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    枸杞糖肽拮抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)雛雞免疫抑制的作用

    2022-06-06 13:32:50王建東唐玉林張寶所楊富強(qiáng)高?;?/span>郭延生
    關(guān)鍵詞:糖肽免疫抑制脾臟

    王建東,唐玉林,王 敏,張寶所,楊富強(qiáng),高?;?,于 洋,郭延生

    (1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所,銀川 750002; 2.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)系,銀川 750021;3.寧夏銀川市婦幼保健院,銀川 750001;4.寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司,寧夏 青銅峽 751600)

    【研究意義】免疫抑制是指動物機(jī)體存在免疫功能障礙,導(dǎo)致免疫力下降,進(jìn)而更容易受到病原的侵害[1]。目前飼料中禁止添加抗生素已成為養(yǎng)殖業(yè)的常態(tài),因此有必要找到一種副作用小且有助于提高畜禽免疫力及生產(chǎn)性能的免疫增強(qiáng)劑,而大量研究表明從植物中提取的多糖具有增強(qiáng)免疫、促生長的作用?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】枸杞子是茄科植物枸杞的成熟果實(shí),在中醫(yī)上具有非常重要的地位,李時(shí)珍就在《本草綱目》中記載其具有滋腎、潤肺、名目的功效。近年來,枸杞作為藥食兼用的名貴資源受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明枸杞子不僅營養(yǎng)十分豐富而且還具有多種保健功能。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)是枸杞生物活性功能的主要有效成分,具有無耐藥性、無殘留、安全、制造工藝簡單等特點(diǎn)[2]。研究表明LBP具有抗氧化[3-4]、抗炎[5]、神經(jīng)保護(hù)[6]、降血糖血脂[7]、免疫調(diào)節(jié)[8-9]等功能。LBP可以誘導(dǎo)NK細(xì)胞活化,增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性,并能夠通過Notch信號誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的表型和功能成熟,并促進(jìn)樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞活性[10]。張海燕等[11]研究發(fā)現(xiàn),在海蘭褐蛋雞日糧中添加50 mg/kg LBP可顯著提高胸腺和法氏囊的重量,增加血清中白蛋白和溶菌酶含量,促進(jìn)血液中CD3+T淋巴細(xì)胞增殖,由此可見,枸杞多糖具有提高機(jī)體免疫功能的臨床功效。而枸杞糖肽(Lyciumbarbarumglycopeptide,LbGp)是從LBP中進(jìn)一步分離純化后得到的具有更強(qiáng)免疫活性的糖綴合物?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】病原微生物、營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理、應(yīng)激和藥物等因素極易誘發(fā)雞群免疫抑制,因此本試驗(yàn)擬研究通過肌注環(huán)磷酰胺(CY)誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生免疫抑制,再通過飲水口服高、中、低劑量的LbGp,以生長狀況、脾臟指數(shù)、外周血液淋巴細(xì)胞增殖率為評價(jià)指標(biāo),再輔以脾臟組織學(xué)切片分析,旨在探討LbGp對CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雞的免疫調(diào)節(jié)作用?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究枸杞糖肽拮抗免疫抑制雛雞的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗(yàn)動物及藥品 1 d齡海蘭蛋雞購自北京市華都峪口禽業(yè)有限公司。枸杞糖肽購自于寧夏天仁枸杞生物科技股份有限公司,試驗(yàn)地點(diǎn)在寧夏順寶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司。

    1.1.2 主要試劑及儀器 環(huán)磷酰胺(貨號:A0505A,大連美侖生物技術(shù)有限公司);雞外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(貨號:LTS1090C,天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司);一次性試驗(yàn)動物靜脈血樣采集容器枸櫞酸鈉抗凝劑(貨號:TBDTM-0001,天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司);中性福爾馬林固定液(10%NBF)(貨號:G2161,索萊寶公司);雞外周血淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基(貨號:CM-C007,武漢普諾賽生命科技有限公司);0.9%氯化鈉注射液(批號:2012171911,陜西圣奧動物藥業(yè)有限公司);電子秤(型號LT502,上海第二天平儀器廠)自;CO2培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)有限公司;組織切片機(jī)(型號:LEICA-RM2235,德國Leica公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 試驗(yàn)分組與處理 將200羽1 d齡海蘭蛋雞,適應(yīng)性飼養(yǎng)至7 d齡后隨機(jī)分成5個(gè)組,每組40羽,即空白組(NC)、環(huán)磷酰胺組(CY)及LbGp高(LbGpH)、中(LbGpM)、低(LbGpL)3個(gè)劑量組,除NC組注射生理鹽水外,其余4組連續(xù)3 d肌注80 mg/(kg·d) CY進(jìn)行造模,造模后LbGp各組連續(xù)7 d分別給予10、5、2.5 mg/(kg·d) LbGp。在首次給藥后的第7、14、21和28 天,每組隨機(jī)選取5只雞稱重,隨后取下脾臟稱重,記錄數(shù)據(jù)計(jì)算脾臟指數(shù),其公式為:脾臟指數(shù)=脾重(g)/體重(g)×100。

