.2 PDGF-BB對(duì)BMSCs增殖、遷移、多向誘導(dǎo)分化的影響

1.2.1 大鼠BMSCs分離與培養(yǎng) 取3周齡雄性大鼠3只，10%水合氯醛麻醉致死，75%乙醇內(nèi)浸泡消毒10 min；使用眼科剪、眼科鑷小心分離大鼠皮膚，從髂骨和跟腱部位將長(zhǎng)骨分離，夾取長(zhǎng)腿骨到超凈臺(tái)內(nèi)含1%雙抗的PBS中，分離骨組織周圍肌肉。分別剪斷股骨和脛骨兩端顯露骨髓腔，1 mL注射器吸取培養(yǎng)液沖骨髓腔，反復(fù)數(shù)次直至骨發(fā)白。細(xì)胞懸液反復(fù)吹吸將骨髓沖散，轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，1 000 r/min，離心半徑15 cm，離心6 min，棄上清液后重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×107個(gè)/mL的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。4天后吸走原培養(yǎng)液，預(yù)熱PBS沖洗1遍更換新鮮培養(yǎng)液，之后每隔3天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%以上融合度后進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2.2 大鼠BMSCs流式鑒定 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度后用0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞，PBS洗滌兩次，1 000 r/min離心5 min。用40 μm過濾器過渡，獲單細(xì)胞懸液。PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×106個(gè)/mL。參說明書，分別將CD29、CD45、CD3、CD90和CD11b加入20 μL的抗體稀釋液中(稀釋濃度1∶500)，4 ℃孵育1 h。100 μL細(xì)胞懸液加至對(duì)應(yīng)流式標(biāo)記管中，加入直接標(biāo)記的抗體。室溫避光孵育1 h后，于每管加入適量PBS，1 000 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min，棄上清液。用PBS液100 μL重懸細(xì)胞，流式上機(jī)檢測(cè)(1 h內(nèi))。

1.2.3 CCK-8法 用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基分別配制含不同濃度PDGF-BB的培養(yǎng)液，濃度設(shè)定為0、10、50、100 ng/mL，每濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加生長(zhǎng)因子。取P3代細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種至96孔板，邊緣孔用無菌PBS充填。37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h，細(xì)胞單層鋪滿孔底后棄培養(yǎng)液，分別加入不同濃度PDGF-BB的培養(yǎng)液200 μL/孔，每3天更換培養(yǎng)液。分別于接種后連續(xù)8天同一固定時(shí)間檢測(cè)，每孔加入10 μLCCK-8溶液，未接種BMSCs的孔加入等量培養(yǎng)液和CCK-8溶液作空白對(duì)照。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，450 nm酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(A450)，記錄，取平均值。以時(shí)間為橫軸，吸光度值為縱軸，繪制增殖曲線。

1.2.4 Transwell法 取P3代BMSCs，胰酶消化，用不含血清DMEM高糖培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1.5×105個(gè)/孔。向Transwell小室的下層(24孔板)分別加入濃度為0、10、50、100 ng/mL的PDGF-BB培養(yǎng)基500 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞按照1.5×105個(gè)/孔密度接種于小室上層，將上層小室輕放入下室，直至上室細(xì)胞完全浸沒在下室培養(yǎng)液中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板排除氣泡，將培養(yǎng)小室置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h后，用無菌小鑷子取出培養(yǎng)小室，輕洗凈上層培養(yǎng)液，小棉簽輕擦上層，PBS輕洗2遍，放入甲醛固定液，固定20 min，PBS洗2遍。固定后的培養(yǎng)小室移入0.1%的結(jié)晶紫染色液中染色20 min，雙蒸水洗滌3次。倒置顯微鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) P3代的BMSCS以1×104個(gè)/mL接種細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)至80%融合，PDGF-BB培養(yǎng)液(濃度分別為0、10、50、100 ng/mL)常規(guī)條件誘導(dǎo)培養(yǎng)，每2天換液，誘導(dǎo)周期為14 d。采用TRIzol試劑提取總RNA，合成cDNA，用SYBR Green PCR Mix進(jìn)行PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參照，2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由生工(上海)貿(mào)易有限公司合成。qRT-PCR引物序列信息見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequences for RT-PCR

