乳中骨橋蛋白的研究進(jìn)展

張雪丹，王祎，劉宗尚，于景華

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 天津 300457；2.上海芝然乳品科技有限公司 上海 201404）

0 引言

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種帶負(fù)電荷、高磷酸化和糖基化的蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為3.6[1-2]。OPN含有一個(gè)RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，Arg-Gly-Asp）序列，最初被鑒定為一種由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的唾液蛋白[3]。目前OPN 已經(jīng)被證明存在于乳液、膽汁、尿液等多數(shù)細(xì)胞和組織中，以分泌型OPN（sOPN） 和細(xì)胞內(nèi)OPN（iOPN） 兩種形式存在[4]。OPN 參與人體多種生理和病理過程，如骨重塑、傷口愈合、免疫調(diào)節(jié)等[5]。

OPN 在母乳中的平均濃度（138 mg/L）遠(yuǎn)高于牛乳（18 mg/L）[6]。但牛乳OPN 與人乳OPN 有61%的序列同源性，都包含相似的整合素結(jié)合、蛋白水解和PTM 位點(diǎn)[7]。此外，研究表明補(bǔ)充OPN 可以使配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒在各方面更接近于母乳喂養(yǎng)嬰兒[8]。本文綜述了OPN 的結(jié)構(gòu)、乳中OPN 的質(zhì)量濃度及其影響因素、分離純化和定量檢測(cè)方法，并對(duì)OPN 的生物學(xué)功能以及OPN 在嬰兒配方奶粉應(yīng)用及展望作一闡述。

1 OPN 的結(jié)構(gòu)特性

OPN 屬于小整合素結(jié)合配體N 端聯(lián)結(jié)糖蛋白家族，存在于人體人類4 號(hào)染色體（4q13）上[1]，由一個(gè)基因編碼，合成時(shí)分子量約為32 ku，由于選擇性剪接和不同翻譯后修飾，其分子量范圍在41～75 ku[9]。OPN屬于本質(zhì)無序蛋白，缺乏復(fù)雜的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)[10]，由314 個(gè)氨基酸殘基組成，由于牛乳OPN 缺乏與人OPN 中第188～209 對(duì)應(yīng)的22 個(gè)殘基序列，因此牛乳OPN 只含有262 個(gè)氨基酸，但與人乳OPN 中298 個(gè)氨基酸相比，仍有61%的序列同源性，另外還有44 個(gè)殘基保持了很高的結(jié)構(gòu)相似性[11]。此外，OPN 在乳中高度磷酸化，人乳OPN 與牛乳OPN 有部分相同的磷酸化位點(diǎn)以及相同的整合素結(jié)合序列[12]，在靠近RGD序列的非磷酸化區(qū)域都含有O-糖基化蘇氨酸，但二者之間的聚糖結(jié)構(gòu)存在顯著的差異[13]。

牛乳OPN 和人乳OPN 的分子結(jié)構(gòu)主要包括一個(gè)RGD 序列，2 個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)凝血酶裂解位點(diǎn)和一個(gè)鈣結(jié)合位點(diǎn)[14]，如圖1 所示。其中RGD 序列高度保守，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附蛋白質(zhì)的作用，通過與αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、α8β1 和α5β1 等整合素結(jié)合介導(dǎo)相互作用[15]。OPN 經(jīng)凝血酶裂解后，暴露出可以與α4β1、α9β1 和α4β7 整合素結(jié)合的SVVYGLR 基序，促進(jìn)細(xì)胞黏附[16]。此外，OPN 也是基質(zhì)金屬蛋白酶3 和7（MMP-3、7）的底物，與凝血酶裂解一樣，碎片化的OPN 表現(xiàn)出增強(qiáng)的刺激細(xì)胞黏附和遷移的能力[17]。而鈣結(jié)合位點(diǎn)在鈣離子介導(dǎo)或參與的反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[18]。OPN 還通過非RGD 結(jié)合位點(diǎn)和CD44 相互作用促進(jìn)黏附和遷移[19]。OPN 含有兩個(gè)端區(qū)，C 端與CD44 變體相互作用，還包含了兩個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)；而N 端包括整合素受體結(jié)合區(qū)[20]。OPN通過磷酸化、糖基化和蛋白水解處理進(jìn)行翻譯后修飾導(dǎo)致許多OPN 亞型的存在，目前已經(jīng)鑒定的包括OPNa（全長(zhǎng)亞型）、OPNb（缺少外顯子5）、OPNc（缺少外顯子4）[21]。由不同的細(xì)胞類型或者不同條件下表達(dá)的OPN 功能不同[22]。

