性早熟女童腸道菌群和抗生素耐藥性的宏基因組分析

許 飛，尹明月，王 偉，董治亞，陸文麗，余 熠，王歆瓊，王俊祺，肖 園

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院兒科，上海 200025；2.上海市普陀區(qū)利群醫(yī)院兒科，上海 200333）

性早熟是指男孩在9 歲前、女孩在8 歲前呈現(xiàn)第二性征，是最常見的青春發(fā)育異常，而女孩發(fā)病率為男孩的5～10 倍。中樞性性早熟 (central precocious puberty，CPP) 是由于下丘腦-垂體-性腺軸過早激活引起的；而單純性乳房早發(fā)育(premature thelarche，PT)則是一種不完全性性早熟，表現(xiàn)為女孩8 歲前出現(xiàn)的乳房發(fā)育，但無其他第二性征發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，全球女孩乳房發(fā)育的年齡每10 年就下降約0.24 歲，亞洲更加顯著[1]，CPP 的發(fā)病率為0.01%～0.02%，PT 的發(fā)病率為1%～4.7%，且呈逐年上升趨勢。遺傳、營養(yǎng)、環(huán)境和社會經(jīng)濟等一系列因素都對青春發(fā)育時間有著重要影響。既往研究提示，腸道菌群在肥胖的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用[2]。同時，肥胖人群具有一定程度的菌群失調(diào)[3]，而性早熟與兒童肥胖間也存在一定的相關(guān)性[4]。因此推測，在兒童性早熟和腸道菌群之間可能存在著一定的聯(lián)系。

抗生素在醫(yī)療事業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的大量使用及其在生物體內(nèi)的不完全代謝，使其在環(huán)境中殘留，還可能誘導(dǎo)形成抗生素耐藥菌和耐藥基因[5]。我國是抗生素生產(chǎn)和使用的大國，也是耐藥基因擴散的熱區(qū)，而耐藥基因是一種新型污染物[6]。研究表明,兒童時期的 抗生素暴露與其肥胖發(fā)生風(fēng)險呈正相關(guān)，在停用抗生素后，腸道菌群雖然可以逐漸恢復(fù)，但抗生素暴露對代謝的影響依然存在[7]。兒童肥胖與畜禽用抗生素暴露之間存在明顯聯(lián)系，對兒童生長、發(fā)育有著潛在的危害[8]。有關(guān)性早熟患兒抗生素暴露的風(fēng)險目前國內(nèi)外尚無報道。

宏基因組測序技術(shù)是指提取全部微生物基因組的總和而進行檢測。相較于傳統(tǒng)的16S rRNA 測序方法，該方法不僅可以獲得腸道菌群的組成，同時也能獲得功能基因的組成，可了解腸道菌群中以前未知或未培養(yǎng)出的重要微生物。本研究納入女性CPP 及PT 患兒，并設(shè)置年齡匹配的健康對照(normal control，NC)，以糞便為研究樣本，利用鳥槍法宏基因組測序技術(shù)對CPP 組、PT 組及NC 組3 組女童的腸道菌群進行特征性分析，旨在分析性早熟及健康女童腸道菌群和耐藥基因的特征，為探索抗性基因?qū)和L、發(fā)育的影響提供參考。

資料與方法

一、資料

本研究于2020 年6 月至2021 年1 月在我院就診的女童中進行篩選，納入并留取糞便樣本共40 例。由兒童內(nèi)分泌?？漆t(yī)師收集研究對象的病史、體格檢查、實驗室及影像學(xué)檢查等相關(guān)信息。參照2015 年《中樞性性早熟診斷與治療共識》排除病理性性早熟5 例(MRI 異常2 例，甲狀腺功能異常2 例，McCune-Albright 綜合征1 例)，小于6 歲3 例，陰道異物1 例，最終共31 例采用宏基因組測序，其中去除樣本雜質(zhì)建庫失敗的2 例。最終本研究納入21 例，性早熟女童平均年齡為(7.6±0.9)歲，其中CPP 患兒11 例，PT 患兒10 例，同時納入8 名年齡匹配[平均年齡為(7.2±0.5)歲]的健康女童。

本研究經(jīng)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理審查委員會批準，研究之前已獲得所有受試者及其監(jiān)護人知情同意。

