奚 燕,朱 維,周 琳
(1.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科,上海 200065;2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科,上海 200065)
靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism,VTE)是指血液在靜脈內(nèi)不正常的凝固,使管腔部分或全部阻塞,包括DVT和肺動(dòng)脈栓塞。VTE在臨床中相對(duì)常見,且頻繁復(fù)發(fā),它是一種多因素疾病,涉及血栓形成和各種危險(xiǎn)因素。在大多數(shù)國(guó)家,VTE已成為重大公共衛(wèi)生問題[1-2]。眾所周知,血管內(nèi)皮損傷、血流速度緩慢和血液高凝狀態(tài)是造成血栓形成的三大因素。盡管臨床上已發(fā)現(xiàn)誘發(fā)VTE的多種危險(xiǎn)因素,但血栓形成的機(jī)制仍未完全清楚。自2004年發(fā)現(xiàn)了中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular trap,NET)形成和釋放以來[3],新近的研究顯示NET在VTE中也有著重要的作用。本文綜述NET與VTE的關(guān)系,為未來通過抑制NET的形成、促進(jìn)NET降解來預(yù)防或治療VTE提供新的方向和臨床思路。
中性粒細(xì)胞是人體循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞群體[4]。2004年,Brinkmann等[5]首次通過免疫熒光證實(shí)了NET的存在。在炎癥刺激下,中性粒細(xì)胞釋放一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),即NET。NET主要是DNA和組蛋白構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6],此結(jié)構(gòu)還裝飾著大約20種不同的蛋白質(zhì),包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、髓過氧化物酶(MPO)、組織蛋白酶G、蛋白酶3、高遷移率族蛋白B1和抗菌肽LL-37等,在防御微生物中發(fā)揮重要作用[7]。
NET通過Nox(NADPH氧化酶)依賴途徑或Nox非依賴途徑形成,是一種區(qū)別于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的新的細(xì)胞死亡程序[8]。中性粒細(xì)胞在激活后2~4 h死亡時(shí)會(huì)釋放NET,這種形式的NET形成是由NOx依賴的多種促炎物質(zhì)所誘導(dǎo)的,包括IL-8、腫瘤壞死因子以及一些藥物例如佛波酯(PMA)等,其中誘導(dǎo)能力最強(qiáng)的就是PMA[8-9]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),PMA進(jìn)入細(xì)胞后,導(dǎo)致了一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣源進(jìn)入胞質(zhì),激活蛋白激酶C(PKC),PKC通過激活NADPH氧化酶刺激活性氧(ROS)產(chǎn)生[9],產(chǎn)生的ROS可以使中性粒細(xì)胞內(nèi)的嗜天青顆粒釋放NE和MPO;NE轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核后催化連接組蛋白的H1鍵斷裂并修飾核心蛋白,介導(dǎo)組蛋白降解,幫助染色質(zhì)解聚,解聚的染色質(zhì)與降解的蛋白混合,形成NET[10-11]。2012年,Parker等[12]發(fā)現(xiàn)了不依賴NOx的NET形成機(jī)制,當(dāng)人體受到某些細(xì)菌感染時(shí)這些細(xì)菌會(huì)釋放一些物質(zhì),如離子霉素。離子霉素是一種Ca+載體,在NET的形成Nox非依賴途徑中起關(guān)鍵作用。