胃癌中p-Stat3和Survivin表達(dá)的病理學(xué)意義及術(shù)前指標(biāo)預(yù)后模型的建立

岳 汶，王曉軍，馬苗苗，張丹丹，潘 鳳，聶佳琪，李曉寧，崔?？担瑮?蘭，張文杰,3

據(jù)GLOBOCAN 2018年統(tǒng)計(jì)報(bào)告，胃癌是世界發(fā)病率排名第五的高發(fā)腫瘤，其病死率排名第三(占癌癥死亡總數(shù)的8.2%)[1]。在我國，胃癌的發(fā)病率為20.7%，位列惡性腫瘤發(fā)病率第4位；病死率為17.5%，在惡性腫瘤中位列第2位。早期胃癌經(jīng)手術(shù)治療后預(yù)后較好[2]，但已進(jìn)入進(jìn)展期胃癌的患者即使接受了手術(shù)治療，其治療效果和術(shù)后生活質(zhì)量均較差，復(fù)發(fā)率較高，預(yù)后也要差于早期胃癌術(shù)后的患者[3]。因此，豐富診斷早期胃癌的手段，實(shí)現(xiàn)胃癌的早診早治，對術(shù)后患者的生存預(yù)后尤為關(guān)鍵。該研究采用術(shù)前多指標(biāo)聯(lián)合檢測的方法預(yù)測胃癌患者術(shù)后生存預(yù)后，并篩選出預(yù)測胃癌術(shù)后生存的最優(yōu)組合，為臨床醫(yī)師制訂治療方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2008年1月—2013年12月于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行胃部腫瘤切除術(shù)的133例患者信息，收集其胃癌及癌旁組織石蠟標(biāo)本，癌旁組織取自對應(yīng)的腫瘤組織邊緣5 cm以外的部位。本研究隨訪時(shí)間截至2019年10月1日。

1.2 試劑免疫組化染色試劑盒(Envision法)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人單抗p-Stat3抗體(Ab17955)、Survivin抗體(Ab76424)購自英國Abcam公司。

1.3 石蠟組織芯片由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對術(shù)后石蠟切片分別進(jìn)行復(fù)片，在癌旁及胃癌組織中選取具有代表性的區(qū)域。將組織從供體蠟塊中取出，接種于受體蠟塊中，制作石蠟組織芯片。

1.4 免疫組化免疫組織化學(xué)使用Envision法染色。芯片組織經(jīng)脫蠟、水洗后，EDTA或枸櫞酸進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)；使用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加一抗(p-Stat3和Survivin)，置于4 ℃冰箱孵育過夜；復(fù)溫后滴加二抗室溫孵育30 min；顯微鏡下觀察DAB顯色，至顯色效果最好時(shí)終止顯色；蘇木精復(fù)染、脫水、晾干、中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判讀p-Stat3和Survivin陽性表達(dá)結(jié)果均為鏡下細(xì)胞核染色由淺黃至深棕褐色顆粒。陽性細(xì)胞數(shù)占比計(jì)分方法：<5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，76%～100%計(jì)4分。著色強(qiáng)度計(jì)分方法：無著色計(jì)0分，淺棕黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩項(xiàng)積分相乘：0～1分計(jì)陰性表達(dá)(-)，2～4分計(jì)為弱陽性表達(dá)(+)，5～8分計(jì)為陽性()，9～12分計(jì)為強(qiáng)陽性 ()。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0以及R studio軟件進(jìn)行分析。通過Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較p-Stat3和Survivin在胃癌和正常胃黏膜之間表達(dá)差異性；同樣采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較p-Stat3和Survivin表達(dá)高低與胃癌術(shù)后患者臨床病理特征的相關(guān)性；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線；使用ROC曲線下面積(AUC)表示各指標(biāo)對于預(yù)測胃癌患者預(yù)后的價(jià)值；使用Cox回歸分析-單因素及多因素分析影響胃癌術(shù)后患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因素；結(jié)合Logistic回歸模型聯(lián)合ROC曲線來描述多指標(biāo)聯(lián)合檢測對患者術(shù)后生存狀態(tài)的預(yù)測價(jià)值；使用R Studio軟件中survival和rms程序包建立列線圖預(yù)測模型；采用Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)分析多指標(biāo)聯(lián)合檢測組合的預(yù)測值與實(shí)際觀測值之間的吻合程度，并繪制校準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁組織中p-Stat3和Survivin的表達(dá)情況在細(xì)胞中p-Stat3和Survivin顯色表達(dá)部位是胞核，胞核被染為棕褐色。圖1顯示p-Stat3和Survivin在癌旁和胃癌組織中的陰性和陽性表達(dá)。