二、方法

1.糞便樣本收集：受試者于家中或醫(yī)院采集糞便樣本。收集管收集糞便樣本10 g，平均分為2 份，1 份用于驗證實驗。標(biāo)本在收集后15 min 內(nèi)于-20 ℃保存，收集24 h 內(nèi)用干冰轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中儲藏。

2.DNA 樣品檢測及建庫：采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 的純度和完整性，Qubit 對DNA 濃度進行精確定量。檢測合格的DNA 樣品用Covaris 超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp 的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個文庫制備。

3.宏基因組測序：所有糞便樣本均送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行宏基因組測序，庫檢合格后使用Illumina Novaseq6000 高通量測序儀進行測序。

4.統(tǒng)計學(xué)分析和生物信息學(xué)分析：采用R 軟件(version 4.0.5)進行統(tǒng)計學(xué)分析。涉及的數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準差來表示，采用ANOVA檢驗分析；非正態(tài)分布使用中間數(shù)和四分位數(shù)表示，采用Kruskal Wallis 秩和檢驗。菌群測序數(shù)據(jù)使用NCBI 數(shù)據(jù)庫進行注解，統(tǒng)計每個樣本中的腸道菌群在門、綱、目、科、屬、種6 個分類水平的組成。使用主成分分析 (principal component analysis，PCA)和無度量多維標(biāo)定法 (non-metric multidimensional scaling，NMDS) 分析各樣本間物種組成，根據(jù)Anosim 分析計算P 值；利用Metastats 方法校正P值，根據(jù)Q 值篩選差異性物種[9]。所有統(tǒng)計均為雙尾檢驗，P<0.05 提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

5.抗性基因注釋：通過耐藥基因數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD)對耐藥基因進行鑒定挖掘，其核心是抗生素耐藥性本體 (antibiotic resistance ontology，ARO)，ARO 包含了與耐藥基因及其抗性機制等。該數(shù)據(jù)庫收集有關(guān)抗生素抗性基因、蛋白質(zhì)和表型的參考信息，提供了與抗生素耐藥性的分子基礎(chǔ)有關(guān)的數(shù)據(jù)、模型和算法[10]。本研究采用DIAMOND 軟件，將非冗余蛋白序列與該數(shù)據(jù)庫比對，獲得基因?qū)?yīng)的抗生素抗性功能注釋信息，根據(jù)功能對應(yīng)的基因豐度總和計算耐藥基因的豐度[11]。

結(jié) 果

一、CPP 組、PT 組以及NC 組的基線數(shù)據(jù)特征

所有研究對象的基線資料見表1，CPP 組、PT組及NC 組間的體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.687)。

表1 CPP 組、PT 組以及NC 組基線數(shù)據(jù)特征

二、CPP 組、PT 組以及NC 組相關(guān)腸道菌群組成分析

在所有糞便樣本中共檢測到89 個門、78 個綱、153 個目、345 個科、1 133 個屬、5 004 種微生物，其中占主導(dǎo)地位的門主要包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)及放線菌門(Actinobacteria)等。CPP 組、PT 組以及NC 組間具有顯著差異的門主要為厚壁菌門、擬桿菌門及變形菌門(Proteobacteria)。

1.門水平：基于不同物種豐度表對各組進行了PCA 和NMDS 分析，其物種組成越相似，則它們在PCA 和NMDS 圖中的距離則越接近。在門水平行兩兩組間比較，CPP 組與NC 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)，PT 組與NC 組間的差異更顯著 (P=0.003)，但CPP 組與PT 組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.143)；在屬水平，依然是NC 組與CPP 組、PT 組間分別存在差異(P 值分別為0.007 和0.001)，而CPP組與PT 組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.314)(見圖1)?？傊栽缡炫c道菌群在門分類水平的組成及豐度上，與健康女童均存在差異。

圖1 3 組菌群基于門水平的PCA（A）和NMDS 結(jié)果（B）及屬水平（C）的PCA 和NMDS（D）結(jié)果

在門分類學(xué)水平上，盡管3 組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門，但不同組別豐度存在明顯差異。NC 組，厚壁菌門和放線菌門的豐度明顯高于CPP 組及PT 組 (CPP 組、PT 組及NC 組的厚壁菌門豐度分別50.03%、37.73%及67.61%，而放線菌門豐度分別為4.26%、4.22%及11.16%)，而擬桿菌門的豐度低于CPP 組和PT 組 (分別為33.00%、43.26%及10.32%)。由此可見，較健康女童，性早熟女童擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門及放線菌門豐度降低(見圖2)。