大量的離子霉素可以誘導(dǎo)細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流,內(nèi)流的鈣離子與胞質(zhì)中肽基精氨酸脫氨酶4(PAD4)結(jié)合,導(dǎo)致組蛋白上帶正電荷的精氨酸活化為不帶電荷的瓜氨酸,不帶電荷的瓜氨酸與DNA的靜電結(jié)合力減弱,進(jìn)而引起染色質(zhì)的解聚[10,13]。染色質(zhì)解聚后進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中,并結(jié)合MPO、NE等顆粒酶及其他蛋白,最終釋放至胞外,從而導(dǎo)致NET形成[8-14](圖1)。但NET形成的詳細(xì)過程還需進(jìn)一步研究。
圖1 NET的形成過程Fig.1 Formationprocess of NET
NET的主要成分是DNA、組蛋白以及NE[15]。有研究表明NET可以不通過血小板,直接激活凝血酶原從而誘導(dǎo)凝血酶的生成[16]。Von Brühl等[17]發(fā)現(xiàn),NET中的DNA可以直接激活凝血因子Ⅻ,從而激活內(nèi)源性凝血途徑,即通過DNA表面的負(fù)電荷與凝血因子Ⅻ表面的受體結(jié)合,誘導(dǎo)凝血因子Ⅻ的構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致少量活化凝血因子Ⅻ(FⅫa)的產(chǎn)生;產(chǎn)生的FⅫa可以導(dǎo)致血漿前激肽釋放酶(PPK)裂解,產(chǎn)生有活性的血漿激肽釋放酶(PK),激活大量的FⅫ,從而啟動(dòng)了內(nèi)源性凝血途徑。為了進(jìn)一步證明NET中的DNA可以促進(jìn)血栓形成,研究發(fā)現(xiàn)在注射了FⅫ抑制劑(PCK)的健康小鼠中,血栓的重量顯著減少,這種現(xiàn)象同樣發(fā)生在缺乏FⅫ的小鼠中;相反,就FⅪ缺乏的小鼠而言,血栓的重量只是略微地減輕,這表明FⅫa促進(jìn)血栓形成在很大程度上不依賴于FⅪ的激活,從側(cè)面驗(yàn)證了DNA的作用[4,18]??偠灾@些實(shí)驗(yàn)都表明NET中的DNA在凝血途徑中發(fā)揮重要作用。研究還發(fā)現(xiàn),NET中的DNA除了參與內(nèi)源性凝血途徑外,還能通過與纖溶酶和纖維蛋白形成復(fù)合物來抑制纖維蛋白降解,進(jìn)而促進(jìn)血栓的形成[19]。此外,還有實(shí)驗(yàn)證明,NET中的DNA還可以作為組織因子(tissue factor,TF)表達(dá)的支架,從而激活凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)[20]。
除了DNA,NET中的組蛋白在靜脈血栓形成中也發(fā)揮著十分重要的作用。組蛋白可以通過血小板依賴性途徑和非血小板依賴性途徑分別促進(jìn)血漿中凝血酶的生成[21]。在依賴血小板促進(jìn)凝血酶生成的途徑中,Semeraro等[22]用富含血小板血漿(PRP)探究了在依賴血小板途徑中組蛋白是如何促凝的,此實(shí)驗(yàn)借助CA-T法測(cè)定了天然組蛋白混合物在人PRP中凝血酶生成的情況;將組蛋白(0~160 g/mL)與PRP孵育,在檸檬化的PRP中,組蛋白隨著PRP含量提高不斷激活凝血反應(yīng),從而使凝血酶的含量也不斷地增加。在此實(shí)驗(yàn)條件下,為了避免自發(fā)激活的FⅫ通過內(nèi)源性途徑對(duì)凝血過程產(chǎn)生影響,且在不影響血小板在內(nèi)源性途徑發(fā)揮作用的前提下,實(shí)驗(yàn)又用檸檬酸鹽和CTI(FⅫ的抑制劑)對(duì)PRP進(jìn)行了處理,結(jié)果顯示組蛋白仍能很明顯地促進(jìn)凝血酶的生成。在CTI抑制的PRP中,盡管接觸系統(tǒng)的激活幾乎被取消,組蛋白仍然能夠誘導(dǎo)凝血酶的產(chǎn)生。由此可見,組蛋白促凝的作用不是通過內(nèi)源性凝血途徑發(fā)揮的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在用CTI抑制的血漿中去除血小板,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組蛋白不能誘導(dǎo)凝血酶生成,因此實(shí)驗(yàn)表明,組蛋白不能直接驅(qū)動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng),而是通過激活血小板來誘導(dǎo)凝血酶生成的[19,23-24]。
