谷氨酸及其受體在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良模型大鼠大腦皮質(zhì)中的表達(dá)

馬勛泰，陳林波，周莎，陶敏,馮占輝

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科最常見、最嚴(yán)重的慢性疾病之一，其中局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良是導(dǎo)致兒童和成人難治性癲癇的常見原因之一。針對(duì)該類型癲癇目前主要采取手術(shù)治療，但普遍術(shù)后療效欠佳。近年來(lái)科研工作者一直致力于局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良引起癲癇發(fā)病的研究，并嘗試應(yīng)用各種方式制作局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良的癲癇模型，本課題組也開展了相關(guān)工作。神經(jīng)元興奮和抑制失衡是皮質(zhì)發(fā)育障礙引起癲癇發(fā)作的原因之一。神經(jīng)元細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)遞質(zhì)的變化可能在癲癇發(fā)作中起到了相當(dāng)重要的作用，而關(guān)于這方面的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)研究較為缺乏?？赏ㄟ^查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)發(fā)育障礙型癲癇微腦回及其周圍可能存在興奮性氨基酸與抑制性氨基酸水平失衡，可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察神經(jīng)遞質(zhì)特點(diǎn)，分析局部致癇病灶，預(yù)測(cè)癲癇發(fā)作周期。研究抑制神經(jīng)遞質(zhì)失衡的方法，達(dá)到治療目的。同樣通過探索微腦回及其周圍神經(jīng)遞質(zhì)分布特點(diǎn)，為外科手術(shù)治療皮質(zhì)發(fā)育障礙型癲癇提供方案。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/h3>

建立局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良模型大鼠用于該實(shí)驗(yàn)，36只新生 Wistar大鼠(購(gòu)自陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動(dòng)物中心)隨機(jī)分成手術(shù)組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組共3組(各12只)。3組模型大鼠構(gòu)建成功后均用于免疫組織化學(xué)研究。實(shí)驗(yàn)方法參照Dvorak和Feit修正方案及其后續(xù)改進(jìn)的方案。手術(shù)組大鼠采取低溫麻醉，常規(guī)碘伏消毒及鋪巾，切開額頂處皮膚約0.4～0.6 cm，充分暴露額頂顱蓋骨，把經(jīng)液氮冷凍過的鈍形銅針(直徑約1 mm)置于額頂顱骨上8 s，以同樣的方法在顱骨上形成3處損傷，其中兩處損傷連線與顱中縫線平行，間距1.5 mm，術(shù)后縫合1針。假手術(shù)組采取相同方法，但銅針非冰凍處理，損傷的位點(diǎn)與手術(shù)組相同,正常對(duì)照組則不采取任何處理,在相同條件下喂養(yǎng)16～18周用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

親和純化兔抗谷氨酸(Glutamate，Glu)、兔抗人、兔、大鼠、小鼠谷氨酸受體NMDAR1，兔抗人、大鼠及小鼠谷氨酸受體GluR2均購(gòu)于中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

使用4%多聚甲醛PBS液經(jīng)過心臟灌注后，固定取材,選取大腦中隔區(qū)后行石蠟切片，包括海馬的層面，每只大鼠共取約10片，每片厚約5 μm，同時(shí)行鏈霉親合素-生物素-過氧化酶復(fù)合物法(strept avidin-biotin-peroxidase complex,SABC 法)，做免疫組化時(shí)，一抗?jié)舛?∶50。通過肉眼觀察和光鏡觀察大鼠切片標(biāo)本免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況，每只大鼠隨機(jī)取 3 張切片，每張切片取9個(gè)視野(3.3×10 倍)，分別為小腦回或后肢代表皮質(zhì)區(qū)、前額葉、軀體感覺代表皮質(zhì)區(qū)(Par1、Par2)、海馬(CA1、CA2、CA3、DG)及杏仁核。分析小腦回或后肢代表皮質(zhì)區(qū)、前額葉、軀體感覺代表皮質(zhì)區(qū)(Par1、Par2)、海馬(CA1、CA2、CA3、DG)及杏仁核免疫陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 蘇木精-伊紅染色法

手術(shù)組大鼠的大腦皮質(zhì)具有典型的三、四層大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)。但枕部新皮質(zhì)結(jié)構(gòu)被微腦回分裂開來(lái)，失去大腦正常皮層結(jié)構(gòu)。微腦回皮質(zhì)分層異常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂，神經(jīng)元軸突、樹突異常。在微腦回周圍見巨大神經(jīng)元、巨大星形細(xì)胞和貝茨巨大嗜酸細(xì)胞(泡狀細(xì)胞)，皮質(zhì)下白質(zhì)也可見巨大的嗜酸性泡狀細(xì)胞，同側(cè)遠(yuǎn)離微腦回的海馬CA3區(qū)亦可見細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞丟失，而其它海馬區(qū)未觀察到結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的明顯改變(圖1)。

