基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃芩治療慢性乙型病毒性肝炎的作用機(jī)制

胡 泊， 孟祥云， 丁瑞潔， 李明芳， 段賢春

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬合肥市第二人民醫(yī)院，合肥 230001； 2. 合肥市蜀山區(qū)小廟鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院，合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，合肥 230031）

慢性乙型病毒性肝炎（CHB）是我國常見傳染性疾病，一般以惡心、乏力、肝功能異常等臨床表現(xiàn)為主。該病治療周期長，若治療不當(dāng)最終可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。2014 年我國1～27 歲乙肝病毒易感染人群流行病學(xué)調(diào)查顯示，國內(nèi)該年齡段乙肝病毒易感人群構(gòu)成比約35%，其中5～14歲年齡段有乙肝病毒疫苗史者的構(gòu)成比較2006年提高了約8%[1]，這得益于我國長期以來對該病實施預(yù)防為主、防治結(jié)合的應(yīng)對策略[2]。目前我國CHB 患者約有7 000 萬例[3]。西醫(yī)治療CHB 以抗病毒為主，通常使用干擾素或核苷類藥物，但存在藥物治療效果差、不良反應(yīng)大、容易產(chǎn)生耐藥性等缺點[4-5]。中醫(yī)認(rèn)為該病病因病機(jī)主要是疫毒、濕熱、正虛、肝郁，故應(yīng)該采取疏肝理氣、清化濕熱的治療方法[6]。

中藥黃芩為唇形科多年生草本植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要產(chǎn)自我國黑龍江，遼寧等地區(qū)[7]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中稱黃芩“味苦、性寒、主治諸熱黃疸”，《雷公藥性賦》中稱其“治諸熱、兼主五淋”。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為黃芩對多種疾病均具有明顯治療效果，但因治療疾病的藥物活性成分和作用機(jī)制不明確，在一定程度上限制了該藥的應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，是研究多靶點干預(yù)疾病網(wǎng)絡(luò)以達(dá)到理想藥物治療效果的理論[8]?；驹硎峭ㄟ^藥代動力學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫和分析平臺，采用現(xiàn)在計算機(jī)分析技術(shù)構(gòu)建“藥物成分-疾病-基因”關(guān)系網(wǎng)，明確藥物所含有的多種成分是通過哪種手段和途徑對疾病產(chǎn)生了治療作用，最終為臨床降低藥物不良反應(yīng)以及新藥研發(fā)等提供參考意見。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討黃芩治療CHB 的活性成分及其可能的作用機(jī)制，以期為深入研究和提高臨床用藥價值提供線索。

1 研究方法

1.1 篩選藥物活性成分

對藥物而言，人體內(nèi)吸收、分布、代謝及排泄是四個最重要的藥物代動力學(xué)過程。中藥的入血成分是中藥有效成分的體現(xiàn)[9]。本課題組選擇能夠評價藥物口服吸收入血速度、程度的生物利用度（OB）和能夠體現(xiàn)化合物、已知藥物相似度的類藥性（DL）這兩個指標(biāo)，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）對黃芩中活性成分進(jìn)行篩選。具體要求為生物利用度（OB）＞30%，類藥性（DL）＞0.18[10]。

1.2 篩選藥物和疾病的共有靶基因

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫[11]收集黃芩活性成分靶點，用Uniport 數(shù)據(jù)庫（http://associazione-uniport.org/）對其靶基因進(jìn)行標(biāo)注。通過Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和Omim 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）收集人CHB 靶基因，將二者比較后提取相同靶基因。

1.3 構(gòu)建“藥物成分-疾病-靶點”關(guān)系圖

將收集到藥物活性成分及共有靶基因等信息輸入可圖形化分析軟件Cytoscape 3.6.1[12]中建立“藥物成分-疾病-靶點”關(guān)系圖。

1.4 繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

在String 11.0[13]數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）中，以人類（Homo Sapiens）為背景，將收集到的藥物-疾病共有靶基因信息輸入其中，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。PPI 中的節(jié)點（Node）代表基因或者蛋白，節(jié)點之間的相互作用以邊（Edge）來體現(xiàn)，與某單個節(jié)點相互作用的節(jié)點總數(shù)稱為度（Degree）。