此外,研究發(fā)現(xiàn),非血小板依賴途徑促進(jìn)凝血酶的生成是組蛋白通過與TM蛋白(一種存在于單核細(xì)胞并且主要是內(nèi)皮細(xì)胞上的跨膜蛋白)和蛋白C結(jié)合來減少蛋白C系統(tǒng)激活而實(shí)現(xiàn)的[22]。此外,組蛋白還可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞表達(dá)TF,從而通過外源性途徑激活凝血功能[25-27]。在體內(nèi),大多數(shù)磷脂存在于細(xì)胞膜中,組蛋白通過形成孔道、破壞細(xì)胞膜以及誘導(dǎo)的離子內(nèi)流導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而使抗凝屏障破壞。在組蛋白誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷甚至死亡的過程中,可能會(huì)釋放出過氧化氫(H2O2),這也是NET形成的一個(gè)重要原因[6]。當(dāng)使用重組組蛋白時(shí),組蛋白的促凝作用似乎主要是由H3和H4介導(dǎo)的,其他類型的組蛋白沒有或至多有輕微的促凝效果,這表明H3、H4在促凝作用中扮演關(guān)鍵角色[23]。
NET的其他組成成分也被證明通過調(diào)節(jié)或降解內(nèi)源性抗凝劑來增加凝血酶的生成。Kambas等[25]通過免疫印跡法和激光評(píng)估NET中TF的表達(dá)情況以及對(duì)中性粒細(xì)胞來源的微顆粒表面TF進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞來源的TF在NET誘導(dǎo)的血栓形成過程中發(fā)揮重要作用。除此之外,NET中的NE還能夠裂解組織因子途徑抑制劑和增強(qiáng)凝血因子Ⅹa活性[26]。眾所周知,外源性凝血途徑是從釋放TF開始的,而NET中的NE可以使組織因子途徑抑制劑水解而失活,從而促進(jìn)外源性凝血過程。
NET促進(jìn)血栓形成的主要方式之一就是為血小板、紅細(xì)胞的黏附提供支架[4,27]。這種支架的形成不僅是血栓形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而且支架上的許多成分還可以積極地激活凝血過程。為了探究NET是否為血小板、紅細(xì)胞等的聚集提供支架,F(xiàn)uchs等[28]在體外采用PRP灌注NET,觀察到血小板吸附在NET上;與此同時(shí),借助全血灌注NET時(shí),同樣可以觀察到類似的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步探究NET作為血栓形成的支架是否受其他因素的影響,有研究對(duì)NET和纖維蛋白分別進(jìn)行溶栓,并將其敏感性進(jìn)行對(duì)比。該研究首先降解NET,用t-PA(組織纖溶酶原激活物)去除纖維蛋白,并將用血小板激活因子預(yù)處理過的中性粒細(xì)胞釋放到處理過的NET中,于復(fù)鈣血液中孵育,結(jié)果顯示,經(jīng)組織纖溶酶原激活物處理過的NET僅可去除纖維蛋白,不能阻止與中性粒細(xì)胞相關(guān)血栓的形成,而采用組織纖溶酶原激活物和脫氧核糖核酸酶共同處理后的NET,雖然有活化的中性粒細(xì)胞存在但無血栓形成,由此可證實(shí)NET作為血栓形成的支架不依賴?yán)w維蛋白[27]。