1.3 細(xì)胞免疫熒光染色

細(xì)胞爬片高壓消毒，P3代BMSCs以1×104個(gè)/孔的密度接種至6孔板，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，用含PDGF-BB的培養(yǎng)液(0、10、50、100 ng/mL)處理細(xì)胞，30 min后4%多聚甲醛固定，室溫靜置30 min后行細(xì)胞免疫熒光染色。吸取PBS，加入2%BSA封閉液，室溫封閉1 h，吸取封閉液，向每個(gè)細(xì)胞爬片上加入相應(yīng)一抗工作液(用1%FBS配制)4 ℃孵育過夜，用PBS洗去一抗，加入相應(yīng)AlexaFluor-488標(biāo)記的山羊抗兔IGg，37 ℃避光孵育1 h，鏡檢拍照。

1.4 牙髓組織異位再生的模型建立

經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)審核(審批號(hào)：〔2019〕-DW-030)，參考并改良文獻(xiàn)方法，將新鮮拔除的切牙或前磨牙浸泡于0.9%NaCl溶液中，小心刮除剩余牙周膜及牙周組織后，將離體牙浸泡在75%乙醇溶液中。離體牙置入5.25%NaOCl溶液浸泡1周[1]。進(jìn)行根管預(yù)備,通過舌冠進(jìn)入牙髓腔，去除牙髓組織，用手銼和旋轉(zhuǎn)器械清潔和塑造根管[9]，但沒有用牙膠封閉根管。使用5.25%次氯酸鈉溶液、17%EDTA溶液與3%過氧化氫溶液交替沖洗根管，盡量去除根管內(nèi)殘留的牙髓組織及牙本質(zhì)碎屑，高溫高壓滅菌。

以一組為例，根據(jù)每組所需的膠原凝膠的量進(jìn)行計(jì)算：每顆離體牙制備80 μL凝膠×4顆離體牙(每組)，共4組。將BD Collagen Type Ⅰ、10×磷酸鹽緩沖液(10×PBS)、雙蒸水、1NNaOH溶液置于冰上備用。在通風(fēng)櫥中按下列順序制備凝膠：依次向Eppendorf管中加入40 μL10×PBS、1.75 μLNaOH溶液、282.15 μL雙蒸水于Eppendorf管中，最后加入根據(jù)公式計(jì)算所需76.1 μL BD Collagen Type Ⅰ的體積。將凝膠混合物置于冰上備用(僅限2～3 h內(nèi)使用或直接使用，室溫下凝膠形成時(shí)間為30 min)。實(shí)驗(yàn)組PDGF-BB溶液體積用雙蒸水體積進(jìn)行替代計(jì)算。

基于免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用50 ng/mL濃度的PDGF-BB用于觀察其對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞的趨化、牙髓再生效果及自噬相關(guān)基因ATG5和LC3的表達(dá)。將PDGF-BB溶于濃度為1.8 mg/mL Collagen Type Ⅰ凝膠狀內(nèi)，注射入經(jīng)根管治療后的人離體牙中。每顆離體牙注射100～150 μL Collagen Type Ⅰ凝膠。無PDGF-BB組作為對(duì)照組。將注入含有或不含PDGF-BB凝膠的離體牙置于37 ℃的恒溫箱內(nèi)，30 min后即可形成凝膠。

以雄性7周齡SD大鼠為動(dòng)物模型，行大鼠腹部離體牙異位移植術(shù)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)表2分組方案，隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組。

表2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分組方案Tab.2 In vivo experimental grouping scheme

所有手術(shù)過程均由同一術(shù)者操作完成。隨機(jī)選擇植入材料進(jìn)行取7周齡雄性SD大鼠，經(jīng)腹腔靜脈注射5%水合氯醛(1.2 mL/100 g)麻醉，固定消毒，腹部制備直徑為1 cm的袋狀切口，鈍性分離，將含有細(xì)胞因子的膠原凝膠注入離體牙，上述離體牙植入大鼠腹部皮下袋，對(duì)位縫合；術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射頭孢唑林鈉抗炎，常規(guī)飼養(yǎng)2、4個(gè)月。