圖2 3 組菌群在門（P）分類學(xué)水平上的相對豐度

2.屬水平：在屬分類學(xué)水平上，3 組的優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌屬(Bacteroides)，但性早熟女童較健康女童的擬桿菌屬豐度升高，其中PT 組最高(29.93%)，CPP 組次之(24.29%)，NC 組最低(7.33%)，差異統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.005)。NC 組放線菌屬的豐度明顯低于性早熟(CPP+PT)組。此外，糞桿菌屬(Faecalibacterium)豐度在CPP 組最高(8.20%)，NC 組次之(7.04%)，PT 組最低(6.39%)；雙歧桿菌屬(Bifidobacterium) 在3 組間的豐度差異則無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.452)(見圖3)。

圖3 3 組菌群在屬（G）分類學(xué)水平上的相對豐度比較

3.種水平：在種分類學(xué)水平上，3 組的優(yōu)勢菌種均為普氏糞桿菌種(Faecalibacteriumprausnitzii)，其豐度分別為5.41%、4.33%及4.75%，同糞桿菌屬一樣，CPP 組豐度高于PT 組及NC 組。進一步進行Metastat 分析，對3 組腸道菌群的物種豐度進行假設(shè)檢驗得到P 值，對P 值進行校正得到Q 值，根據(jù)Q 值篩選3 組間的差異性物種。在種水平上，組間差異顯著的前6 位分別為脆弱擬桿菌種(Bacteroides fragilis)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatu)、沙氏擬桿菌種(Bacteroides sartori)，單形擬桿菌(Bacteroides uniform)、普通擬桿菌種(Bacteroides vulgatus)及木糖降解擬桿菌(Bacteroides xylanisolvens)，其均屬于擬桿菌屬。其中，脆弱擬桿菌種、卵形擬桿菌、沙氏擬桿菌種在PT 組與NC 組間的差異顯著(Q<0.05)，普通擬桿菌種在CPP 組與NC 組間的物種差異顯著(Q<0.05)，單形擬桿菌種及木糖降解擬桿菌種在CPP 組與NC 組、PT 組與NC 組間的差異均顯著(Q<0.05)(見圖4)。

圖4 3 組間在種水平有顯著差異的物種

4.豐度：CPP 組、PT 組、NC 組間的物種豐度聚類分析顯示，在門水平上，CPP 組的互養(yǎng)菌門(Synergistetes)及綠膿桿菌門(Chlorobideferribacteres)顯著富集，PT 組的Candidatusomnitrophica、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)及產(chǎn)水菌門(Aquificae)富集，NC組的放線菌門及Candidatusmelainabacteria 富集。在屬水平上，CPP 組，普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、羅斯菌屬(Roseburia)、霍爾德曼菌屬(Holdemanella)及巨球型菌屬(Megasphaera)富集；PT 組，顫螺旋菌屬(Oscillibacter)及普雷沃菌屬(Prevotella)顯著富集；NC 組，糞球菌屬(Coprococcus)及丁酸球菌屬(Butyricicoccus)富集(見圖5)。

圖5 3 組間菌群的物種豐度聚類分析熱圖(前35 位)

三、CPP 組、PT 組以及NC 組耐藥基因分析

本研究在全部29 個糞便樣本中均發(fā)現(xiàn)了耐藥基因。與CARD 庫比對，共發(fā)現(xiàn)312 個抗性基因，其中性早熟女童所攜帶的共同耐藥基因為298 個，明顯多于健康對照組240 個。PT 組抗性基因及ARO數(shù)目最多，CPP 組次之，NC 組最少?？剐曰虻奈锓N歸屬圖可以看出，CPP 及NC 組中抗性基因含量最多的均為厚壁菌門，其占全部耐藥菌的百分比分別為29%及30%，PT 組抗性基因含量較多的主要為擬桿菌門(占全部耐藥菌百分比的43%)(見圖6)。