針對(duì)這一結(jié)果,F(xiàn)uchs等[28]的研究更詳細(xì)地解釋了此過程,即用懸浮在血漿中的血小板灌注NET,觀察到NET與血小板的強(qiáng)烈粘連,這直接證明了NET為血小板的聚集提供了支架。在灌注后的1 min內(nèi),NET上出現(xiàn)了小的血小板聚集物;接下來的9 min內(nèi),血小板的聚集物在NET上迅速增加;當(dāng)用DNA酶處理NET后,血小板因NET的降解而不能發(fā)揮聚集作用,因此該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明,血小板確實(shí)附著在NET上。除此之外,有研究通過把無細(xì)胞的NET(從被PMA刺激的中性粒細(xì)胞中收集)與人血小板孵育,發(fā)現(xiàn)NET單獨(dú)存在(不加其他血小板激動(dòng)劑)不僅可促進(jìn)血小板聚集,分泌ATP和ADP,還能增加血小板表面CD62L和磷脂酰絲氨酸(PS)的表達(dá)[19,29]。
NET在深靜脈血栓形成中發(fā)揮重要作用,尋找有特異性的抑制NET產(chǎn)生或破壞其結(jié)構(gòu)的方法可能為VTE提供新的預(yù)防和治療的途徑。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于NET產(chǎn)生的Nox依賴途徑,靶向性抑制NADPH或抑制ROS產(chǎn)生可以有效地減少NET生成。Parker等[12]發(fā)現(xiàn)利用NADPH抑制劑DPI可以減少PMA誘導(dǎo)的NET形成,DPI使PMA刺激所形成的NET降到最低水平,與此同時(shí),DPI還阻止了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌誘導(dǎo)的NET生成。ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸和ROS特定清除劑(Mito-TEMPO)可減少自發(fā)性NET的形成;MPO抑制劑如4-amino benzoicacidhydrazide[30-31]和PF1355可減少中性粒細(xì)胞聚集,從而減少NET的形成[32]。對(duì)NET的抑制,除了抑制其形成的通路,還可以靶向抑制其組成成分。NET主要由組蛋白和DNA組成,目前常用的NET抑制劑DNA酶,通過破壞NET結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。DNase1被證明可以破壞DNA結(jié)構(gòu),但對(duì)組蛋白、彈性蛋白酶和其他NET的組成成分幾乎沒有影響。此外,對(duì)于腫瘤壞死因子和IL-17誘導(dǎo)產(chǎn)生的NET,利用相關(guān)抗體也能阻斷NET的形成從而減緩疾病的進(jìn)展[33-34]。目前關(guān)于NET抑制劑主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面,缺乏大規(guī)模的臨床研究,主要是目前臨床應(yīng)用存在較大的局限性。首先,NET形成的確切機(jī)制尚未完全闡明;其次,NET相關(guān)的各種組成成分在血栓性疾病中發(fā)揮的作用仍需進(jìn)一步探索。理解NET在VTE中的作用可以更好的理解血栓性疾病的發(fā)病機(jī)制,為VTE的預(yù)防和治療開辟新的道路。
鑒于NET在眾多疾病中都發(fā)揮著舉足輕重的作用,尋找其診斷和治療的方法就尤為迫切。高度特異性靶向藥物的治療效果明顯優(yōu)于非靶向藥物的治療。中性粒細(xì)胞釋放的DNA和顆粒細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì),可以形成堆疊核小體(NS)[35]。單克隆抗體2C5對(duì)完整的NS具有很強(qiáng)的特異性,這表明2C5可能在NET中能夠靶向抑制NS。有實(shí)驗(yàn)通過使用中性粒細(xì)胞和HL-60細(xì)胞在體外生成NET,采用ELISA評(píng)估2C5對(duì)NET的特異性,結(jié)果表明其與NET結(jié)合的特異性與純化的核組蛋白底物相似[35-36]。此外,免疫熒光顯示在靜態(tài)和灌流微流控細(xì)胞培養(yǎng)中,2C5染色均呈網(wǎng)狀,即使在網(wǎng)狀壓實(shí)后也是如此,用2C5修飾脂質(zhì)體可顯著增強(qiáng)脂質(zhì)體與NET的結(jié)合。有研究表明,2C5可用于識(shí)別和可視化NET,并作為NET靶向診斷和治療的配體,為其診斷和治療開辟一條新的道路[36]。
