基于牡荊素的綠豆大曲質(zhì)量控制方法研究

譚利, 高廷會，王松濤，黃張君，李陽，沈才洪，國錦琳

馬王堆《十問》記載“酒者，五谷之精氣也…故以為百藥由?！薄稘h書·食貨志》：“酒為百藥之長”。藥酒同源，從馬王堆以來藥酒處方歷代傳承創(chuàng)新。近代以來，國內(nèi)外許多機構(gòu)開展酒精損害人體的實驗，但白酒不是酒精[1]，添加含有明確藥用價值的功效成分的養(yǎng)生保健酒也不再是傳統(tǒng)意義上的白酒。

綠豆為豆科植物綠豆（Phaseolus radiatusL.）的種子，又名青小豆、菉豆、植豆等，在歷代本草中記載綠豆能清熱，補益元氣，解酒食等。《本草綱目》記載：“綠豆，消腫治痘之功雖同于赤豆，而清熱解毒之力過之?？伞敖饨鹗?、砒霜、草木一切諸毒”[2]?！堕_寶本草》中記載綠豆：“主丹毒煩熱，風疹，熱氣奔豚，生研絞汁服。亦煮食，消腫下氣，壓熱解毒。” 《普濟方》記載綠豆能治癰腫瘡毒。清熱解毒，以消癰腫?？蓮V泛用于熱毒、瘡癰腫毒?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)綠豆的主要生理活性成分為黃酮、多糖、多肽等[3-4]，有增強機體免疫功能、抗炎、抗腫瘤、保肝、利尿、抗氧化等作用[5-12]。

綠豆大曲是以綠豆為主的復方提取液制成的養(yǎng)生酒，具有潛在的保肝功效。綠豆保肝作用的主要生理活性成分是黃酮類成分，牡荊素是綠豆黃酮的主要成分，占比達到98%[13]，文獻報道牡荊素在綠豆粉末中檢測含量為1.04~1.71 mg﹒g-1[14]。養(yǎng)生酒的質(zhì)量評價一般采用功效成分指標[15-18]，目前綠豆大曲尚未確定功效成分質(zhì)控指標。本研究應用HPLC-MS/UVD篩選綠豆大曲中與綠豆提取液共有的黃酮成分，將其作為質(zhì)控指標建立質(zhì)控方法對綠豆大曲功效成分添加的一致性進行質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 材料與試劑

由瀘州老窖股份有限公司提供20批酒樣，A類酒樣（酒精度標示值41.8%vol）10批次（批號210101-210110），B類酒樣（酒精度標示值51.8%vol ）10批次（批號210101-210110）。

無水乙醇為分析純，購買自成都市科隆化學品有限公司。牡荊素（CAS號3681-93-4，批號17022705）購買自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，對照品質(zhì)量分數(shù)≥98%。乙腈、甲醇純度為色譜級，購買自Fisher公司，水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-系列電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司），SB-120DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），SIGMA 318-KS冷凍離心機（德國SIGMA公司），LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司），LC-MS-2020型單四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司），ME204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），GM-1.0A 隔膜真空泵（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取牡荊素約0.0010 g，60%乙醇定容至5 mL，配制0.20 mg﹒mL-1牡荊素標準溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取綠豆粉末2 g（精度至 0.1 mg）于50 mL離心管中，加入 60%乙醇 40 mL，超聲萃取 90 min，6000 r﹒min-1離心 10 min，溫度20 ℃，收集上清液；用60%乙醇定容至50 mL，得綠豆提取液；綠豆大曲和基酒樣本由瀘州老窖股份有限公司提供，不做其他處理，直接分析。

2.3 酒樣中牡荊素定性分析

2.3.1 色譜條件InfinityLab Poroshell 120 EC- C 18（4.6 mm×100 mm，2.7 Micron）色譜柱；以乙腈（A）和超純水（B）為流動相；梯度洗脫：0 ~ 10 min，5 ~ 20% A；10 ~ 15 min，20～40% A；15 ~ 25 min，40% A；25 ~ 50 min，40～100% A；50~ 60 min，100% A；60～60.1min，100～5%A。流速0.3 mL﹒min-1；柱溫40 ℃[19]。

2.3.2 質(zhì)譜檢測采用LCMS-2020單四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，采用選擇離子模式（SIM），選擇負離子模式，檢測離子m/z（-）431.0。霧化氣流量：1.5 L﹒min-1，干燥氣流量15 L﹒min-1。[20]

2.3.3 分析結(jié)果 由牡荊素標準溶液HPLC-UVD檢測色譜圖（圖1），可見牡荊素在該色譜條件下保留時間為16.3 min。HPLC-MS選擇離子模式（SIM）檢測綠豆提取液與綠豆大曲中的牡荊素分子離子m/z(-)431.0色譜圖（圖2）中在16.3 min處均有峰，說明兩樣品中均有牡荊素，牡荊素為綠豆提取液與綠豆大曲共有黃酮成分。

為明確酒樣中的牡荊素來源，比較了綠豆大曲與其配制基酒在上述相同條件分析的HPLC-UVD色譜圖（圖3），可見16.3 min處綠豆大曲色譜峰，該峰峰面積占比為52.2%，而基酒色譜圖無此峰，說明基酒中無牡荊素?？纱_定綠豆大曲中的牡荊素來源于綠豆復方提取液。因此，篩選出牡荊素作為對綠豆大曲中添加綠豆提取液一致性的質(zhì)控指標。

