鼠李糖乳桿菌grx10 在常溫褐色乳酸菌飲料中的應(yīng)用

魏楓染，劉媛，賈志磊，劉絨梅，胡詩(shī)齊，李啟明

（新希望乳業(yè)股份有限公司科技研究院 乳品營(yíng)養(yǎng)與功能四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610000）

0 引言

常溫褐色乳酸菌飲料發(fā)酵劑目前多選用干酪（副干酪）乳桿菌，如副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei Lpc37。穩(wěn)定性好[1]，但發(fā)酵時(shí)間久，且依賴(lài)進(jìn)口，有技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，成本高昂[2]。若我國(guó)本土來(lái)源菌株能將其替換，既可節(jié)約成本也可證實(shí)我國(guó)相關(guān)企業(yè)具備自有菌株篩選和工業(yè)化應(yīng)用能力。

鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosus grx10，是我國(guó)自主分離篩選的益生型專(zhuān)利乳酸菌（專(zhuān)利號(hào)：ZL200810023014.X），源自新疆傳統(tǒng)酸駱駝奶[3-5]。有研究表明，該菌株有較為顯著地降低膽固醇及抑菌能力，并可應(yīng)用于食品領(lǐng)域，發(fā)酵產(chǎn)酸能力較強(qiáng)[6]。

本研究旨在將grx10 應(yīng)用于常溫褐飲，完成實(shí)驗(yàn)室小試及生產(chǎn)線(xiàn)中試，綜合評(píng)價(jià)菌種對(duì)褐變引起的質(zhì)構(gòu)及風(fēng)味變化的適應(yīng)能力和保質(zhì)期內(nèi)的穩(wěn)定性[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂乳粉（蛋白質(zhì)≥3.2g/100mL，脂肪≤0.9g/100mL），NZMP 公司；食用葡萄糖，西王藥業(yè)公司；白砂糖，雙江南華糖業(yè)公司；果膠，安德利集團(tuán)公司；檸檬酸，珍好食品配料公司；鼠李糖乳桿菌grx10，一然生物科技公司；副干酪乳桿菌Lpc37，杜邦公司。

RO 水，自制；分析純氫氧化鈉，環(huán)凱微生物科技公司。

1.2 設(shè)備

ICINAC 16 乳品酸化監(jiān)控儀，AMS-Alliance 公司；LumiSizer611 穩(wěn)定性分析儀，LUM 公司；RW 20 數(shù)顯型頂置式攪拌器，IKA 公司；TA.XTplus 物性測(cè)試儀，超技儀器公司；MS603 電子天平，METTLER TOLEDO 公司；APV-1000 均質(zhì)機(jī)，沃迪智能裝備公司；BSC-250 恒溫恒濕箱，博訊實(shí)業(yè)公司；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺(tái)，安泰空氣技術(shù)公司；T5+Rondolino 電位滴定儀，METTLER TOLEDO 公司；FE20 pH 計(jì)，METTLER TOLEDO 公司；DV-E 數(shù)顯黏度計(jì)，BROOKFIELD 公司。

2 方 法

2.1 配方工藝

（1）飲料基礎(chǔ)配方。

褐色酸奶發(fā)酵液（脫脂乳粉10%、葡萄糖4%、發(fā)酵劑）25%、果膠0.4%、白砂糖8%、檸檬酸0.1%、RO 水約66.5%

（2）酸奶發(fā)酵工藝。

稱(chēng)取脫脂乳粉和葡萄糖→50～55 ℃攪拌化料→保溫水合30 min→定容→20 MPa 均質(zhì)—保溫褐變3 h→冷卻至接種溫度→接種發(fā)酵→終點(diǎn)酸度停止發(fā)酵→破乳攪拌→冷卻備用

（3）飲料調(diào)配工藝。

稱(chēng)取白砂糖、 果膠等物料→70～75 ℃剪切化料→冷卻至小于15 ℃→與酸奶混合→粗定容—檢測(cè)并噴酸→定容→20 MPa均質(zhì)→滅菌→冷卻→灌裝

2.2 grx10 發(fā)酵條件篩選

實(shí)驗(yàn)室研究grx10 在37 ℃及42 ℃（工業(yè)常用發(fā)酵溫度）條件下不同接種量的發(fā)酵效果，接種量設(shè)定為A：1×107mL-1，B：2×107mL-1，C：3×107mL-1，D：4×107mL-1，E：5×107mL-1。通過(guò)發(fā)酵監(jiān)測(cè)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際探索grx10 在發(fā)酵褐色酸奶時(shí)（終點(diǎn)pH：3.60～3.70；終點(diǎn)酸度：150～180 °T），不同發(fā)酵溫度下的最適接種量。