圖1 OPN 的結(jié)構(gòu)特征[15]

2 OPN 的質(zhì)量濃度及其影響因素

OPN 在大多數(shù)組織和體液中表達(dá)，但在乳腺中分泌最高質(zhì)量濃度[23]。乳中OPN 的質(zhì)量濃度受泌乳階段、地域、物種、季節(jié)及疾病等因素的影響會(huì)產(chǎn)生變化。

2.1 泌乳階段的影響

乳中OPN 的質(zhì)量濃度在不同泌乳階段存在差異。初乳中濃度最高，隨泌乳期逐漸下降[23]。對(duì)1年哺乳期內(nèi)母乳OPN 的濃度變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)母乳OPN在初乳（第1～7 d）質(zhì)量濃度最高，約為178.0 mg/L，第9天時(shí)開始下降，并在哺乳一年內(nèi)持續(xù)減少，降低至48.3 mg/L。這種變化可能是由于嬰兒在不同的發(fā)育階段需要不同數(shù)量的OPN 以滿足不同的功能需求[24]。另一項(xiàng)對(duì)牛乳OPN 的研究也得出了相似的結(jié)論，結(jié)果表明牛初乳中OPN 的質(zhì)量濃度較高（200 mg/L），在泌乳第5天，下降到低于其初始濃度的10%[25]。

2.2 地域的影響

乳OPN 的質(zhì)量濃度存在地域差異性。對(duì)4 個(gè)不同國(guó)家母乳樣本中的OPN 濃度進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)母乳中OPN 質(zhì)量濃度（266.2 mg/L）和OPN 與總蛋白的比例（2.7%）最高；韓國(guó)和日本母乳中OPN 質(zhì)量濃度較低，分別為216.2 mg/L 和185.0 mg/L；而丹麥母乳樣本中的OPN 水平明顯低于其他3 個(gè)國(guó)家，只有99.7 mg/L。OPN 質(zhì)量濃度在整個(gè)哺乳期都呈下降趨勢(shì)，并且在不同國(guó)家之間差異顯著，但地域?qū)PN濃度產(chǎn)生影響的原因還不清楚，可能環(huán)境和飲食等差異有關(guān)[26]。

2.3 物種、季節(jié)和疾病的影響

乳中OPN 的質(zhì)量濃度也會(huì)受到物種、季節(jié)以及疾病等因素的影響。對(duì)牛、水牛、牦牛、綿羊和山羊奶中的OPN 質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，證實(shí)了不同物種乳中OPN 質(zhì)量濃度存在差異，其中牦牛乳中OPN 質(zhì)量濃度最高，為76.8～78.6 mg/L，牛乳中的OPN 質(zhì)量濃度為51.4～56.4 mg/L，水牛乳中為51.8～68.5 mg/L，綿羊乳、山羊乳中分別為29.8～41.0 mg/L 和12.7～44.3 mg/L[27]。Lu 等[28]的研究結(jié)果也表明，除了母乳中存在最高濃度以外，牦牛奶中OPN 的質(zhì)量濃度較高，分別是牛奶和山羊奶的3.5 倍和5.5 倍左右，且牦牛OPN 與牛OPN 相同，與人OPN 有61%的同源性。對(duì)不同季節(jié)的牛和水牛中的乳清蛋白進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)牛乳中OPN 的質(zhì)量濃度在冬季和夏季無顯著變化；但在水牛乳中，冬季OPN 的質(zhì)量濃度高于夏季；與冬季的牛乳相比，OPN 在冬季的水牛乳中具有較高的豐度[29]。另外，OPN 的質(zhì)量濃度也與乳腺疾病相關(guān)。研究表明與正常牛乳相比，由金黃色葡萄球菌感染引起的乳腺炎乳中OPN 的表達(dá)上調(diào)[30]。但另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與健康的荷斯坦牛乳和水牛乳相比，OPN 在患有亞臨床和臨床乳腺炎的牛乳和水牛乳中的質(zhì)量濃度均較低[31]。

