mlnB基因敲除對(duì)解淀粉芽孢桿菌W1殺螨活性的影響

黃莎莎，何鵬飛，何月秋，李興玉，吳毅歆

( 1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)與信息工程學(xué)院，昆明 650201)

【研究意義】解淀粉芽孢桿菌W1是實(shí)驗(yàn)室從一種自然死亡的二斑葉螨中分離出來(lái)的，具有很強(qiáng)的導(dǎo)致二斑葉螨死亡的能力。通過(guò)研究可為二斑葉螨的防治提供一種新的微生物資源和防治策略，為后續(xù)開(kāi)發(fā)利用更多微生物資源奠定基礎(chǔ)，也為新型微生物殺螨劑的研發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】二斑葉螨是一種分布于世界各溫帶、亞熱帶地區(qū)的害螨。寄主植物種類(lèi)廣泛，共有140多個(gè)科1100余種[1]，嚴(yán)重為害蔬菜、花卉、果樹(shù)和溫室栽培等經(jīng)濟(jì)作物。該螨以刺吸式口器吸取植物的汁液,幼螨、若螨和成螨均能危害寄主的葉片、芽和嫩莖[2]。因其具有個(gè)體小、世代短、繁殖快、寄主廣、適應(yīng)性強(qiáng)及易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，極易爆發(fā)成災(zāi)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的影響[3]。因此，二斑葉螨防治成為農(nóng)作物蟲(chóng)害亟待解決的重要問(wèn)題之一。目前常用的防治手段包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治，但農(nóng)業(yè)防治周期長(zhǎng)、可控性小，而化學(xué)防治雖見(jiàn)效快，但可持續(xù)利用性低、易產(chǎn)生抗藥性且對(duì)環(huán)境污染大等缺點(diǎn)，生物防治具有不易產(chǎn)生抗性、對(duì)環(huán)境安全等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注。生物防治中主要是利用捕食螨且均已不同程度商品化利用[4]。而微生物中具有殺螨效果的主要群體是真菌，有研究報(bào)道新接霉屬的一些種在很多作物上寄生于葉螨[5-7]。豹斑毒鵝膏菌、褐鱗環(huán)柄菇、被毛孢屬以及頂孢霉屬等對(duì)二斑葉螨具有致病性[8-10]。而關(guān)于細(xì)菌有殺螨活性的報(bào)道少，目前研究最多的是蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisBerliner，簡(jiǎn)稱Bt)和內(nèi)共生菌Wolbachia。研究發(fā)現(xiàn)，Bt除了對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)有高效殺蟲(chóng)活性外[11]，對(duì)朱砂葉螨的幼螨、若螨、成螨具有毒殺作用，對(duì)幼螨的毒殺作用效果最好，其次生代謝產(chǎn)物蘇云金素對(duì)二斑葉螨幼螨的毒殺作用高效且無(wú)選擇性[12-14]。Macrolactins是一類(lèi)具有抗菌活性的新型大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物，由深海細(xì)菌、放線菌屬和芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)生。目前，對(duì)macrolactins類(lèi)物質(zhì)研究最多的是大環(huán)內(nèi)酯A，它最早是由Gustafson等[15]從一些未分類(lèi)的深海細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)。研究表明，大環(huán)內(nèi)酯A具有選擇性的抗菌活性，除此之外還能夠抑制B16-F10小鼠黑色素瘤癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及哺乳動(dòng)物單純性皰疹病毒的增殖，也能通過(guò)抑制艾滋病病毒的復(fù)制以此來(lái)保護(hù)淋巴細(xì)胞[15]。Lee等[16]于2003年從土壤中分離鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌 CHO104,并從其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯A，對(duì)Staphylococcusaureus、Eescherichiacoli、Botrytiscinerea等有很強(qiáng)的抑制作用。但對(duì)其具有殺蟲(chóng)活性的報(bào)道少見(jiàn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)解淀粉芽孢桿菌W1的次級(jí)代謝產(chǎn)物的活性化合物進(jìn)行研究，已確定其對(duì)紅蜘蛛的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)為二酮哌嗪類(lèi)，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)及巨桿菌素類(lèi)等化合物[17]。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物中以大環(huán)內(nèi)酯A為主要?dú)Ⅱ钚晕镔|(zhì)，而大環(huán)內(nèi)酯A是由mln基因簇調(diào)控合成，通過(guò)基因敲除技術(shù)構(gòu)建mlnB基因缺陷突變體，研究其對(duì)殺螨抑菌活性的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)同源重組構(gòu)建大環(huán)內(nèi)酯生物合成缺陷突變體并利用PCR和HPLC-MS/MS技術(shù)驗(yàn)證，檢測(cè)其殺螨抑菌活性，為解淀粉芽孢桿菌W1殺螨活性的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

