類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與血清免疫球蛋白及疾病活動(dòng)度相關(guān)性研究〔1〕

高強(qiáng)，王佩佩，牛騰耀，王霞，詹靜慧，張艷麗

(寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥為基本病理改變的全身性自身免疫疾病，臨床上多表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)性、持續(xù)性、進(jìn)行性的小關(guān)節(jié)受累，并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(DAS28)以28個(gè)關(guān)節(jié)[包括雙手近端指關(guān)節(jié)(10個(gè))、雙手掌指關(guān)節(jié)(10個(gè))、雙腕關(guān)節(jié)(2個(gè))、雙肘關(guān)節(jié)(2個(gè))、雙肩關(guān)節(jié)(2個(gè))、雙膝關(guān)節(jié)(2個(gè))]計(jì)分，通過(guò)測(cè)量患者壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)及血沉(ESR)來(lái)計(jì)算，可以較好地反映RA患者的疾病活動(dòng)度[2]。同時(shí)，RA患者血清中血清免疫球蛋白(Ig)M，IgG，IgA水平均高于正常人，提示體液免疫功能紊亂在RA的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用[3]。這些免疫球蛋白多為自身抗體，如類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)等，會(huì)導(dǎo)致RA患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫痛、骨質(zhì)破壞，甚至發(fā)生關(guān)節(jié)畸形[4]。濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tfr)是一種定位于淋巴濾泡生發(fā)中心(GC)的CD4+T細(xì)胞，主要通過(guò)抑制濾泡輔助性T(Tfh)細(xì)胞以及GC中B細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮其負(fù)向調(diào)節(jié)體液免疫的作用，從而維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)[5]。RA目前的主要治療方法是長(zhǎng)期服用抗風(fēng)濕藥物，尚無(wú)根治辦法。已經(jīng)有研究[6-9]顯示Tfr細(xì)胞的數(shù)目和功能異常與多種自身免疫性疾病有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究RA患者外周血Tfr細(xì)胞與血清免疫球蛋白水平及疾病活動(dòng)度的相關(guān)性，討論Tfr細(xì)胞在RA中發(fā)揮的作用，為臨床上干預(yù)RA的發(fā)展提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2020年7月—2021年7月30 例在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的RA患者，均符合2010年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)制定的診療標(biāo)準(zhǔn)[10]。RA診斷標(biāo)準(zhǔn)：就診前6個(gè)月不合并其他感染性疾病和自身免疫??；就診前未服用過(guò)激素及抗風(fēng)濕類(lèi)藥物?；颊吣挲g(53.7±11.9) 歲；男15 例，女15 例；檢測(cè)血清IgM為(1.7±1.2) g/L，IgG為(17.3±6.4) g/L，IgA為(3.4±1.5) g/L。同時(shí)納入30名健康體檢者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：近期無(wú)感染、發(fā)熱；無(wú)自身免疫病及腫瘤、艾滋病、結(jié)核等慢性感染性疾病病史。健康對(duì)照組年齡(49.6±10.6) 歲，男15 例，女15 例。

Accuri C6型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；多甲藻黃素-葉綠素蛋白-花青素5.5(PerCP-Cy5.5)標(biāo)記的抗人CD4單克隆抗體(CD4-PerCP-Cy5.5)、Alexa Fluor 488(AF488)標(biāo)記的抗人CXC趨化因子受體5(CXCR5)單克隆抗體(CXCR5-AF488)購(gòu)自美國(guó)BD公司；別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的抗人叉頭盒P3(FOXP3)單克隆抗體(FOXP3-APC)購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 RA患者分組

根據(jù)DAS28值，將RA患者分為高度活動(dòng)組(DAS28>5.1，16 例)和輕中度活動(dòng)組(DAS28≤5.1，14 例)[11]。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理

采集RA患者和健康對(duì)照者的新鮮全血，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)抗凝。用等體積磷酸緩沖液(PBS)稀釋全血后，加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，再用PBS緩沖液洗滌。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Tfr細(xì)胞比例

取剛分離的PBMC 2×106個(gè)，順序加入CD4-PerCP-Cy5.5，CXCR5-AF488和FOXP3-APC溶液各3 μL，在室溫且避光的條件下孵育30 min后，用PBS緩沖液洗滌兩次，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 RA組和健康對(duì)照組外周血Tfr細(xì)胞比例比較

根據(jù)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，外周血中的Tfr細(xì)胞比例RA組為(0.77±0.07)%，健康對(duì)照組為(1.27±1.66)%，RA組與健康對(duì)照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-15.139，P<0.05，見(jiàn)圖1)。

(a)：兩組外周血Tfr細(xì)胞比例流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；(b)：兩組外周血Tfr細(xì)胞比例的半定量分析，與健康對(duì)照組相比較，P<0.05

2.2 RA組高度活動(dòng)組與輕中度活動(dòng)組Tfr細(xì)胞比例比較

RA組中，Tfr細(xì)胞比例高度活動(dòng)度組為(0.74±0.44)%，輕中度活動(dòng)組為(0.81±0.74)%，高度活動(dòng)度組低于輕中度活動(dòng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.523，P<0.05)。