2.4 其他影響因素

最新的研究發(fā)現(xiàn)，乳中OPN 質(zhì)量濃度還與產(chǎn)婦教育程度、產(chǎn)婦年齡以及產(chǎn)次等因素相關(guān)[32]。研究者分別在產(chǎn)后1～5 d（初乳）、8～14 d（過渡乳）、1 個(gè)月（早成熟乳）和6 個(gè)月（成熟乳）收集來自中國(guó)3 個(gè)地區(qū)的母乳樣本，測(cè)定了其中主要蛋白質(zhì)的濃度變化。結(jié)果表明，在泌乳前6 個(gè)月，乳中總蛋白濃度呈下降趨勢(shì)；OPN 質(zhì)量濃度在初乳中最高（71.8 mg/100 mL），隨著哺乳期逐漸下降；第一次分娩的母親在產(chǎn)后第一個(gè)月乳中OPN 質(zhì)量濃度較高；母親產(chǎn)齡越大、受教育程度越高，其成熟乳中OPN 的質(zhì)量濃度越高。這一結(jié)果可能是由于年齡產(chǎn)生的乳腺的變化，或是飲食上的差異導(dǎo)致蛋白質(zhì)分泌的差異。而OPN 的質(zhì)量濃度在這3個(gè)地區(qū)之間是否存在差異也有待研究。

3 OPN 的檢測(cè)方法

3.1 OPN 的分離純化及鑒定

乳中OPN 會(huì)通過相互作用力與一些功能蛋白發(fā)生結(jié)合[33]，因此，乳OPN 的分離純化過程相對(duì)復(fù)雜，一般是將幾種方法結(jié)合來提高蛋白純度。分離純化的方法一般包括離子交換色譜（IEC）、疏水相互作用色譜（HIC）、凝膠過濾、反相色譜（RPLC）以及透析等，其中離子交換法和疏水作用色譜是最常用的方法。離子交換色譜是利用蛋白質(zhì)在一定條件下所帶電荷的差異，與離子交換劑之間相互作用來實(shí)現(xiàn)分離的方法，包括陰離子、陽離子兩種交換劑[34]。OPN 是一種帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，因此在分離純化過程中多使用陰離子交換色譜柱。而疏水作用色譜作為重要的蛋白質(zhì)分離純化的方法之一，也廣泛用于OPN 的分離純化，通常與離子交換色譜結(jié)合實(shí)現(xiàn)更高純度的蛋白分離。

通常純化后OPN 需要進(jìn)行定性分析，鑒定方法通常包括免疫印跡法和N-末端氨基酸序列分析法。免疫印跡技術(shù)是靈敏度、特異性較高的一種蛋白質(zhì)分離檢測(cè)技術(shù)，過程包括SDS-PAGE 凝膠電泳分離出蛋白質(zhì)，然后固定到硝酸纖維素等載體上，利用特異性抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的檢測(cè)[35]。在此過程中可以通過蛋白分子量初步判定是否含有目的蛋白。另外可將目標(biāo)蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸序列與已知的牛OPN氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的鑒定。

Azuma 等[33]采用兩步陰離子交換色譜法從牛乳清中分離OPN。先通過DEAE - Sephacel 色譜柱在pH 5.0 下分離酸性乳清，第一步色譜得到的OPN 的純度為85%，隨后使用POROSRHQ 陰離子交換柱進(jìn)行二次色譜，最終從1 L 乳清中提取出約11 mg 純化的OPN。該方法是通過免疫印跡和N-末端氨基酸分析對(duì)蛋白進(jìn)行鑒定，通過SDS-PAGE 檢測(cè)到一個(gè)分子量約為60 ku 的單個(gè)蛋白條帶，其N 端氨基酸序列為L(zhǎng)PVKPT，這與已知的牛OPN 相同。