大腸桿菌TG1、解淀粉芽孢桿菌以及供試植物病原細(xì)菌(大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯病菌)均使用LB固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。除供試植物病原真菌的培養(yǎng)溫度為30 ℃外，大腸桿菌和解淀粉芽孢桿菌均置于37 ℃培養(yǎng)；液體振搖培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為160 r/min。所使用的抗生素種類(lèi)及終濃度分別如下：氨芐青霉素100 μg/mL(大腸桿菌)、氯霉素10 μg/mL(解淀粉芽孢桿菌)及卡那霉素30 μg/mL(解淀粉芽孢桿菌)。

二斑葉螨飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室溫室的玉米(會(huì)單4號(hào))幼苗植株上。阿維菌素由安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 敲除載體pBS-mlnB-kanR的構(gòu)建

研究所用的引物見(jiàn)表1。為獲取解淀粉芽孢桿菌W1的大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體，以大環(huán)內(nèi)酯生物合成基因簇mln中的基因成員mlnB為敲除對(duì)象，構(gòu)建對(duì)應(yīng)的敲除質(zhì)粒。

構(gòu)建的基本流程如下：首先使用引物mlnB-F/mlnB-R擴(kuò)增出解淀粉芽孢桿菌W1菌株體內(nèi)mlnB部分序列(此片段中央處含有單個(gè)Hind III切點(diǎn))；利用膠回收純化試劑盒回收靶標(biāo)條帶，BamHI/XhoI雙切，隨后將之克隆到被相同酶組合消化的pBS(即pBluescript)質(zhì)粒內(nèi)部，即生成中間載體pBS-mlnB；Hind III單切pMD18-kanR，膠回收含有卡那霉素抗性基因的條帶，然后插入到Hind III單切且去磷酸化的pBS-mlnB，即獲得最終的敲除載體pBS-mlnB-kanR。

1.3 解淀粉芽孢桿菌W1-comK的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化

參照前人采用的方法[18]，以IPTG為誘導(dǎo)物，誘導(dǎo)解淀粉芽孢桿菌W1-comK(胞內(nèi)含有pHT01-comK[17]的W1菌株)形成自然感受態(tài)，完成pBS-mlnB-kanR向解淀粉芽孢桿菌W1-comK自然感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。37 ℃培養(yǎng)16～24 h后，在含有卡那霉素的LB瓊脂平板上挑選轉(zhuǎn)化子。

采用水煮凍融法快速提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，以DNA為模板，使用表1中的引物PCR擴(kuò)增。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶的有無(wú)以及長(zhǎng)度是否符合預(yù)期，并送交PCR產(chǎn)物給昆明擎科生物技術(shù)公司測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果以確認(rèn)卡那霉素抗性基因是否被整合插入到轉(zhuǎn)化子mlnB基因內(nèi)部。將正確的重組子轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振搖過(guò)夜。次日，加入等體積無(wú)菌40%(v/v)甘油，均勻混合后，-80 ℃冰箱保存。

表1 研究所使用的引物

1.4 解淀粉芽孢桿菌W1菌株大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的HPLC-MS/MS驗(yàn)證