2020年初,SARS-CoV-2導(dǎo)致的COVID-19在全球各地開始暴發(fā)[37]。它常表現(xiàn)為流感樣癥狀,并可發(fā)展為病毒性肺炎,導(dǎo)致多種并發(fā)癥,其中最嚴(yán)重的是血栓導(dǎo)致的多器官衰竭[38]。經(jīng)研究證實(shí),新冠肺炎患者的凝血功能明顯異常,發(fā)生病理性動(dòng)脈和靜脈血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。最新的研究表明,新冠肺炎患者的這些嚴(yán)重并發(fā)癥可能與中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NET水平升高有關(guān)。早期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞主要通過氧化和吞噬作用殺死病原體[39]。而現(xiàn)在大量實(shí)驗(yàn)證明NET的形成是中性粒細(xì)胞殺死病原體的另一種方法。雖然NET在宿主防御病原體方面的作用是有益的,但是持續(xù)的NET形成也會(huì)引起一連串的不良反應(yīng),包括破壞周圍組織,促進(jìn)微血栓形成,導(dǎo)致肺臟、心血管和腎臟等器官的永久性的損傷[40]。相關(guān)文獻(xiàn)表明,嚴(yán)重的新冠肺炎及其并發(fā)癥與細(xì)胞因子風(fēng)暴有關(guān),其特征就是血漿中IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-17、IFN-γ等誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子1、粒細(xì)胞集落刺激因子、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α和腫瘤壞死因子α濃度升高。這些炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的活動(dòng),并誘導(dǎo)趨化因子(增加中性粒細(xì)胞向炎癥部位運(yùn)輸?shù)姆肿?的表達(dá)。特別值得注意的是,NET同時(shí)可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β。如果重癥新冠肺炎患者Net—IL-1β環(huán)被激活,NET和IL-1β的加速產(chǎn)生則可能會(huì)導(dǎo)致呼吸的失代償、微血栓形成和異常免疫反應(yīng),從而導(dǎo)致重癥患者的肺泡和肺內(nèi)皮細(xì)胞過度損傷。內(nèi)皮受損會(huì)導(dǎo)致血管性血友病因子(vWF)的釋放,從而激活血小板和中性粒細(xì)胞。活化的血小板還能刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET,與此同時(shí),NET也為血小板、紅細(xì)胞和纖維蛋白聚集提供了支架,從而有助于血栓的形成[41]。近期報(bào)道證明,新冠肺炎患者NET標(biāo)志物(如循環(huán)游離DNA或DNA-NE復(fù)合體)水平的升高證實(shí)了NET的過度形成,與此同時(shí)患者血中NE活性也比正常人高30~60倍[42]。因此,針對(duì)重癥新冠肺炎患者的相關(guān)并發(fā)癥,NET可能提供了一條治療新冠肺炎相關(guān)并發(fā)癥的新出路。
自2004年發(fā)現(xiàn)NET后,大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NET與眾多疾病存在密不可分的關(guān)系,在血栓形成方面也發(fā)揮了重要作用。若能對(duì)NET的產(chǎn)生過程及作用機(jī)制有更深入的了解,明確其形成的分子機(jī)制及涉及的下游信號(hào)途徑并能夠?qū)C(jī)體造成損傷的NET進(jìn)行量化,則可開發(fā)出針對(duì)某種特殊成分或特殊環(huán)節(jié)的特異性的藥物,從而進(jìn)行靶向治療。這不僅對(duì)靜脈血栓性疾病的治療具有里程碑式意義,與此同時(shí),對(duì)NET的進(jìn)一步了解也可為COVID-19相關(guān)并發(fā)癥的治療提供新的思路。