Bayless 等[36]利用離子交換和疏水色譜從牛乳中分離OPN。通過DEAE-Sephacel 柱和phenyl-Hepharose兩個(gè)色譜柱后，從1 L 牛乳中得到約8 mg 純化的OPN。SDS-PAGE 顯示蛋白分子量在60 ku 附近，N 端氨基酸序列與已知的牛OPN 一致，鑒定了純化后的蛋白質(zhì)為OPN。同樣的，LAN 等[37]將陰離子交換色譜和疏水相互作用色譜結(jié)合，從1 L 母乳中分離提取出大約9 mg OPN。并通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)OPN的蛋白純度大于97%。還有研究先利用離子交換層析技術(shù)對(duì)OPN 進(jìn)行第一步分離純化，再經(jīng)過兩次疏水相互作用，通過透析后凍干得到純化的OPN 組分。將分離產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE 電泳得到分子量約為60 ku，初步判定組分中含有目的蛋白。再通過免疫印跡法進(jìn)一步鑒定該蛋白為OPN。這種方法得到的OPN 蛋白純度較高，并且更利于保留蛋白活性[38]。

除此疏水作用色譜以外，一些其它的分離純化技術(shù)也與陰離子交換技術(shù)結(jié)合利用。Sorensen 等[39]先通過陰離子交換層析、去除酪蛋白、羥基磷灰石層析和負(fù)親和層析這4 個(gè)步驟從母乳中分離純化OPN 及其片段，再利用尺寸排除色譜和反相色譜將純化后的OPN 進(jìn)一步分離成不同的分子形式，并通過SDSPAGE 和氨基酸序列分析對(duì)純化的OPN 進(jìn)行了鑒定。最終從每600 mL 母乳中可以純化大約2 mg 完整的OPN。

目前市場(chǎng)上已經(jīng)有OPN 成品（Lacprodan OPN-10），是使用陰離子交換法從牛乳清中分離得到的。最終產(chǎn)物中含有約78%的蛋白質(zhì)，其中95%是OPN，并含有灰分（最多9%）、水分（最多5.5%）以及不到1%的脂肪和乳糖[40]。并且這種方法分離的OPN-10 成品已經(jīng)過安全性評(píng)價(jià)證明無遺傳毒性和致畸性作用，耐受性良好，無不良反應(yīng)[40]。

3.2 OPN 的定量

目前對(duì)乳中OPN 定量常用的分析技術(shù)有無膠篩分毛細(xì)管電泳法（NGSCE）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）和液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等。

趙京山等[41]利用非涂層毛細(xì)管，選用大分子聚乙二醇作為篩分介質(zhì)，對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化后進(jìn)行OPN 的測(cè)定。經(jīng)驗(yàn)證得到OPN 質(zhì)量濃度在0.079～2.5 g/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2為0.996），檢出限為0.079 g/L，回收率大于95%，RSD < 5%。結(jié)果表明該方法檢測(cè)速度快、進(jìn)樣量小，并且自動(dòng)化程度高，適于檢測(cè)微量蛋白質(zhì)。無膠篩分毛細(xì)管電泳與傳統(tǒng)的凝膠電泳相比，易于填充和沖出，減少蛋白質(zhì)的吸附和抑制電滲流，并且可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的篩分介質(zhì)，但在蛋白質(zhì)實(shí)際測(cè)定過程中仍然存在如蛋白質(zhì)吸附、分辨率低及其他復(fù)雜成分的干擾等問題[42]。

酶聯(lián)免疫法前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，具有高度的特異性和敏感性，不同乳蛋白的交叉反應(yīng)影響小[43]。OPN 可以通過ELISA 來測(cè)定，目前已應(yīng)用于人乳、牛乳、嬰幼兒配方奶粉[6]及人體血漿[24]中的OPN 定量。雖然ELISA 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但是研究顯示，不同的商業(yè)化ELISA 試劑盒測(cè)定的濃度存在差異，這可能是由于所使用抗體的交叉反應(yīng)性、存在翻譯后修飾等因素的影響，造成測(cè)定結(jié)果存在差異[16]。而且ELISA 耗時(shí)長(zhǎng)并且成本很高，相比之下高效液相色譜法（HPLC）提供了更高的分辨率，可以實(shí)現(xiàn)更快速、可重復(fù)的分離，在工業(yè)中一般采用HPLC 以降低樣品量和成本[44]。