2.3 菌種質(zhì)構(gòu)對(duì)比

選取2.2 得到的最佳接種量，在37 ℃及42 ℃條件下發(fā)酵褐色酸奶，通過(guò)質(zhì)構(gòu)測(cè)定驗(yàn)證grx10 的適用性。

2.4 飲料感官品評(píng)

在2.3 的基礎(chǔ)上進(jìn)行常溫褐色乳酸菌飲料小試，通過(guò)感官品評(píng)判斷菌種最佳發(fā)酵溫度，進(jìn)一步評(píng)判g(shù)rx10 的適用性。

2.5 貨架期穩(wěn)定性研究

在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行中試，保證只有菌種差異，其他配方及工藝完全相同。對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性分析，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)在離心加速條件下的具體變化，并進(jìn)行貨架期觀測(cè)。穩(wěn)定性評(píng)定細(xì)則如表1 所示。貨架期觀測(cè)會(huì)將飲料成品在常溫（25～30 ℃）條件下貯存12 個(gè)月，觀察沉淀、析水、顏色變化、脂肪上浮、風(fēng)味變化情況等，并測(cè)定pH、酸度和固形物等指標(biāo)，從而綜合評(píng)判g(shù)rx10 的穩(wěn)定性。

表1 常溫褐色乳酸菌飲料穩(wěn)定性評(píng)定細(xì)則

2.6 項(xiàng)目評(píng)定及方法

2.6.1 發(fā)酵監(jiān)測(cè)

利用發(fā)酵監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以樣品溫度作為發(fā)酵監(jiān)測(cè)起點(diǎn)，以pH 范圍作為發(fā)酵監(jiān)測(cè)終點(diǎn)，監(jiān)測(cè)過(guò)程中每隔1 min 記錄一次數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)處理時(shí)每1 h 計(jì)算pH平均值。

2.6.2 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

利用物性測(cè)試儀測(cè)定硬度、稠度、內(nèi)聚力、黏性等指標(biāo)。參數(shù)設(shè)定如表2 所示。

表2 物性測(cè)試儀參數(shù)設(shè)定

2.6.3 感官品評(píng)

邀請(qǐng)15 名專(zhuān)業(yè)感官品評(píng)員進(jìn)行描述分析型測(cè)試，以實(shí)際分?jǐn)?shù)評(píng)判各項(xiàng)品評(píng)維度，以期準(zhǔn)確顯示在所評(píng)價(jià)的感官特性范圍內(nèi)不同處理組的各項(xiàng)特征，通過(guò)數(shù)據(jù)的處理分析得出相關(guān)結(jié)論。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表3 所示。

表3 常溫褐色乳酸菌飲料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

2.6.4 穩(wěn)定性分析

利用Lumi 穩(wěn)定性加速分析儀，量化產(chǎn)品在離心加速條件下各項(xiàng)穩(wěn)定性指標(biāo)的變化情況。參數(shù)設(shè)定如表4 所示。

表4 Lumi 參數(shù)設(shè)定

2.6.5 貨架期穩(wěn)定性觀測(cè)

將產(chǎn)品置于樣品架上，在常溫（25～30 ℃）下放置12 個(gè)月，觀察期內(nèi)記錄穩(wěn)定性異?，F(xiàn)象并量化其程度，觀測(cè)指標(biāo)如表5 所示。

表5 貨架期觀測(cè)指標(biāo)

pH 值測(cè)定：利用pH 計(jì)在室溫下測(cè)定并讀數(shù)。

固形物測(cè)定：利用折光儀測(cè)定固形物指標(biāo)。

酸度測(cè)定：利用酸度計(jì)測(cè)定酸度指標(biāo)。

黏度測(cè)定：利用數(shù)顯黏度計(jì)在室溫下測(cè)定并讀數(shù)（61#轉(zhuǎn)子；20 r/min，30 s）。

密度測(cè)定：利用密度計(jì)測(cè)定密度指標(biāo)。

顯著性分析：利用IBM SPSS Statistics 24 應(yīng)用軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 grx10 發(fā)酵條件篩選結(jié)果