1.4.1 樣品前處理 從-80 ℃冰箱中取出所保存的解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體甘油菌，待其呈熔融狀態(tài)，使用無(wú)菌接種環(huán)蘸取少許甘油菌液體，劃線于含有卡那霉素的LB瓊脂平板。37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，接種到試管內(nèi)裝有5 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。然后，按1∶100的接種比例轉(zhuǎn)接入裝有50 mL含卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，37 ℃振搖培養(yǎng)。72 h后，12 000 r/min室溫離心2 min，收集上清液。使用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后稱重。使用甲醇溶解乙酸乙酯萃取出的蒸干產(chǎn)物，隨后用0.22 μm孔徑的纖維素微孔濾膜過(guò)濾，獲得無(wú)菌的萃取物甲醇飽和液，貼好標(biāo)簽即可上樣。野生型W1也是同樣的操作，只是培養(yǎng)基中無(wú)需加入抗生素。

1.4.2 色譜條件 色譜柱使用UltimateAQ-C18柱，流動(dòng)相為甲醇/水(含甲酸)，梯度洗脫條件及操作

見(jiàn)表2，流速控制為1 min/mL。柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI 離子源；掃描方式：正、負(fù)離子掃描；檢測(cè)器電壓：1.70 kV；CDL溫度：200 ℃；加熱模塊溫度：200 ℃；霧化氣：氮?dú)猓?.5 L/min；干燥氣：氮?dú)猓?.5 L/min；碰撞氣：氬氣；采集范圍：一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜均為m/z 100-1500。

1.5 W1 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性

分別在LB瓊脂平板內(nèi)劃線培養(yǎng)出解淀粉芽孢桿菌W1野生型及其大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體、白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌和茄科青枯病菌的單菌落。挑取各菌株的單菌落，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基內(nèi)振搖培養(yǎng)。36 h后，利用10倍稀釋法測(cè)定芽孢桿菌和供試植物病原細(xì)菌培養(yǎng)物的菌體細(xì)胞濃度，將芽孢桿菌和植物病原細(xì)菌的濃度分別調(diào)整為106和107CFU/mL。取病原菌菌液(107CFU/mL)200 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)平板(9.0 cm)，超凈臺(tái)吹干平板表面水分；使用移液槍吸取上述芽孢桿菌菌液(106CFU/mL)各2.0 μL，分別滴加至表面涂有植物病原細(xì)菌的固體平板上(4點(diǎn)/皿)。30 ℃恒溫培養(yǎng)數(shù)天不等，觀察芽孢桿菌菌落生長(zhǎng)情況及其周?chē)袩o(wú)抑菌圈。

1.6 W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的殺螨活性

解淀粉芽孢桿菌W1菌株大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對(duì)二斑葉螨的毒殺活性采用玻片浸漬法[19]進(jìn)行，具體細(xì)節(jié)略有改動(dòng)，主要是將其中的載玻片替換成毛細(xì)管。選取行動(dòng)活潑、大小一致的成螨個(gè)體，毛細(xì)管黏附成螨背部(20頭活螨/根)。將上述毛細(xì)管浸于W1野生型或其突變體培養(yǎng)物(108CFU/mL)內(nèi)5 s，取出并使用濾紙吸干殘留菌液。定時(shí)用毛筆輕觸螨體觀察其反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)各處理組的成螨死亡情況。以對(duì)照組死亡率小于5%為有效試驗(yàn)[20]，按下式計(jì)算出各組的校正死亡率。

死亡率(%)=死亡蟲(chóng)數(shù)(頭)/處理總蟲(chóng)數(shù)(頭)×100

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100

以阿維菌素(3000倍液)和稀釋相同倍數(shù)的無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基分別為正、負(fù)對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)有3次重復(fù)。獨(dú)立重復(fù)此試驗(yàn)至少3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 敲除載體pBS-mlnB-kanR 的構(gòu)建