Farid 等[45]建立了一種反相液相色譜法（RP-HPLC）來量化嬰幼兒配方奶粉中的OPN。結(jié)果表明，該方法具有良好的線性（R2=0.999）、靈敏度（檢出限為0.14 mg/L、定量限為0.41 mg/L）、精密度（RSD < 0.2%）以及回收率（99% ～102%），證明該方法能夠簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定嬰幼兒配方奶粉中的OPN。但這種方法可能會(huì)受到其它各種蛋白質(zhì)的干擾。

將液相色譜和質(zhì)譜結(jié)合在一起能夠有效降低樣品分析時(shí)的復(fù)雜性，可以提供更大的特異性、速度和分析物范圍。由于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)無明顯差異，不易于在液相色譜中實(shí)現(xiàn)分離，因此一般利用酶消化目的蛋白，產(chǎn)生更小的肽以利于色譜分離，而且質(zhì)譜儀對(duì)肽比蛋白質(zhì)更敏感[44]。Faria 等[16]建立了一種使用毛細(xì)血管微流LC-MS/MS 系統(tǒng)來量化人體血漿中OPN 的方法并進(jìn)行驗(yàn)證。該方法采用免疫純化將OPN 從血漿中分離出來，經(jīng)過胰蛋白酶消化后獲得的生物學(xué)相關(guān)特征肽GDSVVYGLR 來進(jìn)行定量。結(jié)果表明在25～600 ng/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性，并具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。Bei Hu 等[27]利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）對(duì)不同種類哺乳動(dòng)物乳中的OPN 進(jìn)行定量。該方法中蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶消化，選擇OPN 特征肽進(jìn)行二甲基標(biāo)記，經(jīng)純化富集后進(jìn)行UHPLC-MS/MS 分析。得出方法的檢出限和定量限分別為0.5 mg/L 和2.0 mg/L。線性關(guān)系良好（R2≥0.998），回收率為103.7%～111.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～6.2%。這種方法測(cè)定的牛乳中的OPN 含量（51.4～56.4 mg/L）要遠(yuǎn)高于Schack 等[6]用ELISA 法測(cè)定的結(jié)果（18 mg/L）。造成兩種方法結(jié)果差異的原因可能是OPN 的修飾或者裂解可能會(huì)影響ELISA 中抗原和抗體之間的結(jié)合，也可能是受到牛的品種和泌乳期差異的影響[27]。目前ELISA 是使用較廣泛一種測(cè)定，但其測(cè)定結(jié)果存在多變性，相對(duì)而言HPLC- MS/MS 直接對(duì)特征肽進(jìn)行分析，可能會(huì)成為更有效的測(cè)定方法。

4 OPN 的功能

OPN 通過不同的機(jī)制在人體不同部位發(fā)揮作用，其生物活性一般是通過與細(xì)胞表面受體如CD44和整合素的直接相互作用來實(shí)現(xiàn)的[2]，同時(shí)sOPN 存在的修飾亞型和iOPN 也使OPN 具有多向活性[3]。OPN在乳中存在的最高含量也說明其在乳中的重要性。

4.1 乳OPN 的功能

有研究表明，乳腺上皮細(xì)胞在懷孕和哺乳期過度表達(dá)OPN，通過在乳腺上皮中表達(dá)OPN 反義RNA的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)OPN 合成的抑制導(dǎo)致了懷孕的小鼠缺乏乳腺肺泡結(jié)構(gòu)，β-酪蛋白和乳清酸性蛋白的合成急劇減少，并且泌乳不足，這表明OPN 參與了乳腺發(fā)育和分化[46]。OPN 對(duì)乳腺的重要性還體現(xiàn)在OPN 基因（SPP1）的遺傳變異會(huì)影響產(chǎn)奶量和局部乳腺免疫[23]。OPN 是高度磷酸化的蛋白質(zhì)，因此能夠與鈣離子結(jié)合并形成可溶性復(fù)合物，從而抑制乳中無定形磷酸鈣的沉淀[47]。此外，在乳中OPN 會(huì)通過靜電或親和力相互作用與乳鐵蛋白等一些功能蛋白發(fā)生結(jié)合，并可能作為這些免疫調(diào)節(jié)或抗菌蛋白到其作用位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，并保護(hù)它們免受蛋白水解，在作用位點(diǎn)OPN 與這些蛋白可以獨(dú)立或可能協(xié)同發(fā)揮作用[33]。研究表明口服OPN可以抑制DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[48]；同時(shí)OPN 也可能通過改變免疫反應(yīng)來促進(jìn)病原防御，可以抵御細(xì)菌、病毒等感染[7]；可以通過黏附在生物膜中細(xì)菌表面來抑制口腔生物膜進(jìn)一步形成[49]；并通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞IL-12和IL-10 細(xì)胞因子的差異表達(dá)來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[50]。還有研究表明從牛乳中純化的OPN 在牛體外受精和胚胎發(fā)育中起著促進(jìn)作用[51]。對(duì)于OPN 在乳中的生物學(xué)作用的相關(guān)機(jī)制和作用還需進(jìn)一步研究。