注：A為假手術(shù)組(3.3×4倍)，B為手術(shù)組(3.3×20倍)。

2.2 Glu免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)

3組大鼠大腦皮質(zhì)和海馬Glu免疫陽(yáng)性著色神經(jīng)元的表達(dá)是普遍存在的。正常對(duì)照組和假手術(shù)組的大腦皮質(zhì)第二、三層、梨狀皮質(zhì)層和CA1-CA3區(qū)所有錐體細(xì)胞以及海馬閂都觀察到Glu免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞質(zhì)及樹突、軸突著色，且神經(jīng)元胞體著色較深。大腦皮質(zhì)第五層錐體神經(jīng)元的胞體和樹突可見濃密的神經(jīng)元免疫陽(yáng)性著色，而第一、四層和深層皮質(zhì)及白質(zhì)免疫陽(yáng)性細(xì)胞最少。微腦回及周圍皮質(zhì)Glu免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布主要反映了皮質(zhì)發(fā)育障礙的形態(tài)學(xué)變化，與正常大腦皮質(zhì)比較差異小。微腦回及周圍皮質(zhì)：在微腦回皮質(zhì)里，第一層沒有陽(yáng)性細(xì)胞著色，第二、三層仍有濃密的神經(jīng)元纖維著色。第二層就可以找到朝微溝軟膜表面的陽(yáng)性著色小錐體細(xì)胞的樹突棘。然而，在發(fā)育異常皮質(zhì)的底側(cè)周圍有大量的Glu免疫陽(yáng)性著色神經(jīng)元，它們層次不清，樹突方向紊亂，且可能找到Glu陽(yáng)性的巨大錐體細(xì)胞。在微腦回皮質(zhì)周圍Glu能神經(jīng)元數(shù)有所增多，而且在微腦回周圍Glu陽(yáng)性著色細(xì)胞表達(dá)顯著增加，其它包括海馬、杏仁核等腦區(qū)沒有明顯改變。結(jié)果詳見表1。

2.3 NMDAR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)

3組大鼠大腦皮質(zhì)可見NMDAR1免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元是普遍存在的，在大腦皮質(zhì)第二、三層和梨狀皮質(zhì)層可見神經(jīng)纖維著色。大腦皮質(zhì)二、三、五層和海馬閂、梨狀皮質(zhì)、海馬CA1-CA3區(qū)所有錐體細(xì)胞可見密集的神經(jīng)元著色。而在第一、四層及較深的大腦皮質(zhì)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞最少。微腦回及周圍皮質(zhì)：在發(fā)育障礙的大腦皮質(zhì)和周圍，NMDAR1免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布主要反映了皮質(zhì)發(fā)育障礙的形態(tài)學(xué)改變，與正常大腦皮質(zhì)比較僅有較小的差異。在上面的大腦皮質(zhì)層折疊，第二、三層組織有濃密的陽(yáng)性神經(jīng)纖維著色，而折疊的第一層未見有陽(yáng)性著色。在第二層里小錐體細(xì)胞正如正常第三層皮質(zhì)，發(fā)現(xiàn)有樹突棘指向微溝的軟膜表面，然而大量NMDAR1陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在微溝底部，細(xì)胞無(wú)明確的層次結(jié)構(gòu)，樹突棘的方向不清。發(fā)育異常的大腦皮質(zhì)NMDAR1免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元形態(tài)沒有多大的改變，微腦回周圍NMDAR1陽(yáng)性著色細(xì)胞表達(dá)顯著增加，其它包括海馬及杏仁核等腦區(qū)沒有顯著改變。結(jié)果詳見表1。

2.4 GluR2免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)

大鼠大腦皮質(zhì)及海馬：GluR2免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元胞體主要分布在大腦皮質(zhì)和海馬，在其他另外一些區(qū)域很稀疏。正常對(duì)照組和假手術(shù)組大腦皮質(zhì)較上皮層或第五層可見層次清楚的免疫陽(yáng)性著色。正常第六層(正如在灰質(zhì)白質(zhì)交界處)示一薄邊小非錐體細(xì)胞層，為中度著色，在皮質(zhì)發(fā)育障礙的第一層與第二層著色相似，幾乎很少免疫陽(yáng)性細(xì)胞著色。微腦回及周圍皮質(zhì)：在微溝底GluR2陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)減少，沒有檢測(cè)到免疫陽(yáng)性神經(jīng)元。免疫反應(yīng)巨大的錐體細(xì)胞與正常細(xì)胞著色相同，但胞體較大。微腦回周圍GluR2陽(yáng)性著色細(xì)胞表達(dá)顯著增加(圖2)，其它包括海馬、杏仁核等腦區(qū)沒有明顯改變。結(jié)果詳見表1。