1.5 GO 富集分析和KEGG 富集分析

為了研究藥物活性成分在治療疾病時參與的生物學(xué)過程和作用通路，本課題組把該藥物-疾病共有靶基因ID 列表輸入到程序（版本號3.6.2）中使用Bioconductor 平臺（https://www.bioconductor.org/）提供的生物信息分析程序包，以P<0.05和Q<0.05 為條件進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，并將分析結(jié)果進(jìn)行圖文展示。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分篩選結(jié)果

按照OB＞30%及DL＞0.18 的篩選標(biāo)準(zhǔn)，從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共篩選出黃芩活性成分36 種，后期又發(fā)現(xiàn)有4 種化合物靶點與目標(biāo)疾病相關(guān)基因無交集，故最終確定32 種活性化合物，見表1。

表1 黃芩活性成分

2.2 藥物-疾病共有靶基因預(yù)測

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中得到了黃芩有效成分的靶點96 個，用Uniport 數(shù)據(jù)庫對這96 個靶點進(jìn)行相應(yīng)靶基因的標(biāo)注。通過Genecards 和Omim數(shù)據(jù)庫以“chronic viral hepatitis B”為關(guān)鍵詞共得到人類CHB 相關(guān)基因6 388 個。將二者取交集最終得到黃芩和CHB 共有靶基因NOS2、PTGS1 等共計85 個。

2.3 “藥物成分-疾病-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.6.1 程序建立黃芩-CHB 的“藥物成分-疾病-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），并使用程序自帶的“NetworkAnalyzer”工具對其進(jìn)行分析。分析結(jié)果中包含各網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的度值（Degree）。度值的大小反映了該節(jié)點在“藥物成分-疾病-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖中的重要程度。度值越大，說明越可能是黃芩治療CHB 中的重要靶基因或活性分子。度值排名前10 的基因和藥物活性分子見表2。

表2 排名前10 位的基因及活性成分的度值

圖1 “藥物成分-疾病-靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）的構(gòu)建

以人類為背景，設(shè)最低蛋白互作值＞0.9 為前提條件，將前述收集到的藥物-疾病共同靶基因信息輸入String 11.0 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的繪制（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有節(jié)點85 個，邊302條，平均節(jié)點度為7.11。以每個節(jié)點的鄰接節(jié)點數(shù)目為橫坐標(biāo)，選取鄰接節(jié)點數(shù)排名前20 的節(jié)點繪制條形圖（圖3）。這20 個節(jié)點所代表的靶基因有可能是參與黃芩治療CHB 的關(guān)鍵基因，大部分都與機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)。

圖2 黃芩-慢性乙型病毒性肝炎的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 關(guān)鍵基因的柱狀圖

2.5 GO 功能富集分析結(jié)果

使用R 語言程序?qū)S芩和CHB 的共有靶基因進(jìn)行GO 富集分析，并將結(jié)果可視化（圖4）。GO富集分析得到132 種基因功能。按Q-Value 對這些功能進(jìn)行從小到大排列，排名前5 位的生物學(xué)功能依次為細(xì)胞核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合、類固醇激素受體活性與RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以及與血色素結(jié)合。GO 富集分析結(jié)果提示黃芩通過多種生物學(xué)功能協(xié)同作用對CHB 產(chǎn)生出治療效果。

圖4 黃芩-慢性乙型病毒性肝炎的GO 富集分析結(jié)果

2.6 KEGG 通路富集分析結(jié)果

在P<0.05，Q<0.05 的前提下，得到了124 條KEGG 通路并可視化（圖5）。對這些通路按照Q從小到大排列，排名前5 位的通路分別是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎、人巨細(xì)胞病毒感染以及IL-17 信號通路。上述通路可能是黃芩對CHB 發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵通路。