4.2 OPN 的其他功能

OPN 在人體中廣泛存在并通過不同的機(jī)制發(fā)揮不同的作用。OPN 可以調(diào)節(jié)骨組織中的生物礦化，在此過程的功能主要包括調(diào)節(jié)骨細(xì)胞黏附、調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)基質(zhì)礦化，以此來降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)；OPN 可以提高細(xì)胞活力，在傷口愈合中也發(fā)揮著重要的作用[14]。另外，OPN 可以抑制上皮組織中鈣晶體的生長(zhǎng)和聚集，在體內(nèi)起著關(guān)鍵的腎保護(hù)作用[52]；也可以防止酒精引起的肝損傷[53]等。然而，研究表明OPN過度表達(dá)也存在一些負(fù)面影響，例如，OPN 的釋放會(huì)增加腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[54]；OPN 也與心血管疾病有關(guān)，如OPN 會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成導(dǎo)致動(dòng)脈鈣化的風(fēng)險(xiǎn)，增加血管阻力，導(dǎo)致心力衰竭等心血管疾病[55]；此外OPN 釋放量增加會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗[14]。因此OPN 目前被認(rèn)為是幾種癌癥的預(yù)后和診斷的生物標(biāo)記之一，通過OPN 水平可以檢測(cè)冠狀動(dòng)脈疾病的存在和嚴(yán)重程度，而降低血漿OPN 濃度也可能在預(yù)防糖尿病并發(fā)癥方面發(fā)揮重要作用。

5 應(yīng)用與展望

近年來的研究表明，OPN 在早期生命發(fā)育中發(fā)揮重要作用，主要表現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、腸道發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面[12]。但在嬰兒配方奶粉中OPN 質(zhì)量濃度僅有9 mg/L[6]，因此，OPN 的潛在價(jià)值在于將其補(bǔ)充到嬰幼兒配方奶粉中，通過模擬母乳成分，給嬰幼兒提供近似于母乳的營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用。

L.o.nnerdal 等[56]將普通配方奶粉和添加了兩種不同濃度OPN 的配方奶粉（分別添加65 mg/L 和130 mg/L OPN，其中OPN 水平相當(dāng)于母乳中OPN 濃度的50%或100%）分別喂養(yǎng)嬰兒（1～6 個(gè)月），并與母乳喂養(yǎng)嬰兒進(jìn)行比較。結(jié)果表明，與食用普通配方奶粉的嬰兒相比，食用添加OPN 的配方奶粉的嬰兒血清中促炎細(xì)胞因子TNF-a 的濃度顯著降低；嬰兒的患病天數(shù)明顯減少；并且食用補(bǔ)充100%OPN 配方奶粉的嬰兒血漿蘇氨酸及支鏈氨基酸明顯較低。結(jié)果說明OPN 參與調(diào)節(jié)了嬰兒的免疫功能，使配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒與母乳喂養(yǎng)的嬰兒更相似。同樣的，研究發(fā)現(xiàn)，母乳喂養(yǎng)嬰兒和補(bǔ)充OPN 的配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒，在4 個(gè)月和6 個(gè)月時(shí)血漿樣本中OPN 水平要高于喂養(yǎng)常規(guī)配方奶粉嬰兒，表明在嬰兒配方奶粉中補(bǔ)充OPN 可能是通過增加內(nèi)源性O(shè)PN 合成發(fā)揮其有益功能[24]。

