生物大分子相分離及其藥物靶向技術(shù)研究進(jìn)展

吳 晗，孫奮勇

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，上海 200127；2.同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200072)

在真核細(xì)胞中，各種有膜細(xì)胞器通過(guò)磷脂雙分子層將細(xì)胞分隔成具有不同結(jié)構(gòu)和功能的區(qū)室，多種生化反應(yīng)在區(qū)室內(nèi)有序進(jìn)行。此外，細(xì)胞內(nèi)的生物大分子可通過(guò)發(fā)生相分離形成無(wú)膜細(xì)胞器，保證了區(qū)室內(nèi)反應(yīng)的高效性、獨(dú)立性、精密性。目前已發(fā)現(xiàn)的無(wú)膜細(xì)胞器包括核仁、Cajal小體、P小體、應(yīng)激顆粒[1]等，在真核生物細(xì)胞內(nèi)的多種生命活動(dòng)中均發(fā)揮著重要作用。相分離形成的生物分子凝聚物形同液滴，并具有液體樣的性質(zhì)。

蛋白質(zhì)聚集是神經(jīng)退行性疾病的主要標(biāo)志，目前已在病理包涵體中發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)，如TDP-43蛋白[2]、FUS蛋白[3]、α-突觸核蛋白[4]和tau蛋白等[5]都會(huì)聚集并顯示出相分離，其異常相分離行為可能是神經(jīng)變性中蛋白質(zhì)聚集的觸發(fā)因素。

相分離和癌癥進(jìn)展之間也存在一定聯(lián)系，多種凝聚物已被報(bào)道在癌癥中發(fā)揮作用，如DNA修復(fù)灶、轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ、超級(jí)增強(qiáng)子等[6]。調(diào)節(jié)細(xì)胞中相分離動(dòng)力學(xué)的治療策略，可能是治療具有異常生物分子凝聚物的神經(jīng)退行性疾病和癌癥的潛在手段。由于相分離是一個(gè)高度復(fù)雜的過(guò)程，許多類型的藥劑，如小分子、抗體和人工合成肽，可以控制相分離過(guò)程并最終有效地治療疾病。

1 相分離的概念、性質(zhì)與研究歷史

在工程學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)領(lǐng)域，相分離是指當(dāng)二元或多元系統(tǒng)穩(wěn)定而均勻的單相狀態(tài)被打破時(shí)，不同成分之間發(fā)生相互融合、相互阻隔，分離成具有不同結(jié)構(gòu)和組成的幾個(gè)相。在生物學(xué)中，相分離是溶液中互溶組分的可逆分離，產(chǎn)生兩種不斷相互交換的獨(dú)立相：稀釋相和包含其中的凝聚相[7-8]，如同油水相混，在靜置狀態(tài)下，最終分散在水面上的小油滴聚集在一起，形成大油滴浮在水面上，與水互不相溶。

相分離的凝聚物表現(xiàn)出類似液體的液滴行為，凝聚物可以相互融合，也可以發(fā)生裂變[9]。凝聚物具有選擇性，一些大分子被并入凝聚物，另一些則無(wú)法進(jìn)入凝聚物，被排除在凝聚物之外。且這一過(guò)程具有可逆性，凝聚物可能會(huì)溶解為游離的大分子[8-9]。相對(duì)于固體或類固體結(jié)構(gòu)中的大分子，相分離凝聚物中的大分子通常具有更快的擴(kuò)散和內(nèi)部重排速度，這可以通過(guò)光漂白恢復(fù)試驗(yàn)證明[9]。相分離凝聚物中的大分子與游離溶液中的大分子具有更快的交換速率。相分離的凝聚物還會(huì)經(jīng)歷“老化”，老化的凝聚物可以由液體變?yōu)楣腆w狀或凝膠狀[10-11]，且其內(nèi)部重排動(dòng)力學(xué)減慢，融合能力降低[3]，有時(shí)會(huì)形成網(wǎng)絡(luò)和淀粉樣聚集體[12]。