1.5 免疫組化染色方法

分別于移植術(shù)后2、4個(gè)月，局麻下將離體牙從大鼠腹部皮下小心分離，過量注射水合氯醛(500 mL/100 g)處死動(dòng)物，得到含再生牙髓樣組織的牙齒。臨床收集3名患者因無保留價(jià)值而拔除的第三磨牙，牙齒無齲損且無牙髓炎。牙齒離體后立即用0.9% NaCl溶液沖凈，用細(xì)金剛砂車針在冷卻水下沿牙齒長(zhǎng)軸磨出縱向溝槽，沿溝槽劈開各牙取出牙髓組織。將得到的再生牙髓組織及天然人牙髓組織置入4%多聚甲醛中固定48～72 h，經(jīng)10%EDTA溶液脫鈣6個(gè)月，標(biāo)本經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)方法脫蠟至水；將切片放置于3%H2O2室溫孵育10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；將切片加入檸檬酸緩沖液中，微波爐熱修復(fù)法行抗原修復(fù)，常溫冷卻，重復(fù)3次；5%BSA封閉液室溫孵育30 min；加入一抗，置于濕盒中4 ℃過夜；將切片取出，PBS浸洗5 min，3次；加入二抗，常溫孵育30 min，PBS浸洗5 min，3次；加入AEC顯色，蘇木精復(fù)染。中性樹膠封片，鏡檢拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs分離與鑒定

采用胰蛋白酶消化法傳代得到的P3細(xì)胞。P3代大鼠BMSCs形態(tài)呈均一的長(zhǎng)梭形，排列成旋渦狀或成纖維細(xì)胞樣形態(tài)(圖1A)。流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，CD29、CD90、CD3、CD11b、CD45在BMSCs細(xì)胞中低表達(dá)(圖1B～圖1D)。

圖1 大鼠BMSCs分離及鑒定Fig.1 Isolation and identification of rat BMSCs(×200,Bar=50 μm)A：P3代BMSCs形態(tài)(×200，Bar=50 μm)；B、C、D：BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD90、CD3、CDD45、CD11b流式細(xì)胞鑒定

2.2 PDGF-BB對(duì)BMSCs增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，正常條件下生長(zhǎng)的BMSCs(0 ng/mL組)在接種后的第1～2天，為細(xì)胞增殖的潛伏期，第3～7天細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，呈對(duì)數(shù)增殖，之后BMSCs增殖變緩慢，進(jìn)入平臺(tái)期。而加入細(xì)胞因子作用后，BMSCs的增殖受到不同程度的影響，表現(xiàn)為隨著PDGF-BB濃度的增高，BMSCs增殖速度加快，不同濃度PDGF-BB對(duì)BMSCs細(xì)胞增殖的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 BMSCs增殖曲線Fig.2 Proliferation curve of BMSCsn=5，*P<0.05

2.3 PDGF-BB對(duì)BMSCs遷移的影響

圖3為BMSCs遷移細(xì)胞的結(jié)晶紫染色圖。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)BMSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度PDGF-BB培養(yǎng)24 h后，10 ng/mL組、50 ng/mL組及100 ng/mL的BMSCs細(xì)胞遷移數(shù)量明顯高于對(duì)照組(0 ng/mL組)，并且隨著PDGF-BB濃度的增大，遷移的細(xì)胞數(shù)逐漸增多，呈現(xiàn)劑量依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 BMSCs遷移結(jié)晶紫染色(×200,Bar=50 μm)Fig.3 BMSCs migration crystal violet staining(×200,Bar=50 μm)

隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)結(jié)晶紫染色陽性BMSCs細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。隨著PDGF-BB濃度增高，遷移的細(xì)胞數(shù)逐漸增多明顯高于對(duì)照組，不同濃度PDGF-BB對(duì)BMSCs遷移的影響有明顯差異(圖4)。