37 ℃下不同接種量發(fā)酵監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖1 所示；42 ℃下不同接種量發(fā)酵監(jiān)測(cè)結(jié)果如圖2 所示。

圖1 37 ℃條件下grx10 發(fā)酵監(jiān)測(cè)

圖2 42 ℃條件下grx10 發(fā)酵監(jiān)測(cè)

由圖1 可知，grx10 在37 ℃和42 ℃條件下，接種量1×107，2×107，3×107間差異顯著（P＜0.05），3×107，4×107，5×107間差異不顯著（P＞0.05）。37 ℃下不同接種量（從低到高）達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（以pH 值3.65 計(jì)）的時(shí)間分別為：＞75＞75、61、58、57。42 ℃下分別為：＞52、45、35、34、33 h。

綜上，37 ℃下，grx10 接種量為1×107，2×107時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需的發(fā)酵時(shí)間均超過(guò)3 d，實(shí)際生產(chǎn)方面酸奶基料發(fā)酵過(guò)久占用發(fā)酵罐會(huì)造成較大損耗，使產(chǎn)品成本上漲，當(dāng)接種量為3×107時(shí)61 h 即可達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)。而當(dāng)接種量繼續(xù)上漲時(shí)，其發(fā)酵速率并不會(huì)明顯加快，接種量為4×107，5×107mL-1時(shí)較3×107mL-1達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需的時(shí)間相差＜5 h，能耗節(jié)約較少，但卻要增加物料成本。綜上，37 ℃下，grx10 的最適接種量為3×107。42 ℃下，發(fā)酵時(shí)間較37 ℃有明顯縮短，grx10 接種量為1×107，2×107mL-1時(shí)達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需的發(fā)酵時(shí)間超過(guò)或接近2 d，接種量為3×107mL-1時(shí)35 h 可達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)。當(dāng)接種量繼續(xù)增加時(shí)，其發(fā)酵速率亦不會(huì)明顯加快，接種量為4×107，5×107mL-1時(shí)較3×107mL-1達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)所需的時(shí)間差別＜3 h。綜上，42 ℃下，grx10 的最適接種量也為3×107mL-1。

3.2 grx10 與Lpc37 發(fā)酵褐色酸奶質(zhì)構(gòu)對(duì)比結(jié)果

37 ℃及42 ℃條件下鼠李糖乳桿菌grx10 與副干酪乳桿菌Lpc37 對(duì)比結(jié)果如圖3 所示。圖3 中字母a，b 表示差異顯著性及多重比較結(jié)果。

由圖3 可知，鼠李糖乳桿菌grx10 與副干酪乳桿菌Lpc37 在37 ℃和42 ℃下，達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)的酸奶質(zhì)構(gòu)，在硬度、稠度、內(nèi)聚力、黏性方面差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 37 ℃及42 ℃下grx10 與Lpc37 發(fā)酵褐色酸奶質(zhì)構(gòu)對(duì)比

綜上，不論發(fā)酵溫度是37 ℃還是42 ℃，同一溫度下，grx10 與Lpc37 作為發(fā)酵劑，制成的褐色酸奶在質(zhì)構(gòu)上差異均不顯著（P＞0.05）。Lpc37 是常溫褐色乳酸菌飲料中廣泛應(yīng)用的發(fā)酵劑，且市場(chǎng)售賣(mài)的產(chǎn)品保質(zhì)期基本標(biāo)示8～9 個(gè)月。所以作為對(duì)照組的grx10，二者在相同發(fā)酵溫度及接種量條件下發(fā)酵的褐色酸奶，質(zhì)構(gòu)維度測(cè)定值相近可說(shuō)明grx10 與Lpc37 作為發(fā)酵劑，對(duì)褐色酸奶質(zhì)構(gòu)的影響不相上下，且有研究證實(shí)鼠李糖乳桿菌對(duì)人腸道微生物菌群有益生作用[9]，所以grx10 可正常作為發(fā)酵劑使用，并達(dá)到Lpc37 發(fā)酵的質(zhì)構(gòu)狀態(tài)。