18世紀(jì)30年代，在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)觀察到了第一個(gè)無(wú)膜區(qū)室，后來(lái)被稱為核仁[13]。從那時(shí)起，在幾乎所有真核細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上都發(fā)現(xiàn)了許多這樣的隔室。它們可以相互融合，并且在光漂白恢復(fù)試驗(yàn)中可以與周圍介質(zhì)發(fā)生交換。2009年，Brangwynne等[14]在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)，P小體像熔巖燈里的液滴一樣相互碰撞、聚集、融合，劇烈搖晃后會(huì)分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴。這開創(chuàng)了相分離研究的先河，為無(wú)膜細(xì)胞器如何形成并在細(xì)胞內(nèi)行使功能提供了新的思路。兩年后，他們發(fā)現(xiàn)核仁也表現(xiàn)出類似液滴的行為[15]。2012年，研究在試管中發(fā)現(xiàn)RNA和蛋白質(zhì)分子間也可以通過(guò)弱相互作用力發(fā)生液滴樣融合，這證明了相分離可以在體外以生化反應(yīng)的簡(jiǎn)單方式重現(xiàn)[16-17]。到2015年，相分離研究熱潮興起。Patel等[3]在肌萎縮性側(cè)索硬化患者的神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)US蛋白發(fā)生異常相分離并形成蛋白質(zhì)團(tuán)塊，這提供了凝聚物固相化的異常相分離可能導(dǎo)致疾病的首批具體證據(jù)。截至目前，已有多項(xiàng)研究證明相分離與眾多生理過(guò)程及神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、病毒感染等的發(fā)生密切關(guān)系。

2 相分離的生理功能

相分離參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。研究提出轉(zhuǎn)錄共激活因子BRD4和MED1可以在超級(jí)增強(qiáng)子處發(fā)生相分離并形成液滴，將轉(zhuǎn)錄裝置聚集在超級(jí)增強(qiáng)子附近，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄過(guò)程的區(qū)室化反應(yīng)，可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[18]。OCT4是胚胎干細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，由轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。OCT4可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄中介體復(fù)合物亞基MED1相互作用，在胚胎干細(xì)胞超級(jí)增強(qiáng)子處形成相分離凝聚物，從而激活基因表達(dá)[19]。

相分離參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在腎足細(xì)胞的膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，pNephrin-Nck-N-WASP通過(guò)多價(jià)相互作用發(fā)生相分離，而相分離的程度受分子間相對(duì)濃度調(diào)節(jié)。相分離通過(guò)增加N-WASP的膜上駐留時(shí)間，顯著上調(diào)N-WASP的活性，增強(qiáng)其通過(guò)Arp2/3復(fù)合物促進(jìn)肌動(dòng)蛋白成絲的能力[20]。

相分離參與調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)。53BP1蛋白是將DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至p53及其他腫瘤抑制蛋白途徑中的一個(gè)重要傳感器，在保持基因組穩(wěn)定性和預(yù)防癌癥的發(fā)生方面起重要作用。在有53BP1蛋白參與的DNA損傷修復(fù)過(guò)程中，53BP1蛋白存在液滴樣的相分離現(xiàn)象[21]，這種相分離作用可能有助協(xié)調(diào)局部DNA損傷識(shí)別和全局基因激活。

相分離參與調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。蛋白酶體是一種主要的蛋白水解機(jī)器，通過(guò)選擇性地降解泛素化蛋白來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞中的蛋白穩(wěn)態(tài)。RAD23B，作為蛋白酶體的底物穿梭因子，是誘導(dǎo)泛素化蛋白和蛋白酶體相分離的關(guān)鍵分子。RAD23B具有兩個(gè)典型的泛素結(jié)合域(UBA)和一個(gè)蛋白酶體結(jié)合域(UBL)，通過(guò)UBA結(jié)構(gòu)域收集細(xì)胞泛素化蛋白形成相分離液滴，然后通過(guò)UBL結(jié)構(gòu)域招募蛋白酶體[22]。此外，由相分離驅(qū)動(dòng)形成的無(wú)膜隔室對(duì)衰老相關(guān)疾病非常敏感，衰老及相關(guān)疾病的發(fā)生可能與細(xì)胞逐漸失去對(duì)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)也即相分離的控制有關(guān)。

相分離參與調(diào)節(jié)X染色體失活。X染色體失活是調(diào)節(jié)失活X染色體基因沉默的重要生物學(xué)過(guò)程，而基因沉默又與癌癥有著一定的聯(lián)系。引發(fā)X染色體沉默的長(zhǎng)鏈非編碼RNA Xist是重要參與者之一，其通過(guò)多價(jià)E重復(fù)元件結(jié)合多種蛋白質(zhì)，如PTBP1、MATR3、TDP-43和CELF1，然后通過(guò)自聚集和異型蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用在無(wú)活性X區(qū)室中形成相分離凝聚物[23]，其形成對(duì)強(qiáng)制執(zhí)行X連鎖基因沉默和錨定Xist至關(guān)重要。