基于抗性基因的豐度進行Anosim 分析顯示，CPP 組、PT 組與NC 組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(R=0.1878，P=0.04)，PT 組與NC 組間差異更加顯著(R=0.2873，P=0.009)。CPP 組、PT 組及NC 組分別發(fā)現(xiàn)有257 種、273 種和240 種耐藥基因(見圖4)。3 組共發(fā)現(xiàn)特異性耐藥基因56 種，CPP 組中發(fā)現(xiàn)了16 種(主要為β-內(nèi)酰胺類CAU-1 和ACI-1 以及氨基糖苷類AAC3-Id)，PT 組中發(fā)現(xiàn)了26 種(主要為四環(huán)素類tetS、復(fù)合抗生素類ramA 及多肽類basS)，NC 組中發(fā)現(xiàn)了14 種 (主要為四環(huán)素類tetK、大環(huán)內(nèi)酯類Erm34 及OprM)(見圖7)。

圖7 3 組間耐藥基因種類數(shù)目韋恩圖

CPP 組與PT 組抗性基因豐度前3 位均為四環(huán)素類抗性基因(tetQ)、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因(ErmF)、喹諾酮類抗性基因(adeF)，但PT 組抗性基因豐度明顯高于CPP 組。NC 組中糖肽類耐藥基因(vanSC)未檢出，抗性基因主要集中在四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類(見圖8)。參考抗性基因的相對豐度表，用單因素方差分析對CPP 組、PT 組及NC 組的腸道菌群抗性基因差異性進行分析。CPP 組、PT 組及NC 組3 組中四環(huán)素類抗性基因tetQ 相對豐度分別為141.21、282.03 及37.10，大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因ErmF相對豐度分別為128.83、174.88 及51.13。性早熟女童的四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因豐度遠高于健康女童。

利用Metastats 方法篩選具有顯著差異的耐藥基因。CPP 組與NC 組相比，amrB、catB2、cat86、clbC、OXA_278、MuxB、OCH_7、FosA2、CepS、SMB_1具有顯著差異(Q 值均<0.05)；PT 組與NC 組相比，tetQ、vanSC、dfrF、CblA_1、vgbB、vanM、vanTC、mtrD、vanWI、Klebsiella_pneumoniae_acrA 組間差異極顯著(Q 值均<0.01)；CPP 組與PT 組相比，amrB、catB2、cat86、clbC、ramA、MIR_9、MIR_16、vanWI、dfrC、CepS具有顯著差異(Q 值均<0.05)。氨基糖苷類抗生素amrB，酚類抗生素catB2、cat86 及clbC 類抗性基因是可能是區(qū)別CPP 與PT 及健康女童的標(biāo)志性抗性基因。

討 論

一、性早熟兒童腸道菌群與健康兒童存在差異

本研究通過宏基因組測序分析發(fā)現(xiàn)，在門水平上，CPP 組及PT 組的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門和擬桿菌門，但CPP 組以厚壁菌門為主，PT 組以擬桿菌門為主，NC 組的優(yōu)勢菌門也為厚壁菌門，但3 組間組優(yōu)勢菌門在豐度上存在顯著差異：NC 組厚壁菌門和放線菌門的豐度明顯高于性早熟(CPP+PT)組。在屬分類學(xué)水平上，盡管3 組的優(yōu)勢菌屬均為擬桿菌屬，但豐度有顯著差異，性早熟患兒糞便中擬桿菌屬的豐度明顯高于正常女童。NC 組的放線菌屬豐度最低，而CPP 組的糞桿菌屬豐度最高。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在種水平上有6 種擬桿菌存在明顯的組間差異，分別是脆弱擬桿菌種、卵形擬桿菌種、沙氏擬桿菌種、單形擬桿菌種、普通擬桿菌種和木糖降解擬桿菌種。