3.3 飲料感官品評(píng)對(duì)比結(jié)果

飲料感官品評(píng)對(duì)比結(jié)果如表6 所示。

由表6 可以看出，發(fā)酵溫度相同時(shí)，不同發(fā)酵劑制成的飲料，其各項(xiàng)感官維度評(píng)分間差異不顯著（P＞0.05）；發(fā)酵溫度不同時(shí)，相同發(fā)酵劑制成的飲料，其整體評(píng)價(jià)、風(fēng)味釋放、稠厚3 項(xiàng)感官維度評(píng)分差異顯著（P＜0.05），色澤、酸甜2 項(xiàng)感官維度評(píng)分差異不顯著（P＞0.05）。無(wú)論grx10 還是Lpc37 做發(fā)酵劑，37 ℃下的整體評(píng)價(jià)和風(fēng)味釋放平均分均高于42 ℃條件。

表6 飲料感官品評(píng)對(duì)比結(jié)果

綜上，感官評(píng)價(jià)層面，37 ℃優(yōu)于42 ℃，且由于鼠李糖乳桿菌可能出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)，故應(yīng)盡量避免高溫長(zhǎng)時(shí)發(fā)酵[10]。所以，制備常溫褐色乳酸菌飲料時(shí)，最佳發(fā)酵條件為37 ℃。該條件下，grx10 與Lpc37 制成的飲料感官評(píng)價(jià)差異小，進(jìn)一步印證了grx10 可作為發(fā)酵劑用于常溫褐色乳酸菌飲料，并達(dá)到Lpc37 作發(fā)酵劑的效果。

3.4 穩(wěn)定性研究結(jié)果

在上述研究的基礎(chǔ)上，保證只有菌種差異的前提下進(jìn)行中試，將產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性加速分析及貨架期觀測(cè)，結(jié)果如下。

（1）穩(wěn)定性加速分析結(jié)果如圖4 和圖5 所示。由圖4可以看出，37 ℃下，grx10 與Lpc37 制成的飲料在穩(wěn)定性加速分析結(jié)束時(shí)，澄清指數(shù)的區(qū)間變化趨勢(shì)及區(qū)間均值差異不顯著（P＞0.05）。由圖5 可以看出，37 ℃下，grx10 與Lpc37 制成的飲料在離心加速分析結(jié)束時(shí)，二者均出現(xiàn)底部沉淀現(xiàn)象，且沉淀量隨時(shí)間均勻增加。其中鼠李糖褐飲沉淀層約為2 mm，副干酪褐飲沉淀層約為2.5 mm。

圖4 褐飲中試樣Lumi 澄清指數(shù)變化趨勢(shì)對(duì)比

圖5 褐飲中試樣Lumi 分析

(2)貨架期內(nèi)穩(wěn)定性觀測(cè)結(jié)果如表7 所示。由表7 可以看出，12 個(gè)月貨架觀測(cè)期內(nèi)，上部析水、顏色變化、絮凝及分層情況，grx10 與Lpc37 變化一致。底部沉淀情況，grx10 產(chǎn)品出現(xiàn)時(shí)間略早于Lpc37 產(chǎn)品，但二者沉淀量后期維持一致。10 月開(kāi)始沉淀量超過(guò)2mm，顏色出現(xiàn)較嚴(yán)重變化，且出現(xiàn)絮凝及分層現(xiàn)象。所以產(chǎn)品維持穩(wěn)定的期限為9 個(gè)月。

表7 貨架期內(nèi)穩(wěn)定性觀測(cè)結(jié)果

(3) 貨架期內(nèi)理化監(jiān)測(cè)結(jié)果如表8 所示。由表8 可以看出，12 月觀測(cè)期內(nèi)，grx10 與Lpc37 在pH 值、固形物、酸度、黏度、密度方面的監(jiān)測(cè)值接近，且變化趨勢(shì)差異均不顯著（P＞0.05）。pH 方面，第1～9 月略有浮動(dòng)，總體維持在3.50～3.60 的正常范圍，從第10 月開(kāi)始，變化量增加；固形物方面，第1～9 月略有浮動(dòng)，總變化量≤0.5，從第10 月開(kāi)始，變化量較前9 月明顯增加；酸度方面，第1～9 月略有浮動(dòng)，月均變化量＜0.5，但從第10 月開(kāi)始，變化量較前9 月明顯增加，月均變化量＞2.0；黏度方面，第1～9 月略有浮動(dòng)，總變化量≤3.0，屬正常變化范圍，但從第10 月開(kāi)始黏度明顯降低且變化量逐月遞增；密度方面，第1～9 月維持不變，但從第10 月開(kāi)始密度降低。