通過(guò)0.8%(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)引物對(duì)mlnB-F/R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，可見(jiàn)在與250 bp I型 DNA Marker(上海捷瑞)中的2.0 kb條帶水平位置處下方有清晰的單一亮帶(圖1-A)，表明含有部分mlnB編碼基因的片段(1584 bp)被成功地從W1菌株中擴(kuò)增出來(lái)。菌落PCR檢測(cè)結(jié)果還顯示，mlnB片段已插入到pBS內(nèi)部(圖1-B)。mlnB-F/R的菌液PCR產(chǎn)物檢測(cè)顯示，卡那霉素抗性基因順利地克隆到中間載體pBS-mlnB(圖1-C)，獲得最終的敲除載體pBS-mlnB-kanR。最終載體pBS-mlnB-kanR的Hind III單切產(chǎn)物電泳帶型(圖1-D)也表明，kanR已插入到中間載體pBS-mlnB內(nèi)部。

A：mlnB的PCR擴(kuò)增(CK擴(kuò)增模板為ddH2O)；B：攜帶pBS-mlnB的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液PCR(1～8道擴(kuò)增模板為轉(zhuǎn)化子，CK和W1分別為負(fù)和正對(duì)照)；C：攜帶pBS-mlnB-kanR的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子菌液PCR(1～6道擴(kuò)增模板為轉(zhuǎn)化子，CK和W1分別為負(fù)和正對(duì)照)；D：Hind III分別切pBS-mlnB和pBS-mlnB-kanR的電泳檢測(cè)(1道為pBS-mlnB，2道為和pBS-mlnB-kanR);M:DNA marker；箭頭:本實(shí)驗(yàn)最終選擇的攜帶pBS-mlnB和pBS-mlnB-kanR的大腸桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

2.2 解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的構(gòu)建

通過(guò)IPTG人工誘導(dǎo)W1-comK菌株形成自然感受態(tài)及隨后轉(zhuǎn)化導(dǎo)入整合型敲除載體pBS-mlnB-kanR等操作，在含有卡那霉素的LB平板發(fā)現(xiàn)有多個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落。從中隨機(jī)挑取13個(gè)抗性轉(zhuǎn)化子，通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)從大部分轉(zhuǎn)化子的基因組DNA中均能擴(kuò)增到與kanR大小相近的條帶(1.1 kb，圖2-A)，PCR產(chǎn)物的測(cè)序分析顯示其序列與金黃色葡萄球菌pUB110質(zhì)粒內(nèi)部卡那霉素抗性基因一致性達(dá)95.6%(數(shù)據(jù)未顯示)。使用最外圍引物mlnB-F/R從突變體中擴(kuò)增出的產(chǎn)物電泳位置明顯高于以W1野生型基因組DNA為模板所擴(kuò)增的，與陽(yáng)性對(duì)照(敲除載體pBS-mlnB-kanR為擴(kuò)增模板)的相接近(圖2-B)，表明卡那霉素抗性基因的確被成功地整合插入到解淀粉芽孢桿菌W1菌株的mlnB基因內(nèi)部。故將此大環(huán)內(nèi)酯合成突變體命名為解淀粉芽孢桿菌W1-comK △mlnB::kanR。

A：mlnB-F/R的PCR擴(kuò)增檢測(cè)(1～12道擴(kuò)增模板為W1 ΔmlnB::kanR轉(zhuǎn)化子；13道擴(kuò)增模板為質(zhì)粒pBS-mlnB-kanR為陽(yáng)性對(duì)照：W1作為陰性對(duì)照，CK為空白對(duì)照)；B：卡那霉素抗性基因表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增檢測(cè)(2～13道擴(kuò)增模板為W1 ΔmlnB:kanR轉(zhuǎn)化子；1道擴(kuò)增模板為質(zhì)粒pMD18-kanR作為陽(yáng)性對(duì)照，W1作為陰性對(duì)照，CK為空白對(duì)照);M:DNA marker；箭頭:本實(shí)驗(yàn)最終選擇的攜帶pBS-mlnB-kanR的解淀粉芽孢桿菌陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