既往研究發(fā)現(xiàn)，肥胖兒童與體重正常兒童相比，腸道中厚壁菌門豐度增加，擬桿菌門豐度降低，厚壁菌門/擬桿菌門比例升高[12]，同時多形擬桿菌有抑制肥胖的作用[13]。Dong 等[14]對CPP 女性患兒和健康女童的腸道菌群進行16S rDNA 測序發(fā)現(xiàn)，CPP組的腸道菌群與肥胖相關(guān)的腸道菌屬相似[14]。有趣的是，本研究結(jié)果顯示，性早熟女童較健康女童擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低，與Dong 等[14]的研究相反。這可能是由于本研究本樣本量較少，也可能由于本研究入組的對象BMI 不存在差異，今后需要擴大樣本量并納入不同BMI 水平的研究對象，需進一步驗證該結(jié)論。周莎莎等[15]采用16S rDNA 測序研究發(fā)現(xiàn)，CPP 組腸道內(nèi)的糞桿菌屬豐度顯著增高，與本研究的宏基因組分析結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，CPP 組與NC 組間的糞桿菌屬中普氏糞桿菌種存在明顯差異。糞桿菌屬的增多造成了L-色氨酸的降低，CPP 的發(fā)生與糞桿菌屬的紊亂影響色氨酸代謝通路有關(guān)[15]。性發(fā)育不同階段，腸道菌群具有的生物多樣性[16]，健康兒童和成年人擁有相似數(shù)量的分類群和功能基因，但其組成和功能潛能卻存在顯著差異。既往研究表明，兒童富集雙歧桿菌和糞桿菌，而成年人含有較豐富的擬桿菌[17]。本研究中性早熟女童較健康女童腸道內(nèi)有更高豐度的擬桿菌，這可能與性發(fā)育本身有關(guān)，需要進一步對菌群功能進行深入研究。美國學(xué)者通過動物實驗證實，哺乳期腸道菌群重建可以預(yù)防或治療胰島素抵抗相關(guān)性早熟[18]。而我國研究者比對了CPP、超重與健康女童間的腸道菌群，發(fā)現(xiàn)CPP 組腸道菌群的Alistipes、克雷伯菌等顯著上升，菌群間相關(guān)性增強，表明菌群合成的神經(jīng)遞質(zhì)可能在CPP 發(fā)病中有重要作用，提示靶向腸道菌群或能用于CPP治療[19]。由此可見，性早熟發(fā)病可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著變化有關(guān)，腸道菌群在性早熟的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要作用。

二、宏基因組測序技術(shù)檢測提示性早熟女童腸道菌群抗性基因富集

耐藥基因不僅廣泛存在于環(huán)境中，也存在于人體腸道系統(tǒng)中。宏基因組測序技術(shù)具有特異性高，靈敏度高，高通量的特點[20]，相較于傳統(tǒng)的微生物的培養(yǎng)和篩選過程，該方法可以檢測環(huán)境微生物的抗生素抗性組(antibiotic resistome)，即微生物中所有抗性基因的集合，包括不表達或低表達的抗性基因，以及具有較低抗性或與抗生素密切相關(guān)，有可能進化為抗性基因的耐藥基因前體[21]。有研究對11 國180 名成年受試者的糞便進行宏基因組檢測，發(fā)現(xiàn)健康成人腸道菌群的細菌群落結(jié)構(gòu)與耐藥基因譜圖顯著相關(guān)。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類耐藥基因是目前3 種最豐富的抗性基因類型[22-23]。中國人群腸道中抗性基因豐度最高，大環(huán)內(nèi)酯類ermF 可作為中國人腸道菌群中抗性基因的標(biāo)志。與成人不同的是，在本研究中健康女童腸道菌群抗性基因最豐富前3 位分別為四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及氨基糖苷類抗性基因，而性早熟女童與健康女童的抗性基因組成有著顯著差異，且更加富集于四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因。芬蘭的學(xué)者觀察了兒童的腸道菌群及抗生素使用情況，發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用與其耐藥性之間，在遺傳和表型水平上可能存在因果關(guān)系，會增加兒童肥胖風(fēng)險。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的使用使雙歧桿菌(Bifidobacteria)及克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)豐度降低，擬桿菌屬(Bacteroides)和丹毒絲菌屬(Erysipelotrichaceae)豐度升高。這些菌群被認為與兒童或成人的肥胖及代謝性疾病有關(guān)[24]，其四環(huán)素同時能夠促進脂肪堆積。

我國的學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于低劑量抗生素可能是兒童肥胖的一個風(fēng)險因素，接觸甲氧芐啶、氟苯尼考和畜禽類抗生素水平較高的受試者有較高肥胖風(fēng)險，這激勵研究者進一步探索抗性基因在肥胖和性早熟共同發(fā)生中的作用[8]。本研究在所有兒童糞便樣本中均發(fā)現(xiàn)了耐藥基因，同時還從兒童體內(nèi)檢測出臨床已經(jīng)停用多年和兒童慎用及禁用但在環(huán)境和食品中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的抗生素抗性基因，如喹諾酮類、四環(huán)素類。已有研究發(fā)現(xiàn)，新生兒糞便中已經(jīng)含有β-內(nèi)酰胺類和四環(huán)素類抗性基因[25]，從兒童、青少年到成人腸道內(nèi)抗性基因的多樣性隨年齡的增長而增加[26]，可見抗生素濫用不僅是臨床治療的問題，環(huán)境和食品也是兒童抗生素的重要暴露源，目前全球超過一半以上的抗生素用于畜禽養(yǎng)殖[27]，畜禽使用抗生素可能主要通過污染水及食物進入兒童體內(nèi)。