    1.2.2 淋巴細(xì)胞增殖測定 在首次給藥后第7、14、21和28天,每組隨機(jī)選取5只雞無菌心臟采血,隨后離心分離淋巴細(xì)胞,培養(yǎng)后采用MTT法測定淋巴細(xì)胞OD490nm值。

    1.2.3 脾臟組織切片 在首次給藥后第7、14、21和28天,每組隨機(jī)選取5只雞處死后取脾臟,將其完全放入10%NBF中,室溫保存3 d,按常規(guī)操作制備石蠟切片后HE染色并鏡檢。

    1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用SPSS 25.0進(jìn)行One-way ANOVA檢驗(yàn)分析各組間的差異顯著性,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重的影響

    由表1可知,在第7、14、21和28天,CY組免疫抑制雛雞的體重均低于其余各組。其中第7天時(shí),NC組體重顯著高于LbGpH、LbGpL和CY組(P<0.05);第14 天時(shí),LbGpM組體重顯著高于CY組和NC組(P<0.05);第21天時(shí),LbGpM組顯著高于LbGpH,LbGpH顯著高于CY組(P<0.05),LbGpM極顯著高于LbGpL、CY和NC組(P<0.01);第27天時(shí),LbGpM組體重顯著高于LbGpH和LbGpL組(P<0.05),LbGpM極顯著高于CY和NC組(P<0.01)。

    表1 枸杞糖肽對雞體重的影響

    2.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞脾臟指數(shù)的影響

    由表2可知,在第7、14、21和28 天,CY組免疫抑制雛雞的脾臟指數(shù)均低于其余各組。第7 天時(shí),NC組顯著高于CY組(P<0.05);第14、21和28天時(shí),LbGpM組均顯著高于CY組(P<0.05)。

    表2 枸杞糖肽對雞脾臟指數(shù)的影響

    2.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

    由表3可知,在第7、14、21和28 天,CY組免疫抑制雛雞的外周血淋巴細(xì)胞OD490 nm值均低于其余各組。其中第7 天時(shí),LbGpM組外周血淋巴細(xì)胞OD490 nm值顯著高于CY組(P<0.05);第14天時(shí),LbGpH、LbGpM和LbGpL組外周血淋巴細(xì)胞OD490 nm值均極顯著高于CY組(P<0.01),NC組顯著高于CY組(P<0.05);第21天時(shí),LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細(xì)胞OD490 nm值極顯著高于NC與CY組(P<0.01);第28天時(shí),LbGpH、LbGpM組外周血淋巴細(xì)胞OD490 nm值極顯著高于LbGpL、NC和CY組(P<0.01)。

    表3 枸杞糖肽對雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響(OD490nm)

    2.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織切片的影響

    如圖1所示,首次給藥后的第7天各組淋巴細(xì)胞分布均勻,分組之間無明顯差異(P>0.05)。如圖2所示,第14 天時(shí)NC組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約為25~30個(gè);CY組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約為20個(gè),且生發(fā)中心縮小,邊緣區(qū)模糊,脾竇增寬;LbGp各組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約40~50個(gè),顯著高于NC和CY組(P<0.05)。如圖3所示,第21 天時(shí)NC、LbGp各組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約為30~40個(gè);CY組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約25~30個(gè),顯著低于NC和LbGp各組(P<0.05),且生發(fā)中心縮小、脾竇增寬。如圖4所示,第28 天時(shí)各組生發(fā)中心個(gè)數(shù)約為30~40個(gè),分組之間無明顯差異(P>0.05)。

    圖1 7 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色,×10)

    圖2 14 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色,×10)

    圖3 21 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色,×10)

    圖4 28 d枸杞糖肽對雞脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響(HE染色,×10)

    3 討 論

    3.1 CY對雛雞免疫功能的影響

    CY是一種烷化劑類藥物,常用于治療自身免疫病和癌癥,具有細(xì)胞毒性作用[12-13],它可以破壞DNA結(jié)構(gòu),干擾其進(jìn)行正常復(fù)制,并導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。有研究表明,CY能降低T細(xì)胞的增殖能力以及減少Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[15],長期使用可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)免疫抑制等嚴(yán)重副作用[16],因此CY常被用來構(gòu)建免疫抑制模型。楊樹寶等[17]在使用CY進(jìn)行雛雞免疫抑制造模,CY組雛雞在體重、脾臟指數(shù)及外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用等指標(biāo)上明顯低于正常組。周亞琳等[18]在使用CY誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫抑制,其脾臟組織學(xué)病理切片鏡檢可見紅髓和白髓界限不清、脾竇增寬,且出現(xiàn)脾臟淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象。本試驗(yàn)結(jié)果顯示CY組出現(xiàn)生長性能抑制、脾臟指數(shù)降低和外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化減弱現(xiàn)象,并且脾臟組織學(xué)切片可見生發(fā)中心縮小、邊緣區(qū)模糊、脾竇增寬,說明本試驗(yàn)雛雞免疫抑制構(gòu)建成功。

