基于細(xì)胞純化和芯片技術(shù)的結(jié)腸癌化療耐藥分子分型建立和臨床驗(yàn)證

郭志平， 折 桐， 王曉峰， 花曉燕， 馬 碩， 于 東， 吳澤華， 姜 韜

（1.寧夏中衛(wèi)市人民醫(yī)院腫瘤科，中衛(wèi) 755000； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院結(jié)直腸外科，銀川 750004；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，青島 266000）

結(jié)腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)發(fā)病率居惡性腫瘤第三位，死亡率居第二位[1]。結(jié)腸癌化療耐藥新型治療靶標(biāo)篩選鑒定是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一[2]。對(duì)于Ⅲ期和具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素的Ⅱ期患者需追加術(shù)后輔助化療，以減少腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[3]。作為一種遺傳異質(zhì)性疾病，并非所有患者都能從以氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的輔助化療中受益，約30%的患者最終會(huì)發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[4-5]。積極篩選及鑒定新型結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)基因，對(duì)于進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌化療耐藥的分子機(jī)制及改善預(yù)后具有重要的意義。

microRNA（miRNA）是長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的小RNA，在細(xì)胞分化及疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用。miRNA 調(diào)控人類約三分之一的基因，在腫瘤研究中可作為生物學(xué)標(biāo)志物及藥靶，給人類疾病治療提供新的手段[6]。本文建立基于激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）-Agilent miRNA 芯片技術(shù)的結(jié)腸癌化療耐藥基因表達(dá)譜，篩選結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)基因，結(jié)合患者臨床病理指標(biāo)、治療效果和預(yù)后信息進(jìn)行分析，最終形成結(jié)腸癌化療耐藥分子分型體系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本文所選的10 例Ⅲ期結(jié)腸癌患者均于我科行腹腔鏡輔助根治性（或擴(kuò)大）右半結(jié)腸癌根治術(shù)，手術(shù)遵循全結(jié)腸系膜切除（complete mesocolic excision，CME）的基本原則，術(shù)后病理淋巴結(jié)數(shù)目均大于12 枚。術(shù)后免疫組化分型均為MSI-L，遵循NCCN 指南方案，予以追加mFOLFOX6 方案（術(shù)后3 周開始，總療程6 個(gè)月）輔助化療。對(duì)隨診過程中發(fā)生復(fù)發(fā)/未復(fù)發(fā)（5∶5）的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行LCM，細(xì)胞純化后運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)兩種細(xì)胞中的基因表達(dá)情況，根據(jù)差異表達(dá)倍數(shù)和功能預(yù)測(cè)篩選結(jié)腸癌化療相關(guān)靶標(biāo)基因。

1.2 LCM

1）將上述結(jié)腸癌組織蠟塊行病理切片，切片厚度為7～8 μm。2）將切片于56 ℃烘烤過夜，二甲苯及梯度乙醇（95%，75%）脫蠟脫水，RNasefree 水2 min，蘇木素（Dako Mayer’s）染色30 s，RNase-free 水2 min，梯度乙醇（75%，95%，100%）脫水，二甲苯透明5 min，待二甲苯揮發(fā)完全后，啟動(dòng)Veritas，輕壓Tension lever，置入玻片，置入收集蓋，放置Unload Station，加載樣品窗口后捕獲切割腫瘤細(xì)胞。3）激光顯微切割完成后，在0.5 mL Eppendorf 管內(nèi)加入miRNA 抽提試劑盒里的第一步試劑，再將捕獲細(xì)胞后的Cap 置于EP管上，蓋緊，倒置，按試劑盒說明書行miRNA 抽提實(shí)驗(yàn)。

1.3 Agilent miRNA 芯片實(shí)驗(yàn)

1.3.1 RNA 抽提和純化 采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，美國(guó)），按照生產(chǎn)廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行樣品的total RNA 抽提，抽提所得經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，Santa，CA，美國(guó)）電泳質(zhì)檢合格后備用。RNA 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：2100 RIN≥6.0 并且28S/18S≥0.7。

1.3.2 樣品RNA 標(biāo)記 樣品RNA 采用Agilent miRNA 芯片配套的試劑盒：miRNA Complete Labeling and Hyb Kit（Agilent Technologies，CA，美國(guó)），按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)miRNA 分子進(jìn)行熒光標(biāo)記。1.3.3 芯片雜交及掃描 芯片為Agilent human miRNA（8×60K）V19.0 芯片。結(jié)果采用Agilent Microarray Scanner（Agilent Technologies，CA，美國(guó)）進(jìn)行掃描。均委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 qRT-PCR 檢測(cè)

應(yīng)用RNA 提取試劑盒（QIAGEN，上海，中國(guó)）提取總RNA 并行濃度純度的檢測(cè)。合格樣品使用PrimerScriptTMRT Master Mix（Takara，日本）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用SYBR ? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒（Takara，日本）進(jìn)行qRTPCR 反應(yīng)。引物序列如下：miR-194-3p，上游，5＇-CGTCGCCGCCGTACACGGACCTGCGA-3＇，下游，5＇ -TTGCATGCTGATCATGCGCTTAGCTAGA -3＇。GAPDH，上游，5＇-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3＇，下游，5＇-GGCATGGACTGTGGTCATAG-3＇。