3 相分離與疾病

異常相分離和凝聚物的形成與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，如癌癥與神經(jīng)退行性疾病等。其致病原因大致分為3種[24]：凝聚物組裝的異常、相分離調(diào)節(jié)劑的異常和細(xì)胞內(nèi)物理化學(xué)條件的異常。

3.1 相分離與神經(jīng)退行性疾病

神經(jīng)退行性疾病的特點(diǎn)是認(rèn)知或運(yùn)動(dòng)功能逐漸喪失，如在阿爾茨海默病和額顳葉癡呆中出現(xiàn)的認(rèn)知缺陷及在肌萎縮側(cè)索硬化、亨廷頓病和帕金森病中出現(xiàn)的運(yùn)動(dòng)缺陷。

異常相分離形成的胞質(zhì)或胞核病理性蛋白的區(qū)域聚集[25]已被證明與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生相關(guān)。異常相分離可能會(huì)導(dǎo)致生物分子凝聚物喪失其動(dòng)態(tài)特性，從可逆的動(dòng)態(tài)相分離轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡鏍顟B(tài)[3,26-29]，稱為“老化”，最終導(dǎo)致固態(tài)蛋白質(zhì)聚集體的形成[30]。具有這種性質(zhì)的相關(guān)蛋白包括TDP-43蛋白、FUS蛋白、α-突觸核蛋白和tau蛋白等，它們所形成的異常凝聚物呈纖維樣聚集在神經(jīng)退行性疾病患者的受影響神經(jīng)元中，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡。

在神經(jīng)退行性疾病中，基因突變或重復(fù)擴(kuò)增、異常翻譯后修飾、亞細(xì)胞定位改變和蛋白質(zhì)質(zhì)量控制受損都可促進(jìn)異位凝聚物的形成以及從類液體狀態(tài)向固體狀態(tài)的改變，導(dǎo)致病理性蛋白質(zhì)聚集。以肌萎縮性側(cè)索硬化和額顳葉癡呆為例，疾病相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白(如FUS蛋白和TDP-43蛋白)突變促進(jìn)其積聚在應(yīng)激顆粒的相分離凝聚物中，加速凝聚物的“老化”，進(jìn)而損害神經(jīng)元核糖核蛋白顆粒的活性和功能。除了基因突變以外，異常的翻譯后修飾也與疾病的發(fā)生相關(guān)，如FUS蛋白的精氨酸甲基化過(guò)程。在正常人腦中，F(xiàn)US蛋白IDR區(qū)的精氨酸殘基發(fā)生甲基化；在額顳葉癡呆的人腦中，F(xiàn)US蛋白精氨酸甲基化的缺失促進(jìn)了相分離的發(fā)生并降低了FUS蛋白凝聚物在細(xì)胞中的活力。此外，亞細(xì)胞定位的改變也可以通過(guò)影響相分離來(lái)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如FUS蛋白核定位信號(hào)的突變，降低了FUS蛋白與核輸入受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致核輸入受阻，使得FUS蛋白聚積于細(xì)胞質(zhì)中，促進(jìn)了其相分離及“老化”[24]。

3.2 相分離與腫瘤

相分離提供了一個(gè)理解和解釋突變?nèi)绾螌?dǎo)致腫瘤發(fā)生的新研究模型。在腫瘤細(xì)胞中，異?；驍U(kuò)增、錯(cuò)義突變、染色體易位、定位改變和/或降解不當(dāng)[31]，使得細(xì)胞環(huán)境和外部信號(hào)被錯(cuò)誤調(diào)節(jié)，可能導(dǎo)致腫瘤中的相分離處于異常激活或抑制狀態(tài)。腫瘤通常具有正常凝聚物破壞或異常凝聚物形成的特征。在某些腫瘤中，異常凝聚物與細(xì)胞轉(zhuǎn)化(如癌基因的表達(dá))有關(guān)；在另一些腫瘤中，異常凝聚物會(huì)促進(jìn)癌癥進(jìn)展(如癌細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移)。其他與癌癥相關(guān)的過(guò)程，如細(xì)胞代謝改變或上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，也受凝聚物功能障礙的介導(dǎo)。