表8 貨架期內(nèi)理化監(jiān)測(cè)結(jié)果

(4)貨架期內(nèi)感官評(píng)價(jià)結(jié)果根據(jù)上述觀測(cè)結(jié)果，在9個(gè)月內(nèi)每隔3 個(gè)月取樣品評(píng)，結(jié)果如表9 所示。由表9可以看出，grx10 與Lpc37 在整體評(píng)價(jià)、色澤、風(fēng)味釋放、稠厚、酸甜等感官維度，同期對(duì)比差異均不顯著（P＞0.05）。觀測(cè)期內(nèi)，二者整體評(píng)價(jià)及風(fēng)味釋放評(píng)分均在4.5分以上（含4.5 分），稠厚及酸甜也均在適中范圍。

表9 貨架期內(nèi)飲料感官評(píng)價(jià)對(duì)比結(jié)果

綜上，用grx10 和Lpc37 作發(fā)酵劑制成的中試樣品，在穩(wěn)定性加速分析結(jié)束時(shí)，其澄清指數(shù)的變化趨勢(shì)及區(qū)間均值差異不顯著（P＞0.05）；從變化曲線(xiàn)來(lái)看，grx10 與Lpc37 整體變化趨勢(shì)相似，差異不顯著（P＞0.05）。樣品管上部透射率在分析結(jié)束時(shí)，grx10 約有0.5 mm 透射率降至59%～60%，Lpc37 約有0.5 mm 透射率降至55%～56%；中部透射率均從初始的10%～20%提升至80%～90%；底部透射率在分析結(jié)束時(shí)，grx10 約有2.0 mm 透射率降至0%～10%，Lpc37 約有2.5 mm 透射率降至0%～10%。說(shuō)明產(chǎn)品貨架期內(nèi)可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，且grx10 沉淀量較Lpc37 少，加速分析結(jié)果更優(yōu)。貨架期觀測(cè)12 個(gè)月，第1～9 月grx10 與Lpc37 對(duì)比來(lái)看，在各項(xiàng)觀測(cè)指標(biāo)下的變化差異不顯著（P＞0.05），維持穩(wěn)定。但9個(gè)月以后，各項(xiàng)觀測(cè)維度都開(kāi)始有明顯異變，無(wú)法維持穩(wěn)定。但副干酪乳桿菌是應(yīng)用性能良好的發(fā)酵劑，其在食品生產(chǎn)領(lǐng)域非常成熟[11-12]。所以，grx10 與Lpc37 兩種發(fā)酵劑制成的飲料保質(zhì)期均可達(dá)9 個(gè)月。保質(zhì)期內(nèi)，二者穩(wěn)定性變化差異不顯著（P＞0.05），感官評(píng)價(jià)差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明grx10 的貨架期穩(wěn)定性與應(yīng)用性能良好且廣泛使用的Lpc37 相近。

4 結(jié)論

grx10 在37 ℃和42 ℃條件下發(fā)酵褐色酸奶的最適接種量均為3×107mL-1。37 ℃條件下，61 h 可達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)；42 ℃條件下，35 h 可達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)。

37 ℃和42 ℃條件下，grx10 與Lpc37 作為發(fā)酵劑，制成的褐色酸奶在硬度、稠度、內(nèi)聚力、黏性等食品質(zhì)構(gòu)維度上差異不顯著（P＞0.05）。

不同發(fā)酵溫度對(duì)褐色酸奶風(fēng)味有影響，37 ℃條件優(yōu)于42 ℃條件。相同溫度下，grx10 與Lpc37 作為發(fā)酵劑，制成的褐色酸奶感官評(píng)價(jià)差異不顯著（P＞0.05）。

grx10 與Lpc37 作為發(fā)酵劑，制備的常溫褐色乳酸菌飲料中試產(chǎn)品，貨架期內(nèi)穩(wěn)定性變化差異不顯著（P＞0.05），保質(zhì)期均能在常溫條件下達(dá)到9 個(gè)月。

綜上，鼠李糖乳桿菌grx10 可用于常溫褐色乳酸菌飲料的制備及生產(chǎn)。成品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性等，均與目前工業(yè)化應(yīng)用成熟的副干酪乳桿菌Lpc37 相似，說(shuō)明我國(guó)本土來(lái)源的專(zhuān)利菌種具備優(yōu)良的商業(yè)化應(yīng)用能力，新的本土商業(yè)化菌種篩選及應(yīng)用前景廣闊。