圖4 BMSCs遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)柱狀圖(n=3)Fig.4 Number of migrating BMSCs in different groups(n=3)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 PDGF-BB對(duì)BMSCs成骨分化及成神經(jīng)分化的影響

BMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，成骨特異性基因Runx2、OPNmRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比，隨PDGF-BB濃度升高遞增；當(dāng)細(xì)胞因子濃度達(dá)到100 ng/mL時(shí)，OPN及Runx2的mRNA表達(dá)量明顯增高，達(dá)最大值(圖5)。

圖5 誘導(dǎo)分化后Runx2和OPN的表達(dá)Fig.5 Expression of Runx2 and OPN after induced differentiation實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，*P<0.05

BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，成神經(jīng)標(biāo)志物MAP2和β-Ⅲ-tubulin的表達(dá)量與對(duì)照組相比，隨PDGF-BB濃度升高遞增；當(dāng)細(xì)胞因子濃度達(dá)到100 ng/mL時(shí)，MAP2和β-Ⅲ-tubulin的表達(dá)量明顯增高，達(dá)最大值(圖6)。

圖6 誘導(dǎo)分化后MAP2和β-Ⅲ-tubulin的表達(dá)Fig.6 Expression of MAP2 and β-Ⅲ-tubulin after induced differentiation實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.5 細(xì)胞熒光染色檢測(cè)

通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)PDGF-BB是否可激活自噬相關(guān)蛋白表達(dá)。用不同濃度PDGF-BB(0、10、50、100 ng/mL)誘導(dǎo)BMSCs 24 h后，免疫熒光顯示各濃度組均檢測(cè)出抗ATG5、LC3陽性細(xì)胞(圖7)?？瞻捉M的基礎(chǔ)自噬水平較實(shí)驗(yàn)組中明顯較低，證明PDGF-BB是否可激活自噬；50 ng/mL PDGF-BB誘導(dǎo)后陽性細(xì)胞較多。初步判斷在50 ng/mL PDGF-BB誘導(dǎo)下，自噬水平較高，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇PDGF-BB誘導(dǎo)濃度提供參考。

圖7 不同濃度PDGF-BB對(duì)BMSCs的自噬激活(×100，Bar=50 μm)Fig.7 Autophagy activation of BMSCs by different concentrations of PDGF-BB(×100,Bar=50 μm)

2.6 再生牙髓樣組織大體觀察、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)變化

為探究自噬在牙髓再生中的表達(dá)水平是否與PDGF-BB相關(guān)，比較再生牙髓樣組織和原代人牙髓組織中自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3的表達(dá)。PDGF-BB組ATG5、LC3的表達(dá)明顯高于對(duì)照組牙髓樣組織，且其自噬蛋白的表達(dá)接近天然人牙髓組織，4個(gè)月PDGF-BB組的LC3表達(dá)明顯高于2個(gè)月PDGF-BB組(圖8A)，這與Image J軟件分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果相同(圖8B)。值得注意的是，PDGF-BB組4個(gè)月后ATG5的表達(dá)高于對(duì)照組牙髓樣組織，但略低于2個(gè)月，同時(shí)空白組4個(gè)月后ATG5的表達(dá)低于2個(gè)月。

圖8 自噬蛋白在牙髓樣組織再生過程中的表達(dá)情況Fig.8 Expression of autophagy related proteins during pulp like tissue regenerationA：各組牙髓樣組織免疫組化染色切片，標(biāo)尺大小為50 μm(×100)；B：Image J對(duì)自噬蛋白表達(dá)面積進(jìn)行定量評(píng)估，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，n=3)