致癌突變與特定的相分離缺陷有關(guān)。如腫瘤抑制因子SPOP，作為泛素連接酶的底物接頭，可靶向各種原癌蛋白進(jìn)行泛素化和蛋白酶體降解。由于SPOP的相分離需要其與底物結(jié)合，其致癌突變會(huì)破壞SPOP與底物的相互作用，從而破壞SPOP的相分離，也破壞了底物定位到相分離凝聚物中，導(dǎo)致細(xì)胞中SPOP底物原癌蛋白積累，促進(jìn)細(xì)胞增殖[32]。轉(zhuǎn)錄失調(diào)同樣與異常相分離相關(guān)。以轉(zhuǎn)錄共激活子TAZ為例，在腫瘤細(xì)胞中，Hippo信號(hào)的失活使得TAZ通過(guò)參與超級(jí)增強(qiáng)子與多個(gè)關(guān)鍵輔助因子形成相分離凝聚物來(lái)促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。相反，Hippo信號(hào)的激活會(huì)誘導(dǎo)TAZ中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的磷酸化，抑制其發(fā)生相分離[33]。染色體易位也會(huì)破壞相分離，以早幼粒細(xì)胞白血病核小體(PML NBs)為例，其表現(xiàn)出相分離特性，具有調(diào)節(jié)衰老和維持端粒的功能。而PML和RAR之間的染色體易位會(huì)破壞PML NBs相分離凝聚物的形成，導(dǎo)致急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)生[33]。

越來(lái)越多的研究表明，腫瘤相關(guān)蛋白的相分離參與表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)降解，在腫瘤發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。以相分離調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為例，當(dāng)免疫細(xì)胞中的T細(xì)胞受體(TCR)信號(hào)通路被激活時(shí)，下游效應(yīng)蛋白自發(fā)地相分離形成動(dòng)態(tài)的膜相關(guān)信號(hào)簇，使得ZAP70等激酶可以進(jìn)入簇，而CD45等磷酸酶則不能。這種能力使信號(hào)簇能夠放大輸入的信號(hào)。致癌突變促進(jìn)了異常TCR相關(guān)信號(hào)簇的形成，從而激活致癌下游信號(hào)[34]。

基于相分離在腫瘤病理生理過(guò)程中的作用，目前已有一些通過(guò)調(diào)控相分離而靶向治療腫瘤的策略和方向，如調(diào)節(jié)相分離核心蛋白的濃度和翻譯后修飾調(diào)控[35-36]；干擾相分離相關(guān)的結(jié)合分子，包括RNA和分子伴侶[19,37-38]；控制相分離的環(huán)境條件[39-41]；干擾相分離所需的外部介質(zhì)，如膜表面等[42-43]。

4 相分離與藥物研發(fā)

對(duì)于腫瘤的靶向治療，傳統(tǒng)的靶標(biāo)大部分是具有明確活性位點(diǎn)的蛋白，并主要通過(guò)使用小分子占據(jù)驅(qū)動(dòng)的藥理學(xué)作用模式來(lái)控制蛋白功能。然而，有許多腫瘤的靶標(biāo)，例如K-RAS、MYC和p53蛋白等，由于缺乏可被小分子靶向的蛋白質(zhì)口袋，被認(rèn)為是不可成藥的[44]。鑒于已有研究發(fā)現(xiàn)一些不可成藥的靶點(diǎn)受到相分離的調(diào)控，針對(duì)廣闊的不可成藥的相分離靶點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，有望成為治療相關(guān)疾病的新型策略。

