分步酶解制備乳清蛋白源ACE 抑制肽的工藝研究

范堯珠，李倩茹，王雪峰,2，普岳紅,2，李凌飛，黃艾祥

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，昆明 650201）

0 引言

乳餅作為云南特色產(chǎn)品之一，其制作過程中會產(chǎn)生大量的乳清水，乳清水具有很高的營養(yǎng)價值和保健功能[1-4]，但這些乳清水未得到充分利用，造成了浪費(fèi)。因此，如何提高乳清水的利用率成為亟待解決的問題。

高血壓是一種慢性疾病，如今，高血壓患者人數(shù)已突破1 億[5-8]。常見的高血壓藥物大多是化學(xué)合成的，具有一定的毒性，影響身體健康[9]。食品源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin Converting Enzyme,ACE）抑制肽是理想的高血壓治療藥物[10]，且多項研究表明，乳蛋白源是ACE 抑制肽的一個重要來源[11-12]。

本研究以乳清水為原料，采用雙酶分步酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽，以蛋白水解度和ACE 抑制率為評價指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件，以期為乳源ACE 抑制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HHL（馬尿酰-組氨酸-亮氨酰）、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE），美國Sigma-Aldrich 試劑公司；木瓜蛋白酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

H3-18K 臺式高速離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；JC-SY 恒溫水浴鍋，上海成順儀器儀表有限公司；BSA124S-CW 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；STARTER3100pH 計，奧豪斯儀器（上海）有限公司；R-BIOPHARMWELI 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白粉的制備

原料的制備參照雷靜[13]的方法。

乳清水→用10 mo l/L 的NaOH 調(diào)pH 至7.5 →按照12 mL/L 的量添加濃度為1 mol/L 的CaCl2（目的是沉淀酪蛋白）→在60 ℃水浴攪拌15 min→離心(4000 r/min,4 ℃，35 min) →取上清液→粗濾→微濾→超濾→透析→凍干→乳清蛋白粉

1.2.2 乳清蛋白源ACE 抑制肽的酶解制備工藝流程

乳清蛋白粉→按照料液比加蒸餾水配成溶液→震蕩5 min→調(diào)到酶的最適pH→水浴酶解（酶解過程中保持酶解的pH 值）→95 ℃酶失活10 min→離心（4000 r/min,30 min）→酶解液

1.2.3 酶解產(chǎn)物水解度的測定

水解度參照呂小京等的OPA（鄰苯二甲醛）法[14]進(jìn)行測定。向96 孔板中依次加入酶解液和OPA 試劑，在25 ℃左右震蕩8 min 后,在340 nm 處測定吸光值。以GSH（谷胱甘肽）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，將吸光度代入公式求出樣品中的多肽含量，蛋白含量用凱氏定氮法測定值為68.7%。水解度計算為

1.2.4 ACE 抑制率的測定

采用紫外分光光度法[15]。用pH 值為8.3，含濃度為0.3 mol/L 的NaCl（PBS）溶液將HHL 固體配置成濃度5 mmol/L 的溶液，首先把馬尿酸和酶解液混合在37 ℃條件下預(yù)熱5 min，然后加入標(biāo)品，在相同溫度下繼續(xù)反應(yīng)30 min，之后立馬加入鹽酸終止反應(yīng)。最后加入適量的乙酸乙酯提取反應(yīng)物中的馬尿酸。用離心機(jī)離心10 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min 后取300 μL上清液于另一離心管中，120 ℃烘干，取出冷卻到常溫后加入0.6 mL 超純水，在228 nm 處測定吸光度。ACE 抑制率為

式中：Aa為樣品組；Ab為對照組；Ac為提前終止反應(yīng)組。具體步驟如表1 所示。

表1 體外ACE 抑制率測定方法 μL

1.3 酶解條件

1.3.1 酶的篩選

酶具有專一性，酶的類別不一樣，獲得的酶解產(chǎn)物的特性不同。采用堿性、胃、胰和木瓜蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)水解度和ACE 抑制率，確定出最佳的兩種酶。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在分解階段選擇了兩種酶，以溫度50 ℃，酶解時間2.5 h∶2.5 h，料液比1∶30 為初始條件，研究酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）、酶解時間(1 h∶4 h，2 h∶3 h，2.5 h∶2.5 h，3 h∶2 h，4 h∶1 h) 和料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）對水解度和ACE 抑制活性的影響，確定出各個因素的最適條件。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)性進(jìn)行了三因素三水平的設(shè)計來優(yōu)化工藝條件，得出酶解的最佳工藝條件，如表2 所示。