2.3 解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR發(fā)酵上清的HPLC-MS/MS質(zhì)譜分析

從pubchem網(wǎng)站上查到化合物大環(huán)內(nèi)酯A的相對(duì)分子量(Mr)為402.241 Da。圖3-A為野生型W1在47.288 min時(shí)的一級(jí)質(zhì)譜圖，正離子模式下，該化合物的[Mr+Na]+和[Mr+K]+的離子峰分別為425.224和441.251 Da，可斷定其分子量為402 Da,與pubchem網(wǎng)站上查詢結(jié)果一致，推測(cè)此化合物為大環(huán)內(nèi)酯A。根據(jù)其二級(jí)質(zhì)譜圖(圖3-C)可推測(cè)其斷裂方式如圖3-B所示。相同時(shí)間點(diǎn),將解淀粉芽孢桿菌W1大環(huán)內(nèi)酯合成突變體發(fā)酵上清的HPLC/MS結(jié)果與其野生型相對(duì)比(圖4-A)，雖然大環(huán)內(nèi)酯合成突變體在一級(jí)質(zhì)譜中也有此兩類(lèi)信號(hào)，但與W1野生型相對(duì)應(yīng)的信號(hào)峰在二級(jí)質(zhì)譜圖中沒(méi)有再出現(xiàn)(圖4-B)，表明突變體因大環(huán)內(nèi)酯合成基因簇成員基因mlnB被插入破壞而不再合成大環(huán)內(nèi)酯A。

A：以正離子模式檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯A的一級(jí)質(zhì)譜；B：推測(cè)大環(huán)內(nèi)酯A的二級(jí)質(zhì)譜的斷裂方式；C：以正離子模式檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯A的二級(jí)質(zhì)譜

A：以正離子模式檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯A的一級(jí)質(zhì)譜；B：以正離子模式檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯A的二級(jí)質(zhì)譜

2.4 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷對(duì)解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR病原拮抗活性的影響

如圖5所示，在解淀粉芽孢桿菌W1野生型及其大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的菌落周?chē)](méi)有看到肉眼可見(jiàn)的透明抑菌圈，但明顯可見(jiàn)W1野生型菌落，而突變體菌落色澤較淡，與供試植物病原細(xì)菌的界限不清晰，顯示野生型菌株在表面長(zhǎng)滿有供試植物病原細(xì)菌的LB瓊脂平板中仍有一定的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，但大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷削弱了突變體在上述平板對(duì)柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌及茄科青枯病菌的拮抗活性。

A：白菜軟腐病菌；B：柑橘潰瘍病菌；C：大白菜黑腐病菌；D：茄科青枯菌；垂直方向上點(diǎn)樣菌落均為野生型W1,水平方向上點(diǎn)樣菌落均為缺失突變體W1 ΔmlnB::kanR

2.5 大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷對(duì)解淀粉芽孢桿菌W1-comK ΔmlnB::kanR殺螨活性的影響

在4個(gè)處理組中，浸蘸阿維菌素的處理組二斑葉螨的死亡率最高(91.67%～93.33%)，W1野生型菌株次之(73.33%～77.22%)，而大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體的殺螨活性(26.67%)僅高于液體LB(3.89%～4.44%)，顯著低于野生型(圖6)。定時(shí)檢測(cè)結(jié)果顯示在W1野生型、阿維菌素和液體LB對(duì)照組3個(gè)處理組中，成螨死亡率6 h后的均略高于30 min的，而突變體卻并未表現(xiàn)這一點(diǎn)。