由于相分離生物過(guò)程的高度復(fù)雜性，調(diào)節(jié)相分離過(guò)程進(jìn)而治療疾病的分子種類也很多樣，包括小分子、抗體和人工合成肽等，可以通過(guò)靶向無(wú)序區(qū)、結(jié)構(gòu)域或調(diào)節(jié)變構(gòu)等途徑來(lái)調(diào)節(jié)相分離。Girdhar等[45]發(fā)現(xiàn)，小分子吖啶衍生物AIM4具有很強(qiáng)的抗TDP-43聚集作用，并進(jìn)一步證明AIM4與TDP-43無(wú)序區(qū)的殘基結(jié)合以抑制其相分離。Zhu等[46]在SHP2突變體異常相分離現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)SHP2變構(gòu)抑制劑ET070，可將SHP2突變體鎖定在特定構(gòu)象以抑制其相分離。Wang等[47]通過(guò)對(duì)SAS-CoV-2病毒核衣殼蛋白的二聚化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)出了一種特異靶向二聚化結(jié)構(gòu)域的干擾肽以破壞其相分離，進(jìn)而抑制病毒復(fù)制，恢復(fù)先天免疫。研究發(fā)現(xiàn)5種小分子化療藥物表現(xiàn)出選擇性分配入凝聚物的性質(zhì)，且可能可以用芳香環(huán)結(jié)構(gòu)解釋這種行為，這提供了相分離動(dòng)力學(xué)角度的新治療策略，為分子設(shè)計(jì)定制藥物進(jìn)入特定凝聚體提供了新的可能性[48]。

此外，新技術(shù)亦不斷涌現(xiàn)。超分辨率顯微鏡(super-resolution microscopy,SRM)的出現(xiàn)為生物大分子凝聚物的表征提供了接近單分子的分辨率，并可用以直接定量成像。以BIN1為例，它是遲發(fā)性阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)因素，De Rossi等[49]應(yīng)用SRM發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元中BIN1在突觸前的位點(diǎn)和重要調(diào)節(jié)作用，及其缺失所導(dǎo)致的空間記憶鞏固受損。有研究在體外建立了生物大分子的互作檢測(cè)及高通量篩選互作調(diào)控物(phase-separated condensate-aided enrichment of biomolecular interactions in test tubes,CEBIT)的技術(shù)體系，其可用于觀察化合物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響[50]。

總的來(lái)說(shuō)，相分離相關(guān)藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)還處于起步階段，而基于相分離蛋白結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)以及高通量篩選是相分離調(diào)節(jié)劑開發(fā)的可能途徑。

5 總結(jié)與展望

相分離液滴具有隨時(shí)間而發(fā)生“老化”的特點(diǎn)，并與疾病的發(fā)生相關(guān)。多價(jià)相互作用是決定相分離發(fā)生的必要條件，具有模塊化結(jié)構(gòu)域和/或內(nèi)在無(wú)序區(qū)的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)多價(jià)相互作用的機(jī)制發(fā)生相分離。此外，凝聚物的形成與解離還受到環(huán)境因素的影響，如酸堿度、溫度、ATP含量都可能影響相分離的發(fā)生。

異常相分離與疾病發(fā)生有著密切的聯(lián)系。神經(jīng)退行性疾病的特點(diǎn)是形成纖維狀不溶性蛋白聚集體，其致病機(jī)制與治療手段目前尚不明朗，相分離提供了闡釋和治療神經(jīng)變性的新思路；腫瘤相關(guān)蛋白的相分離涉及表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄翻譯、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白質(zhì)定位與降解等多個(gè)生理過(guò)程的異常?？筛鶕?jù)發(fā)生相分離的腫瘤相關(guān)蛋白致病機(jī)制進(jìn)行藥物研發(fā)。通過(guò)靶向無(wú)序區(qū)或結(jié)構(gòu)域、調(diào)節(jié)變構(gòu)等策略來(lái)設(shè)計(jì)抗體、小分子化合物及合成肽是藥物研發(fā)的潛在策略。

隨著相分離領(lǐng)域的萌生、發(fā)展和推進(jìn)，越來(lái)越多的生物學(xué)功能和疾病發(fā)病機(jī)制都可以用相分離進(jìn)行解釋和闡明，為靶向治療和藥物研發(fā)提供了新的角度和無(wú)限的空間，而在相分離研究如火如荼的當(dāng)下，也需要一些理性的思考。例如，相分離與生命過(guò)程的本質(zhì)聯(lián)系不明確，一些研究尚不能明確區(qū)分相分離與生命過(guò)程的因果關(guān)系，而只是簡(jiǎn)單證明其相關(guān)性；相分離的鑒定手段不完善，不能區(qū)分相分離和其他生命機(jī)制之間的區(qū)別，而只是現(xiàn)象性的描述；相分離的體外特性與細(xì)胞內(nèi)性質(zhì)的差別限制了研究成果的普適性等。相分離研究在生命過(guò)程、病理過(guò)程、藥物研發(fā)領(lǐng)域仍有著很大的發(fā)展空間。