對(duì)牛乳OPN 進(jìn)行體外消化研究證明，含有整合素結(jié)合基序的生物活性O(shè)PN 片段能夠抵抗胃消化，在到達(dá)體內(nèi)腸道后存活下來，并通過整合素信號(hào)在腸道內(nèi)發(fā)揮多效性功能[57]。因此，部分研究利用動(dòng)物模型探討補(bǔ)充OPN 的配方奶粉對(duì)嬰幼兒腸道發(fā)育的影響。對(duì)新生恒河猴分別給予母乳、普通配方奶粉和添加了質(zhì)量濃度125 mg/L OPN 配方奶粉喂養(yǎng)3 個(gè)月，提取空腸mRNA 并進(jìn)行微陣列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通配方奶粉喂養(yǎng)和母乳喂養(yǎng)的幼猴腸道中的基因表達(dá)存在差異，在配方中補(bǔ)充了OPN 后改變了這種差異表，使喂養(yǎng)OPN 配方組的空腸轉(zhuǎn)錄組基因與母乳喂養(yǎng)更加相似，而且不會(huì)對(duì)新生兒的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[8]。這說明補(bǔ)充OPN 可以通過整合素誘導(dǎo)腸道基因表達(dá)，促進(jìn)新生兒腸道健康。Ren 等[58]對(duì)早產(chǎn)的仔豬注射LPS，并連續(xù)5 d喂食補(bǔ)充OPN（質(zhì)量濃度30 g/L）的配方奶粉，與普通配方相比，補(bǔ)充OPN 后降低了腹瀉率，并刺激了腸上皮細(xì)胞的增殖，對(duì)早產(chǎn)仔豬的未成熟腸道發(fā)揮了適度的保護(hù)作用。這些結(jié)果都表明OPN 可以在嬰幼兒腸道中直接發(fā)揮作用，與SU 等人[59]的研究結(jié)果一致，在經(jīng)過胃腸道消化后的母乳和嬰兒配方奶粉中都發(fā)現(xiàn)的一種來自O(shè)PN 的多肽。

因此，OPN 作為一種多功能蛋白質(zhì)，將其添加至配方奶粉中可以促進(jìn)嬰幼兒的免疫保護(hù)和腸道發(fā)育，減小配方奶粉喂養(yǎng)與母乳喂養(yǎng)的嬰兒之間的差異。除此以外，有研究表明OPN 在嬰兒早期的腦發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶功能中發(fā)揮著積極的作用[60]。這是通過小鼠口服乳OPN 得到的結(jié)果，但也表明了在配方奶粉中補(bǔ)充OPN 另一個(gè)可能的潛在益處。而且除了單獨(dú)發(fā)揮作用外，OPN 在乳中會(huì)與乳鐵蛋白（LF）相互結(jié)合形成LFOPN 復(fù)合物，其體外消化的穩(wěn)定性和對(duì)腸細(xì)胞增殖和分化的促進(jìn)作用高于單個(gè)蛋白質(zhì)，并能更有效地被腸道上皮細(xì)胞結(jié)合和吸收，并增強(qiáng)它們各自的生物活性[37]。這種生物活性表明若將OPN 以復(fù)合物形式加入嬰兒配方奶粉中，可能比單個(gè)OPN 發(fā)揮更好的功效。

目前對(duì)OPN 在嬰幼兒配方奶粉中的應(yīng)用研究還較少，但離子交換色譜已經(jīng)應(yīng)用于牛乳OPN 的分離純化，并且成品已被證明安全無毒性。酶聯(lián)免疫法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用可能成為更廣泛使用的含量測(cè)定的方法。此外，牦牛乳中含有較高濃度的OPN，這也可能作為母乳OPN 的另一個(gè)替代來源。補(bǔ)充OPN可以使配方奶粉具有更接近母乳的功能，同時(shí)，OPN與乳中其它成分之間協(xié)同可能會(huì)發(fā)揮更好的作用。然而對(duì)于乳OPN 的更多的功能、作用機(jī)制及其添加到嬰幼兒配方奶粉中的安全性未來還需進(jìn)一步研究。