表2 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

由于不同蛋白酶作用底物的酶切位點(diǎn)及水解方式不同，酶解出來的片段的結(jié)構(gòu)和活性也不相同，因此，選取合適的蛋白酶是制備目標(biāo)肽的重要因素[16]。由圖1可知，水解度由大到小依次為堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞胃蛋白酶；ACE 抑制率也呈相同趨勢，因此確定將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶對水解度及ACE 抑制率的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

以溫度50 ℃，酶解時間2.5 h∶2.5 h 為初始條件，探究料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50）對酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 所示，隨著比例的不斷增大，ACE 抑制率和水解度所成趨勢大致相同。當(dāng)ACE 抑制率達(dá)到峰值（84.44%）時，相應(yīng)的料液比為1∶30，隨著蒸餾水量的增加，降壓活性和水解度呈下降的趨勢，ACE 抑制率和水解度呈向下降的趨勢，這可能是因?yàn)橹参锏鞍字泻兄参锏鞍酌敢种苿芘c蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結(jié)合基團(tuán)，表現(xiàn)出競爭性抑制作用[17]，因此可以確定酶解的最佳料液比為1∶30。

圖2 料液比對乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

2.2.2 酶解時間對產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

以酶解溫度50 ℃，料液比1:30 為初始條件，探究酶解時間（1 h∶4 h，2 h∶3 h，2.5 h∶2.5 h，3 h∶2 h，4 h∶1 h）對酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酶解時間對乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶先酶解一段時間后再加入木瓜蛋白酶的順序進(jìn)行分步酶解，由圖3 可知，ACE 抑制率先升高后降低，酶解時間（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）為3∶2 時，ACE 抑制率達(dá)到峰值87.9%，這時的水解度也比較高。當(dāng)酶解時間大于3∶2 時，活性肽鏈被過度酶降解，結(jié)構(gòu)被破壞，并且酶產(chǎn)物的抑制活性降低[18]。因此，可以初步確定最佳的酶解時間（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）為3∶2。

2.2.3 酶解溫度對水解度及ACE 抑制率的影響

以料液比1∶30，酶解時間2.5 h∶2.5 h 為初始條件，探究酶解溫度（40，45，50，55，60 ℃）對酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可知，抑制活性和酶解程度的變化趨勢相似。當(dāng)溫度為50 ℃時，水解度和抑制活性最好，隨著溫度的升高，抑制活性和水解度下降，因?yàn)槊糠N酶都有特定的耐受溫度值，當(dāng)溫度超過了它原本所能承受的溫度時，酶的活性反而會受到抑制而降低，影響了酶促水解的速率[19]，由此可以確定50 ℃為最適的酶解溫度。王晟等[20]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶制備山杏源降糖肽的最佳酶解溫度為50 ℃，與本研究相似。

圖4 酶解溫度對乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

2.3 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

在篩酶試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對乳清蛋白進(jìn)行分步酶解，酶的添加量為4%，根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken 原理，選取料液比、酶解時間和酶解溫度為考查因素，ACE 抑制率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，方差分析如表4 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表4 回歸模型與方差分析

所得數(shù)據(jù)通過DesignExpert8.0.6 軟件逐步回歸分析，得到ACE 抑制率與溫度、時間和料液比擬合后的二次多項回歸方程為

由表4 可知，該模型P<0.0001，說明分布酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽回歸模型顯著,同時失擬項不顯著，R2=0.97 表示模型可信度高，可用該模型來分析和預(yù)測整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4 中X1、X2、X3的F 值大小可以推斷出，3 個因素對酶水解產(chǎn)物抑制活性的影響順序?yàn)閄1>X2>X3，即料液比>酶解時間>酶解溫度，其中X1和X2的影響對于ACE 抑制率更為重要。ACE 抑制率與各因素呈明顯的線性關(guān)系，通過分析可以得到酶解過程的最佳參數(shù)。

分析料液比(X1)、酶解時間(X2)、酶解溫度(X3)對ACE 活性的影響情況，3 個因素之間兩兩交互作用下的三維圖和等高線如圖5 所示。

圖5 各因素及交互作用對ACE 抑制率的影響

通過DesignExpert8.0.6 軟件分析及預(yù)測，得到最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為酶解溫度50 ℃，酶解時間3∶2，料液比1∶35（g/mL），在此參數(shù)條件下所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到88%，與預(yù)測值87.69%接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以從云南乳餅加工副產(chǎn)物—乳清水中獲得的乳清蛋白粉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了分步酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽的工藝，獲得其最佳酶解條件為溫度50 ℃，時間（堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶）3∶2，料液比1∶35（g/mL），在此條件下酶解液的ACE 抑制率為88%。研究可為后續(xù)乳清蛋白源ACE 抑制肽的進(jìn)一步分離鑒定奠定基礎(chǔ)，為相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供重要參考。