2.4 酒樣中牡荊素含量測定

2.4.1 色譜條件同“2.3.1”。

2.4.2 紫外檢測采用LC-20AD型高效液相色譜儀(日本島津公司) ，紫外可見光檢測器，檢測波長300 nm；進樣量5 μL。

2.4.3 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于1 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度線。配制成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg﹒mL-1系列濃度的標準溶液。按照“2.3.1”的色譜條件進行分析。以對照品濃度C（mg﹒mL-1）為橫坐標，以峰面積積分值A(chǔ)為縱坐標，經(jīng)過回歸處理后得回歸方程為：A=2*107C-29818，R值為0.9996，線性范圍為0.02~0.12 mg﹒mL-1，表明在此濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.4.4 供試品溶液中牡荊素含量的測定 參照“2.3.1”和“2.4.2”的方法對瀘州老窖股份有限公司提供的20批酒樣進行測定，20批酒樣含量測定結(jié)果見表1。由表1可見兩類綠豆大曲中牡荊素濃度范圍為0.03~0.07mg﹒mL-1。

表1 綠豆大曲中牡荊素的濃度（mg﹒mL-1）

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份綠豆大曲溶液，在“2.3.1”色譜條件下，分別在0、2、4、8、16、24h進樣，記錄不同時間測得的牡荊素的峰面積。穩(wěn)定性試驗計算得RSD值為2.59%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好；

2.4.6 精密度試驗 精密吸取綠豆大曲供試品溶液，在“2.3.1”色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄牡荊素的峰面積。精密度試驗計算得RSD為2.43%，小于5%，表明儀器精密度良好；

2.4.7 重復性試驗 取同一批綠豆大曲制備6份樣品，在“2.3.1”色譜條件下測定，記錄牡荊素的峰面積，計算其質(zhì)量分數(shù)。重復性試驗計算得RSD值為0.81%，證明方法重復性良好；

2.4.8 加樣回收率試驗 精密量取6份已知牡荊素含量的同一批綠豆大曲，每份0.50 mL，精密加入牡荊素對照品溶液0.15mL，混勻，按“2.3.1”的色譜條件測定峰面積，計算其回收率。加樣回收率試驗計算得牡荊素的平均回收率為103.8%，RSD為2.78%（n =6），符合要求。

表2 綠豆大曲酒樣加樣回收率實驗結(jié)果

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

2.3.1 使用GraphPad Prism 9對兩批數(shù)據(jù)進行分析 采用Nested 作圖方式對兩批數(shù)據(jù)離散程度進行分析。繪制樣品牡荊素濃度分布圖（圖4），B類酒樣中存在異常值，認為異常值樣品不符合制訂一致性標準的樣品要求，因此將該樣品數(shù)據(jù)去掉后計算綠豆大曲兩類樣品牡荊素濃度均值分別為0.04 mg﹒mL-1和0.06 mg﹒mL-1。

2.3.2 使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行分析處理 采用獨立樣本T檢驗比較兩類酒樣牡荊素含量是否有顯著性差異。經(jīng)SPSS分析P=0.003，以p<0.05判斷兩類酒樣牡荊素含量有顯著性差異，因此兩類酒樣需要分別制定質(zhì)量控制標準。以符合一致性樣品牡荊素均值的80%為標準，制定指標值為A類酒樣牡荊素濃度不低于0.03mg﹒mL-1，B類酒樣牡荊素濃度不低于0.05 mg﹒mL-1。

3 討論與結(jié)論

在對黃酮類成分的檢測中，綠豆提取液除牡荊素之外，蕓香柚皮苷、山奈酚-3-O-葡萄糖甙、二氫槲皮素、蘆丁、葛根素等多種黃酮成分亦有檢出，但含量遠低于牡荊素，當綠豆提取液作為添加原料調(diào)制為綠豆大曲，僅有含量高的主要黃酮成分牡荊素能被檢出。同時，經(jīng)檢測驗證，綠豆大曲中的牡荊素來源于綠豆提取液而非調(diào)配用基酒，因此選擇牡荊素作為質(zhì)控指標。

常規(guī)酒樣用總酸、總酯、風味物質(zhì)等進行質(zhì)控，本文旨在從保健酒的功效成分篩選質(zhì)控指標，突出保健酒的質(zhì)控特點。綠豆大曲中添加的主要功效原料是綠豆，牡荊素是綠豆中主要黃酮類成分，在綠豆大曲的質(zhì)量控制中采用牡荊素為化學成分指標具有定性和定量兩方面的意義，定性方面是確定在綠豆大曲中加入了以綠豆為原料的功效組分，確保綠豆大曲養(yǎng)生酒的基礎(chǔ)物質(zhì)穩(wěn)定；定量方面意義則是功效成分的加入濃度對產(chǎn)品的影響得到控制，以及有效成分含量在生產(chǎn)過程中得到保證。從此次測定結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，以牡荊素含量來指控樣品酒的質(zhì)量，能夠發(fā)現(xiàn)不同批次樣品酒中的異常值，反映了該指標能表征樣品間的不一致情況，說明了指標選擇的合理性。

根據(jù)此篇文章研究表明，原料明確的養(yǎng)生酒在選擇質(zhì)控指標時，優(yōu)先考慮從主要原料中選擇功效明確且含量較多的成分作為指標成分，這也為養(yǎng)生酒行業(yè)其他類產(chǎn)品制定質(zhì)量標準提供了一定的思路與方法。

方法學考察結(jié)果顯示，樣品測定的穩(wěn)定性、精密度、重復性等均是符合要求的，選擇HPLC-UVD測定綠豆大曲中的有效成分含量準確、快速。此次實驗不足之處，樣本量少，測出的結(jié)果僅供初步參考，整個產(chǎn)品的質(zhì)量控制標準有待于進一步分析驗證。保健酒中來源于功效添加原料的主要功效成分可作為質(zhì)控指標，為對產(chǎn)品功效添加一致性提供定性定量方法。