抗生素的使用是一把雙刃劍。研究表明，多種抗生素在亞治療劑量水平具有促生長作用，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和畜禽業(yè)[28-29]。在青春發(fā)育前，抗生素對兒童同樣有促生長作用[30]?？股刈鳛樯L促進劑的作用機制是通過其抗菌特性破壞腸道菌群導(dǎo)致[26]。有動物實驗證明，無菌動物體內(nèi)由于缺乏抗菌生長促進劑，從而導(dǎo)致其生長減緩[31]。細菌由于攜帶抗性基因而對抗生素產(chǎn)生耐藥性，使其對抗生素產(chǎn)生了抵抗能力，同時造成腸道菌群的紊亂，有可能進一步通過腸道菌群-腸-腦軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，從而影響生長、發(fā)育。有證據(jù)證明，抗性基因進入環(huán)境或病原微生物中通過水平轉(zhuǎn)移在細菌間傳播，越來越多的抗性基因在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境及動物腸道中被發(fā)現(xiàn)[32]，可能通過食物鏈傳遞給人類，給兒童健康帶來潛在的風(fēng)險[33]。

本研究存在一定局限性。首先，因為鳥槍法宏基因組測序技術(shù)的成本相對比較昂貴，所以本研究納入的總樣本量相對有限。其次，在納入樣本時，缺少針對出生史、喂養(yǎng)史等因素的分層分析，分娩及喂養(yǎng)方式的不同有可能會導(dǎo)腸道菌群改變。最后，耐藥基因的分布具有一定的區(qū)域性特征，在低收入、不發(fā)達地區(qū)人群的腸道菌群中抗性基因的豐度要高于生活在發(fā)達地區(qū)的人群[22]，而本研究納入的對象均來自于長三角地區(qū)，飲食結(jié)構(gòu)及經(jīng)濟基礎(chǔ)可能與其他區(qū)域有一定區(qū)別。

盡管存在這些局限性，但本研究是首次利用宏基因組測序技術(shù)，分析性早熟及健康女童的腸道菌群及抗性基因的研究，將為理解腸道菌群及抗性基因?qū)和L、發(fā)育的影響及作用邁出重要的一步。由于腸道菌群的復(fù)雜性和多樣性，其誘導(dǎo)性早熟的機制仍有待進一步研究。未來的研究將基于更大樣本量的數(shù)據(jù)分析，以闡明腸道菌群-腸-腦軸與性早熟之間的關(guān)聯(lián)機制，確定與性早熟相關(guān)的腸道菌群的潛在致病成員，以及性早熟患兒個體的特定腸道菌群管理，并建立基于腸道菌群對性早熟的干預(yù)和治療策略。

本研究使用宏基因組測序技術(shù)，分析比較了性早熟與健康女童間的腸道菌群結(jié)構(gòu)及組成，發(fā)現(xiàn)其存在顯著差異，提示性早熟發(fā)病可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著變化有關(guān)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)性早熟女童與健康女童間的抗性基因組成有著顯著差異，且更加富集于四環(huán)素類及大環(huán)內(nèi)酯類，還從兒童體內(nèi)檢測出臨床已經(jīng)停用多年和兒童慎用及禁用的抗性基因，氨基糖苷類抗生素的amrB，酚類抗生素的catB2、cat86、clbC 類抗性基因是可能是CPP 女童區(qū)別與PT 及NC 女童的標(biāo)志性抗性基因。有關(guān)抗性基因?qū)和c道菌群的影響，目前依然知之甚少，且尚沒有證據(jù)可以證明動植物養(yǎng)殖及環(huán)境中抗性基因與性早熟的發(fā)生、發(fā)展直接相關(guān)，但研究者不能忽視抗性基因通過可移動的質(zhì)粒傳遞給兒童的潛在威脅。

本研究呼吁研究者更多地關(guān)注兒童飲食與環(huán)境健康，以及環(huán)境中抗生素的使用對性早熟發(fā)病的潛在威脅，需進一步探索抗性基因在環(huán)境中的傳播機制以及對兒童健康的影響。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突關(guān)系。