    3.2 枸杞糖肽對CY免疫抑制雞體重和脾臟指數(shù)的影響

    體重可直接反映畜禽的生長情況,而脾臟則是畜禽最重要的免疫器官,免疫器官的發(fā)育情況能夠直接影響機(jī)體的免疫功能[19],尤其從脾臟衍生的一些巨噬細(xì)胞亞群能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[20]。因此,通過體重和免疫器官指數(shù)可以在一定程度上反映機(jī)體的生長性能和免疫功能。而已有研究證明,CY可以明顯減少脾臟淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)而導(dǎo)致小鼠生長減緩和免疫器官重量明顯降低[21-22]。同時(shí),研究表明LbGp可以改善肉雞的生長性能[23],可以提高CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)和減輕免疫器官損傷[24],LbGp還能夠增加腸通透性和改變腸道組織學(xué)結(jié)構(gòu),抑制嗜中性粒細(xì)胞積累,降低TNF-α水平,提高脾臟淋巴細(xì)胞增殖率[25]。本研究也發(fā)現(xiàn)LbGp具有能提高CY誘導(dǎo)免疫抑制產(chǎn)蛋雛雞的生長性能和脾臟指數(shù)的作用,其中LbGp中劑量濃度[5 mg/(kg·d)]效果最好。

    3.3 枸杞糖肽對免疫抑制雞外周血淋巴細(xì)胞的影響

    淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在防御機(jī)體疾病方面發(fā)揮著巨大的作用[26]。淋巴細(xì)胞的作用是產(chǎn)生針對細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲和有毒化學(xué)物質(zhì)的抗體,殺死入侵生物和感染細(xì)胞,并釋放細(xì)胞因子以警告其他細(xì)胞存在危險(xiǎn)[27]。外周血淋巴細(xì)胞,是指存在于外周血液循環(huán)中的淋巴細(xì)胞,能夠引起機(jī)體免疫抑制劑量的CY可以導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量迅速減少和免疫器官細(xì)胞異常凋亡[28]。有研究表明,淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的高低也可在一定程度上反映出機(jī)體免疫水平[29]。劉永利等[30]在日糧中添加4 g/kg LbGp可顯著提高肉雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。徐占云等[31]研究發(fā)現(xiàn),在體外培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞液中分別加入4、16、64、256 μg/mL LbGp均能夠促進(jìn)雛雞淋巴細(xì)胞增殖,其中16 μg/mL濃度效果最好。另有研究表明,LbGp可以激活轉(zhuǎn)錄因子NFAT和AP-1,誘導(dǎo)IL-2和IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生,并刺激T細(xì)胞產(chǎn)生Th1細(xì)胞因子,其誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖速度為原來的3~4倍[32]。本試驗(yàn)結(jié)果也證明LbGp可以提高產(chǎn)蛋雛雞外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化作用。

    3.4 枸杞糖肽對免疫抑制雞脾臟組織學(xué)的影響

    生發(fā)中心(GC)是在次級淋巴器官中發(fā)育的專門的微體系結(jié)構(gòu),是B細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生高親和力抗體的區(qū)域,在體液免疫過程中發(fā)揮著重要作用[33]。郝文麗[34]研究發(fā)現(xiàn)LbGp可修復(fù)亞健康小鼠被破壞的脾臟組織結(jié)構(gòu)形態(tài),顯著增加淋巴細(xì)胞數(shù)量,說明LbGp可以起到恢復(fù)脾臟損傷的作用。本試驗(yàn)通過對雞脾臟的組織學(xué)變化的觀察,發(fā)現(xiàn)CY能夠損傷雞脾臟,減少生發(fā)中心數(shù)量和淋巴細(xì)胞數(shù)量,而LbGp能夠在一定程度上促進(jìn)脾臟損傷恢復(fù)。

    4 結(jié) 論

    本試驗(yàn)采用CY誘導(dǎo)雛雞產(chǎn)生免疫抑制狀態(tài),研究LbGp對免疫抑制的拮抗作用,結(jié)果表明LbGp可以顯著提高CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雛雞的生長性能,顯著促進(jìn)脾臟的發(fā)育,加快脾臟因CY帶來損傷的恢復(fù)過程,極顯著提高了CY誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制雛雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力,以LbGp中劑量組[5 mg/(kg·d) ]效果最好。

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