3 討 論

BMSCs作為一種具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，相對(duì)其他組織干細(xì)胞而言，具有取材豐富，提取簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。PDGF-BB是PDGF家族(PDGFs)中的一員[10]。PDGF-BB主要由血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，平滑肌細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞也可以少量產(chǎn)生[11]。PDGF有AA、BB、CC、DD四種異構(gòu)體及AB異二聚體。PDGF二聚體與靶細(xì)胞表面受體(PDGFR-α或PDGFR-β)結(jié)合發(fā)揮作用。因此PDGF的生物學(xué)效應(yīng)取決于靶細(xì)胞表面PDGFR二聚體的表達(dá)水平[12]。其中PDGF-BB有較強(qiáng)的促細(xì)胞增殖和趨化作用，已有研究證明PDGF-BB可以激活PI3K信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成等途徑[13]，PDGF-BB可通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞有絲分裂、增殖與遷移，從而促進(jìn)新生血管生成[14-15]。這些研究結(jié)果均揭示PDGF-BB對(duì)新生血管、肌肉形成有促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致，但未研究PDGF-BB在牙髓損傷修復(fù)中的作用。本研究證實(shí)濃度0～100 ng/mL時(shí)，BMSCs的增殖、遷移及多向分化能力隨PDGF-BB濃度增高而升高。在細(xì)胞熒光染色檢測(cè)中初步判斷在50 ng/mL PDGF-BB誘導(dǎo)下，BMSCs自噬水平較高，因此本研究在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中選擇50 ng/mL作為牙髓組織異位再生的誘導(dǎo)濃度。

自噬作為一種重要的細(xì)胞程序，在各個(gè)生物領(lǐng)域被廣泛研究[16]。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如藥物，射線以及細(xì)菌感染等之后，細(xì)胞內(nèi)自噬信號(hào)被激活，在胞質(zhì)內(nèi)形成雙層膜自噬前體，自噬前體不斷延伸，形成雙層膜自噬體[5]。自噬體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，參與自噬流，吞噬降解細(xì)胞內(nèi)的無作用的物質(zhì)[17]。研究表明，自噬不僅發(fā)揮著細(xì)胞自我保護(hù)作用，也是一種細(xì)胞死亡程序[18]。

干細(xì)胞歸巢是體內(nèi)多種組織再生時(shí)存在的干細(xì)胞遷移和募集的現(xiàn)象[19]，基于細(xì)胞歸巢原理利用宿主體內(nèi)干細(xì)胞進(jìn)行組織再生，避免干細(xì)胞移植可能產(chǎn)生的問題，比細(xì)胞移植具備更多優(yōu)勢(shì)。本研究鑒于PDGF-BB能趨化宿主BMSCs遷移，通過細(xì)胞歸巢，建立牙髓組織異位再生模型。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行牙髓異位再生的位置位于大鼠皮下腹部，由于其遠(yuǎn)離大鼠頜骨根尖區(qū)，研究模型中能夠遷移進(jìn)入離體牙根管的間充質(zhì)干細(xì)胞絕大多數(shù)為非牙源性細(xì)胞。使用的Collagen Type Ⅰ支架材料屬于膠原凝膠類支架材料，其半固態(tài)半液態(tài)的特征利于材料均勻分布于整個(gè)根管系統(tǒng)，將大量?jī)?nèi)源性細(xì)胞通過物理性捕獲效應(yīng)固定于其中，再通過PDGF-BB的生物學(xué)效應(yīng)，動(dòng)員機(jī)體內(nèi)源性間充質(zhì)干細(xì)胞遷移進(jìn)入根管內(nèi)，調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的增殖、遷移、分化和自噬水平，從而實(shí)現(xiàn)牙髓組織的異位再生。本研究獲得的再生牙髓樣組織在在形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)上與天然人牙髓組織相似，自噬活性標(biāo)志物免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與天然人牙髓組織相近。

本研究基于體外實(shí)驗(yàn)篩選出的激活自噬的最佳濃度PDGF-BB聯(lián)合Collagen Type Ⅰ，搭載BMSCs，建立牙髓組織異位再生模型，探究自噬在牙髓再生過程的表達(dá)水平是否與PDGF-BB相關(guān)，比較再生牙髓樣組織和原代人牙髓組織中自噬相關(guān)蛋白ATG5、LC3的表達(dá)。鑒于自噬在細(xì)胞存活、遷移、分化和新生血管形成中的多方面作用，從基因與蛋白層面嘗試初步探討在通過BMSCs獲得牙髓再生的過程中自噬的作用，推測(cè)自噬的調(diào)節(jié)促進(jìn)干細(xì)胞歸巢的應(yīng)激適應(yīng)和分化，促進(jìn)牙髓修復(fù)再生過程。