2.3 RA患者外周血Tfr細(xì)胞比例與血清免疫球蛋白水平的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，RA患者外周血Tfr細(xì)胞比例與血清IgM，IgG，IgA水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.4876，r=-0.3961，r=-0.4053，見(jiàn)圖2)。

(a)：Tfr細(xì)胞比例與血清IgM水平相關(guān)性；(b)：Tfr細(xì)胞比例與血清IgG水平相關(guān)性；(c)：Tfr細(xì)胞比例與血清IgA水平相關(guān)性

3 討 論

RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程遷延不愈，以關(guān)節(jié)、滑膜的慢性炎癥為主要特征，發(fā)生軟骨和骨的損害，而且還伴隨全身多系統(tǒng)癥狀，包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者外周血Tfr細(xì)胞比例相比于健康對(duì)照組顯著下降；在RA組中，高度活動(dòng)組Tfr細(xì)胞比例低于輕中度活動(dòng)組，且外周血Tfr細(xì)胞比例與血清免疫球蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明Tfr細(xì)胞數(shù)量減少在RA大量自身抗體的產(chǎn)生及疾病的發(fā)展中起到了重要作用。自身抗體是多種自身免疫性疾病的病理產(chǎn)物和血清學(xué)標(biāo)志物。自身抗體的產(chǎn)生可導(dǎo)致免疫復(fù)合物在各臟器中沉積，激活補(bǔ)體系統(tǒng)和其他免疫細(xì)胞進(jìn)而引起全身不可控的自身免疫反應(yīng)，造成嚴(yán)重的組織損傷。此外，自身抗體還可以通過(guò)抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)直接損傷靶組織，自身抗體水平越高，疾病的癥狀往往越嚴(yán)重[13]。研究[14]表明，Tfr細(xì)胞的數(shù)量減少或功能障礙導(dǎo)致的過(guò)度Tfh細(xì)胞應(yīng)答和GC反應(yīng)會(huì)刺激自身抗體的產(chǎn)生。Tfh細(xì)胞和Tfr細(xì)胞均為CD4+T細(xì)胞亞群，二者關(guān)系密切，在表型上有許多類(lèi)似之處，均表達(dá)CXCR5、B細(xì)胞淋巴瘤因子-6(Bcl-6)、誘導(dǎo)性共刺激分子(ICOS)、程序性死亡蛋白-1(PD-1)。但是由于Tfr細(xì)胞起源于外周的自然調(diào)節(jié)性T(nTreg)細(xì)胞，所以其表型更接近于nTreg細(xì)胞。因此，Tfr細(xì)胞除表達(dá)上述的分子以外，還表達(dá)FOXP3、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(CTLA-4)等[15]。Tfh細(xì)胞可以分泌CXC趨化因子配體13(CXCL13)，其與B細(xì)胞表面及自身表達(dá)的受體CXCR5結(jié)合，招募B細(xì)胞和自身遷移至GC中，并通過(guò)其表面表達(dá)的多種信號(hào)分子促進(jìn)GC中B細(xì)胞的成熟、活化以及抗體的產(chǎn)生[16]。研究[17]表明，體液免疫中B細(xì)胞的數(shù)量和抗原親和力決定了其接受Tfh細(xì)胞輔助的能力，而自身反應(yīng)性B細(xì)胞可能會(huì)過(guò)多地獲得Tfh細(xì)胞輔助，逃脫免疫耐受，進(jìn)而導(dǎo)致自身抗體的產(chǎn)生。Tfr細(xì)胞則在GC反應(yīng)的負(fù)向調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，其通過(guò)抑制Tfh細(xì)胞和GC的B細(xì)胞來(lái)抑制體液免疫。Tfr發(fā)揮作用主要是通過(guò)抑制B細(xì)胞活化的下游效應(yīng)，包括免疫球蛋白類(lèi)別轉(zhuǎn)換(CSR)和體細(xì)胞高頻突變等[18-21]。Tfr發(fā)揮其效應(yīng)依賴(lài)多種途徑，例如，Tfr細(xì)胞可以通過(guò)其表面表達(dá)的抑制性分子CTLA-4與B細(xì)胞以及Tfh細(xì)胞表面的受體結(jié)合，直接抑制B細(xì)胞和Tfh細(xì)胞的發(fā)育；此外，Tfr細(xì)胞還抑制白細(xì)胞介素-4(IL-4)的分泌，而IL-4則在GC反應(yīng)和抗體產(chǎn)生的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。另有，Tfr細(xì)胞還可通過(guò)分泌抑制性的細(xì)胞因子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等抑制GC反應(yīng)和抗體的產(chǎn)生[22-23]。因此，Tfr細(xì)胞的數(shù)量減少很可能引起體液免疫功能紊亂，導(dǎo)致大量自身抗體的產(chǎn)生，是RA重要的發(fā)病基礎(chǔ)[24-25]，并且可能與疾病的活動(dòng)度有關(guān)。

綜上所述，Tfr細(xì)胞數(shù)量減少，可能是引起RA大量自身抗體產(chǎn)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素，并且與疾病的發(fā)展有關(guān)。其機(jī)制可能是Tfr細(xì)胞通過(guò)抑制Tfh細(xì)胞和GC中B細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)體液免疫功能的作用。但其發(fā)揮作用的信號(hào)通路和具體分子機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究證實(shí)，以期具體闡明Tfr細(xì)胞在RA中的作用。