圖5 黃芩-慢性乙型病毒性肝炎的KEGG 富集分析結(jié)果圖

3 討論

有研究[14]證實CHB 的肝細(xì)胞傷害并不完全在于乙肝病毒的直接作用，機(jī)體對乙肝病毒的免疫應(yīng)答是其中一個重要因素。通過分析，本課題組發(fā)現(xiàn)黃芩所含有的漢黃芩素（Wogonin）、黃芩素（Baicalein）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）等藥物活性分子是黃芩治療慢性乙型病毒性肝炎的關(guān)鍵成分。丙二醛是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其細(xì)胞內(nèi)含量可間接反映細(xì)胞損傷的程度。國內(nèi)外研究[15-16]發(fā)現(xiàn)CHB 患者體內(nèi)的丙二醛水平明顯高于正常人。豆甾醇能夠降低CHB 患者體內(nèi)的丙二醛水平[17]，有利于保護(hù)受損的肝細(xì)胞。β-谷甾醇在抑制脂質(zhì)過氧化的同時可降低血清總膽固醇和低密度脂蛋白的水平[18]，同樣能起到保護(hù)受損肝細(xì)胞的作用。

黃芩素和漢黃芩素都是黃芩中重要的黃酮類成分。有研究[19]表明這兩種物質(zhì)均能抑制對恩替卡韋耐藥的乙肝病毒的DNA、HBsAg 及cccD NA，二者聯(lián)用則效果更佳[20]。黃芩素在動物體內(nèi)可迅速轉(zhuǎn)化為黃芩苷及其他代謝物[21]。黃芩苷因具有酚羥基結(jié)構(gòu)，不僅能夠抑制體內(nèi)自由基脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，還可以減少乙肝病毒的復(fù)制和傳播[22]。目前國內(nèi)已經(jīng)出現(xiàn)采用黃芩苷為主要成分的中藥制品用于急慢性肝炎的輔助治療，如黃芩苷膠囊、茵梔黃顆粒等。2018 年版慢性乙型肝炎中醫(yī)診療指南還將茵梔黃顆粒作為濕熱蘊(yùn)結(jié)型慢性乙型肝炎治療推薦用藥[23]。黃新造等[24]發(fā)現(xiàn)肝蘇膠囊治療HBV 時聯(lián)用黃芩苷膠囊可以降低患者的HBV-DNA 水平，減輕肝臟纖維化的程度，效果優(yōu)于單一用藥。劉仁偉等[25]使用胸腺法新聯(lián)合黃芩苷膠囊治療HBV 亦得到與之相似的治療效果。漢黃芩素的活性代謝產(chǎn)物漢黃芩素苷（Wogonoside）對CHB 病毒也具有較強(qiáng)的抑制作用[26]。

本研究中“藥物成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖以及PPI 網(wǎng)絡(luò)圖均顯示PTGS2、AKT1 和SCN5A 等靶點參與了黃芩治療CHB 的過程。絲氨酸/蘇氨酸激酶B（AKT）是糖代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，由AKT1、AKT2 和AKT3 三個亞基組成，可間接調(diào)控核苷酸合成的重要原料5-磷酸核糖的生成。實驗證實AKT 的活性與乙肝病毒DNA 在肝細(xì)胞中的載量呈正相關(guān)[27]，提示使用AKT 抑制劑可減少病毒的復(fù)制和傳播?；ㄉ南┧幔ˋA）代謝途徑可產(chǎn)生多種物質(zhì)誘導(dǎo)炎癥因子的生成和釋放。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）是AA 代謝途徑中AA 轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，因此抑制PTGS2的活性有助于減輕炎癥因子對肝細(xì)胞的破壞。此外PTGS1、RELA、IL-6 等因子也是機(jī)體炎癥反應(yīng)中的重要參與者。黃芩對AA 代謝途徑多個環(huán)節(jié)具有明顯抑制作用[28]。維持機(jī)體抑炎因子和致炎因子的平衡可能是黃芩減少肝細(xì)胞損傷的重要手段。

GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示了黃芩的多種途徑治療CHB 的特點，IL-17 通路是其中之一。有實驗[29]證實IL-17 可通過輔助性T 細(xì)胞17（TH17）分泌。它作為促炎因子之一，參與了CHB的炎癥過程。在慢性肝病發(fā)展的過程中，IL-17 的血清水平與肝臟的損傷程度呈正相關(guān)[30]，降低血清IL-17 水平亦能夠起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用[31]。

綜上所述，黃芩對CHB 的治療作用體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多途徑綜合治療疾病的特點，這些成分和靶點的發(fā)現(xiàn)為下一步通過體內(nèi)外實驗論證本文的研究成果提供了有力的理論和數(shù)據(jù)支持。