ATG5參與自噬前體和自噬小泡的形成，ATG5-ATG12結(jié)合體作用于自噬前體形成和自噬泡的前后期[20-21]。LC3通常以兩種形式存在；LC3Ⅰ 和LC3Ⅱ，LC3Ⅰ在胞質(zhì)內(nèi)彌散分布，LC3Ⅱ聚集于自噬體膜上[22-23]，在自噬形成過程中，可溶性的LC3BⅠ轉(zhuǎn)化成自噬囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的形式(LC3Ⅱ)[24]，通過免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)源性LC3蛋白的表達(dá)，自噬誘導(dǎo)后細(xì)胞表現(xiàn)為點(diǎn)狀聚集增多，理論上可根據(jù)觀察到點(diǎn)狀聚集密集程度判斷細(xì)胞自噬的情況，但本研究?jī)H從總體上大致反映自噬的增加或減少，存在局限性。

本研究選用ATG5、LC3來檢測(cè)異位再生的牙髓樣組織中自噬的存在，而通過組織學(xué)染色比較以及統(tǒng)計(jì)分析顯示在飼養(yǎng)生長(zhǎng)2、4個(gè)月后PDGF-BB組的牙髓樣組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)遠(yuǎn)高于對(duì)照組，再生牙髓樣組織中自噬蛋白的表達(dá)與天然人牙髓組織相近。軟件分析統(tǒng)計(jì)顯示PDGF-BB組4個(gè)月后ATG5的表達(dá)高于對(duì)照組牙髓樣組織，但略低于2個(gè)月，同時(shí)空白組4個(gè)月后ATG5的表達(dá)低于2個(gè)月。提示ATG5的數(shù)量在再生修復(fù)中某階段其降解速度大于合成速度。本研究證明PDGF-BB能影響自噬，提示PDGF-BB與BMSCs自噬水平似乎在某一特定時(shí)間階段呈正相關(guān)。由于自噬是一個(gè)隨時(shí)間不斷變化的動(dòng)態(tài)過程，用靜態(tài)的方法去研究動(dòng)態(tài)的過程不可避免存在一定的局限和偏倚。本研究需進(jìn)一步采取自噬抑制劑抑制來進(jìn)一步說明自噬活性,揭示其在牙髓再生過程中的具體作用機(jī)制。

已有研究證實(shí)自噬相關(guān)指標(biāo)自噬相關(guān)基因ATG和LC3在牙髓炎模型中呈時(shí)間依賴性增加[25]。在牙齒發(fā)育與修復(fù)方面，也有研究發(fā)現(xiàn)自噬在牙胚和成牙本質(zhì)細(xì)胞層中有表達(dá)，而成牙本質(zhì)細(xì)胞可形成牙本質(zhì)[26]，同時(shí)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明自噬能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的礦化[27]。這些研究均提示自噬可能參與牙組織的再生與修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，猜測(cè)自噬可能是通過對(duì)受損細(xì)胞器及蛋白質(zhì)的吞噬產(chǎn)生細(xì)胞分化所需的能量，募集周圍間充質(zhì)干細(xì)胞，促進(jìn)牙髓細(xì)胞的遷移與分化，從而促進(jìn)牙髓再生[28]。

綜上所述，本研究闡明了PDGF-BB可促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖、遷移、成神經(jīng)成骨分化并影響自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，體外實(shí)驗(yàn)表明50 ng/mL濃度的PDGF-BB為激活自噬的最佳濃度；體內(nèi)研究證實(shí)，PDGF-BB介導(dǎo)的牙髓再生修復(fù)過程存在自噬現(xiàn)象。其中，自噬相關(guān)蛋白ATG5和LC3表達(dá)在時(shí)間上存在一定波動(dòng)變化，提示了自噬過程與牙髓組織的修復(fù)再生過程具有一定的關(guān)聯(lián)性。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)H為觀察性研究，自噬活性與BMSCs多向分化之間的關(guān)聯(lián)機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探討。