2 結(jié)果

2.1 LCM 行細(xì)胞純化

LCM 分離出5 例Ⅲ期結(jié)腸癌化療后復(fù)發(fā)以及5 例未復(fù)發(fā)的腫瘤實(shí)質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞純化后運(yùn)用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)兩種細(xì)胞中的基因表達(dá)情況，根據(jù)差異表達(dá)倍數(shù)和功能預(yù)測(cè)篩選結(jié)腸癌化療相關(guān)靶標(biāo)miRNA，見圖1。

圖1 LCM 行腫瘤細(xì)胞純化（蘇木素染色×20）

2.2 Agilent miRNA 芯片篩選結(jié)腸癌化療耐藥靶標(biāo)

建立基于LCM-Agilent miRNA 芯片技術(shù)的結(jié)腸癌化療耐藥miRNA 表達(dá)譜，篩選結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)。結(jié)果顯示，包括miR-194-3p，miR-3607，miR-887，miR-424-5p，miR-1237 等16 個(gè)miRNA 為差異基因，是潛在靶標(biāo)，Agilent 單熒光芯片組間t 檢驗(yàn)分析得到P 值與Fold Change值兩個(gè)因素共同繪制火山圖，顯示兩組樣品差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 火山圖

2.3 miR-194-3p 的臨床樣本驗(yàn)證

根據(jù)芯片結(jié)果，選擇差異性最顯著的miR-194-3p 行臨床樣本驗(yàn)證。通過檢測(cè)miR-194-3p在60 例Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌化療后復(fù)發(fā)/未復(fù)發(fā)樣本中的表達(dá)。qRT-PCR 結(jié)果顯示，相對(duì)于結(jié)腸癌化療后未復(fù)發(fā)病例，miR-194-3p 在結(jié)腸癌化療后復(fù)發(fā)樣本中高表達(dá)（P<0.001），見圖3。

圖3 miR-194-3p 在Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌復(fù)發(fā)/未復(fù)發(fā)樣本的表達(dá)

3 討論

我國(guó)為結(jié)腸癌高發(fā)的國(guó)家，男性發(fā)病率高于女性，隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的生命和健康[7]。針對(duì)Ⅲ期結(jié)腸癌患者，化療耐藥會(huì)導(dǎo)致約30%的患者最終發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[8]。所以篩選有效的、特異性的結(jié)腸癌化療相關(guān)靶標(biāo)基因可以為臨床指導(dǎo)用藥提供有價(jià)值的信息。例如，臨床檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)情況可用于指導(dǎo)結(jié)腸癌Ⅱ期（T3N0M0 和T4N0M0）患者的化療[9]；結(jié)腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失會(huì)導(dǎo)致遺傳水平的高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定，相比較微衛(wèi)星穩(wěn)定的患者具備更好的預(yù)后，但是高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定的患者對(duì)以5-氟尿嘧啶為主的化療方式不敏感，F(xiàn)OLFOX 方案化療不受益[10-11]。因此，積極地篩選及鑒定新型結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)基因，對(duì)于進(jìn)一步闡明結(jié)腸癌化療耐藥的分子機(jī)制以及臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用于改善預(yù)后等具有重要意義。

LCM 是一項(xiàng)在顯微鏡下從組織切片中分離、純化單一類型細(xì)胞群或單個(gè)細(xì)胞的技術(shù)，它成功地解決了組織中的細(xì)胞異質(zhì)性問題，是分子病理學(xué)和腫瘤基因組學(xué)研究的一項(xiàng)革命性技術(shù)[12]。本文應(yīng)用該技術(shù)，針對(duì)Ⅲ期結(jié)腸癌化療后復(fù)發(fā)及無復(fù)發(fā)病例，行腫瘤細(xì)胞純化。進(jìn)一步運(yùn)用Agilent基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)兩種細(xì)胞中的miRNA 表達(dá)情況，生物信息學(xué)分析，根據(jù)Fold Change 值和功能預(yù)測(cè)篩選結(jié)腸癌化療相關(guān)靶標(biāo)。結(jié)果顯示，包括miR-194-3p，miR-3607，miR-887，miR-424-5p，miR-1237 等16 個(gè)miRNA 為差異基因，可作為潛在結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)一步研究。選擇miR-194-3p 進(jìn)行臨床樣本驗(yàn)證，對(duì)比無復(fù)發(fā)病例，miR-194-3p 在60 例Ⅱ/Ⅲ期結(jié)腸癌化療后復(fù)發(fā)的樣本中顯著高表達(dá)，與芯片結(jié)果一致，其具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文建立了基于LCM-Agilent miRNA 芯片技術(shù)的結(jié)腸癌化療耐藥基因表達(dá)譜，篩選了結(jié)腸癌化療耐藥相關(guān)靶標(biāo)基因，并初步進(jìn)行了miR-194-3p 的臨床樣本驗(yàn)證。后續(xù)需結(jié)合患者臨床病理指標(biāo)、治療效果和預(yù)后信息進(jìn)行分析，形成結(jié)腸癌化療耐藥分子分型體系。