注：A為手術(shù)組大鼠大腦皮質(zhì)損害部位(3.3×4倍)，B為GluR2免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)(3.3×20倍)。

表1 3組大鼠大腦皮質(zhì)不同腦區(qū)中Glu和NMDAR1及GluR2的表達(dá)水平

3 討論

局灶性皮層發(fā)育不良(focal cortical dyspla-sia，F(xiàn)CD)在臨床上和難治性癲癇具有重要聯(lián)系，尤其是兒童早期起病的藥物難治性癲癇，但這并不取決于病變的位置和大小，局灶性皮層發(fā)育不良最初由Taylor等于1971年描述，其特征為白質(zhì)神經(jīng)元紊亂、層合障礙和球囊細(xì)胞異常。目前尚未發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作與局灶性皮層發(fā)育不良的位置存在一致的相關(guān)性，也未發(fā)現(xiàn)局灶性皮質(zhì)發(fā)育障礙引起癲癇的具體發(fā)病機(jī)制。本研究利用液氮探針損傷構(gòu)建大鼠腦皮質(zhì)發(fā)育障礙模型，通過免疫組織化學(xué)方法(SABC法)，觀察微腦回及其周圍免疫組化Glu及NMDAR1、GluR2的表達(dá)。其神經(jīng)組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色的重要表現(xiàn)如下：(

1

)在手術(shù)組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組模型大鼠大腦皮質(zhì)及海馬均可見Glu及NMDAR1、GluR2免疫著色陽(yáng)性神經(jīng)元的普遍表達(dá)，在手術(shù)組可見典型微腦回結(jié)構(gòu)形成；(

2

)在手術(shù)組大鼠微腦回周圍Glu及NMDAR1、GluR2陽(yáng)性著色細(xì)胞表達(dá)較正常對(duì)照組及假手術(shù)組顯著增加，正常對(duì)照組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它包括杏仁核及海馬等腦區(qū)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元沒有顯著改變。通過查閱文獻(xiàn)，這些結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致，氨基酸及相關(guān)受體陽(yáng)性率表達(dá)增加，周圍神經(jīng)元興奮性也隨之增加，意味著癲癇發(fā)生率增加。

雖然從損傷大腦皮質(zhì)的變化研究中可以找到一些線索，氨基酸及其受體的含量變化可以為癲癇的發(fā)作提供病理基礎(chǔ)，在本次研究中觀察到微腦回周圍的Glu、NMDAR1、GluR2含量有明顯的升高，在海馬、杏仁核等區(qū)域沒有顯著變化，可以認(rèn)為微腦回周圍高興奮狀態(tài)是由Glu水平升高引起，然后在正常神經(jīng)元與異常神經(jīng)元之間形成異常放電并以某種方式擴(kuò)散，本研究可以認(rèn)為皮質(zhì)發(fā)育不良為異常放電的起始部位，正常的大腦皮層也可能會(huì)參與。因此,可以認(rèn)為微腦回周圍興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如Glu)及其受體的增加引起興奮突觸機(jī)制增強(qiáng)，引起癲癇發(fā)作，這可能是微腦回導(dǎo)致癲癇的重要機(jī)制之一，同樣基因水平、信號(hào)傳導(dǎo)通路也可能改變。眾所周知，AMPA和NMDA受體亞基過表達(dá)導(dǎo)致局灶性皮層發(fā)育不良神經(jīng)元刺激狀態(tài)增加可以誘發(fā)癲癇發(fā)作，而在大腦皮層中，約70%～80%的神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元，Glu和GABA能神經(jīng)元構(gòu)建了基本的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，因此，當(dāng)微腦回皮質(zhì)周圍Glu及其受體發(fā)生變化，神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)也隨之改變。

癲癇的發(fā)生是這些未成熟細(xì)胞、成熟細(xì)胞和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之間相互交流的結(jié)果，抑制性和興奮性神經(jīng)遞質(zhì)失衡是局灶性皮層發(fā)育不良癲癇發(fā)生的已知機(jī)制。從解剖學(xué)方面研究獲知，在微腦回區(qū)附近有過多的丘腦傳入纖維,由興奮性氨基酸能神經(jīng)元構(gòu)成，因此當(dāng)這部分正常傳入纖維缺失時(shí)會(huì)引起局部微腦回的投射纖維區(qū)紊亂和增加,這些為興奮和抑制平衡的廣泛破壞提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。有研究認(rèn)為,在發(fā)育不良皮質(zhì)的興奮毒性環(huán)境中，Glu對(duì)癲癇發(fā)作的作用不如GABA那么重要;且本研究?jī)H觀察免疫組織化學(xué)，缺少行為學(xué)觀察及組織和細(xì)胞學(xué)觀察，這些有待于進(jìn)一步深入研究。