圖6 野生型W1與缺失突變體W1 ΔmlnB::kanR殺螨活性測(cè)定

3 討 論

解淀粉芽孢桿菌是一種被廣泛研究的微生物,其基因組中有至少4%～5%的基因信息與抗生素的合成相關(guān),大約能夠合成二十幾種拮抗物質(zhì)[21]。在這些拮抗物質(zhì)中,surfactin和iturinA家族是研究和發(fā)現(xiàn)最多的,不同家族的脂肽可以讓芽孢桿菌在各種生境與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)中保持優(yōu)勢(shì)[22]。除了在制酶等工業(yè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用外，解淀粉芽孢桿菌還是一類(lèi)重要的植物生防資源，表現(xiàn)出良好的植物促生、抗逆以及病蟲(chóng)害防控特性[23-25]。解淀粉芽孢桿菌AG1菌株合成表面活性物質(zhì)被證實(shí)可破壞番茄斑潛蠅幼蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞的完整性，從而具有殺蟲(chóng)活性[25]。前期研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌W1菌株毒殺二斑葉螨的活性物質(zhì)較為多樣，其中大環(huán)內(nèi)酯(Macrolactin)在其中扮演著重要角色[17]。不同于合成大環(huán)內(nèi)酯A、7-O-丙二酰大環(huán)內(nèi)酯A及7-O-琥珀酰大環(huán)內(nèi)酯A的解淀粉芽孢桿菌NJN-6[26]及合成大環(huán)內(nèi)酯A、大環(huán)內(nèi)酯D、7-O-丙二酰大環(huán)內(nèi)酯A及7-O-琥珀酰大環(huán)內(nèi)酯A的解淀粉芽孢桿菌FZB42[27]，通過(guò)研究W1菌株發(fā)酵上清液中目前只檢測(cè)到合成了其中的大環(huán)內(nèi)酯A，與另一株近緣海洋細(xì)菌——解淀粉芽孢桿菌ESB-2相類(lèi)似[28]，表明大環(huán)內(nèi)酯合成及后續(xù)加工修飾可能會(huì)因菌株種類(lèi)不同而有所差異。

研究發(fā)現(xiàn)相比于野生型，mlnB發(fā)生突變的W1菌株對(duì)白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌以及茄科青枯病菌的抑制活性均下降，但兩者均未看到常見(jiàn)的透明抑菌圈，僅能通過(guò)自身菌落生長(zhǎng)來(lái)判斷，這可能與植物病原細(xì)菌和生防芽孢桿菌的數(shù)量比例不理想等原因有關(guān)。需更有力的數(shù)據(jù)來(lái)支持W1大環(huán)內(nèi)酯合成缺陷突變體對(duì)植物病原細(xì)菌的拮抗活性出現(xiàn)削弱跡象。但拮抗活性試驗(yàn)結(jié)果仍說(shuō)明解淀粉芽孢桿菌W1合成的大環(huán)內(nèi)酯A具有抑制植物病原細(xì)菌的活性，與前人報(bào)道也相一致[29]。W1菌株作為二斑葉螨生防菌株被應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了其在防治細(xì)菌性病害方面的潛力。

殺螨活性研究則顯示大環(huán)內(nèi)酯A不再合成后，W1-comK ΔmlnB::kanR的殺螨能力下降明顯，再次證實(shí)大環(huán)內(nèi)酯A是解淀粉芽孢桿菌W1菌株殺螨的活性物質(zhì)。浸潤(rùn)W1野生型發(fā)酵液后6 h的成螨死亡率比30 min的成螨死亡率略有增加，而大環(huán)內(nèi)酯突變體卻未表現(xiàn)出這一點(diǎn)，表明W1菌株對(duì)二斑葉螨的殺滅活性有一定的持效期。此特點(diǎn)是否與W1野生型菌株及其大環(huán)內(nèi)酯突變體在害螨體內(nèi)定殖能力差異有關(guān)，尚待研究。

4 結(jié) 論

解淀粉芽孢桿菌W1菌株合成的大環(huán)內(nèi)酯A具有殺二斑葉螨活性，同時(shí)還能抑制大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜黑腐病菌以及茄科青枯病菌。大環(huán)內(nèi)酯A合成受阻后，W1菌株的活性均明顯地被削弱。