圖1 p-Stat3和Survivin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)Envision ×400A、B：p-Stat3在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)；C、D：Survivin在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)

p-Stat3和Survivin在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)有顯著差異，兩者在胃癌組織中的表達(dá)均高于癌旁組織(P<0.001)，見表1、圖2。由于石蠟組織芯片的切片組織容易脫片，故造成部分結(jié)果缺失，見表1。

表1 胃癌及癌旁組織中p-Stat3和Survivin的表達(dá)差異[n(%)]

圖2 胃癌及癌旁組織中p-Stat3和Survivin的表達(dá)分布與癌旁組織比較：***P<0.001

2.2 胃癌患者的基本情況如表2所示，133例肝癌患者中，男102例，女31例；年齡范圍32～86歲，平均年齡63.65歲；高分化腺癌5例，中分化腺癌38例，低分化腺癌90例；TNM分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期43例，Ⅲ期52例，Ⅳ期14例。使用ROC計(jì)算出Cutoff值，以Cutoff值為界，將丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)分為低水平組與高水平組，ALT的Cutoff值為10.5 U/L(男性和女性)；AST的Cutoff值為14.50 U/L(男性)和19 U/L(女性)。

表2 胃癌患者術(shù)前及術(shù)后指標(biāo)的基本情況

2.3 胃癌組織中p-Stat3和Survivin的表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系表3顯示p-Stat3在胃癌組織中的表達(dá)與浸潤深度(P=0.037)及TNM分期(P=0.017)相關(guān)，而與患者的性別、年齡、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AST及ALT無關(guān)(P>0.05)；Survivin在胃癌組織中的表達(dá)與患者的分化程度(P=0.001)、浸潤深度(P=0.037)相關(guān)，而與患者的性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、ALT及AST無關(guān)(P>0.05)。

表3 癌組織中p-Stat3和Survivin表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

續(xù)表

2.4 p-Stat3、Survivin、ALT和AST的水平與胃癌患者預(yù)后生存本研究共收集胃癌患者133例，截至2019年10月1日，50例患者生存，83例患者死亡。

Kaplan-Meier生存曲線(圖3)提示：p-Stat3(P=0.010)與Survivin(P=0.005)的表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差；ALT高水平組的患者總體生存率要高于低水平組(P=0.001)；分化程度越低，患者的總體生存率越低(P=0.002)；隨著TNM分期的增高，患者的總體生存率越低(P<0.001)。AST水平的高低對患者預(yù)后的影響無明顯差異(P=0.673)。

圖3 p-Stat3、Survivin、ALT、AST、分化和TNM分期與胃癌患者預(yù)后的生存分析A：p-Stat3表達(dá)情況的生存曲線；B：Survivin表達(dá)情況的生存曲線；C：ALT高低水平的生存曲線；D：AST高低水平的生存曲線；E：不同分化程度的生存曲線；F：不同TNM分期的生存曲線

2.5 胃癌患者的各個(gè)檢測指標(biāo)對預(yù)后生存的預(yù)測價(jià)值如表4所示，在單個(gè)指標(biāo)中，TNM分期、浸潤深度、分化程度、Survivin 、p-Stat3、ALT、分化、年齡均可預(yù)測胃癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)(預(yù)測價(jià)值從大到小)。其中，TNM 分期的AUC 最大(AUC=0.758)，對胃癌患者術(shù)后生存的預(yù)測價(jià)值最大(圖4)。

表4 胃癌患者各個(gè)指標(biāo)間ROC曲線線下面積

圖4 示臨床病理指標(biāo)及免疫組化指標(biāo)預(yù)測胃癌患者預(yù)后生存的ROC曲線

2.6 影響胃癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析綜合單因素和多因素 COX 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型發(fā)現(xiàn)，年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、ALT、p-Stat3及Survivin是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素(表5)。

表5 胃癌患者各指標(biāo)的Cox回歸模型單因素及多因素分析

2.7 ROC曲線評估各指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測胃癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的效能在表6中，聯(lián)合了分化程度、p-Stat3、Survivin、ALT和AST預(yù)測胃癌術(shù)后生存狀況。運(yùn)用減指標(biāo)的方法對5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行逐個(gè)篩減發(fā)現(xiàn)，組合3為指標(biāo)最少且預(yù)測價(jià)值最大的組合。因此Survivin、ALT和AST為本研究中聯(lián)合預(yù)測胃癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的最優(yōu)組合，其AUC高于TNM分期組合。

表6 胃癌患者多指標(biāo)聯(lián)合ROC曲線線下面積

2.8 多指標(biāo)聯(lián)合最優(yōu)組合構(gòu)建列線圖預(yù)測模型本研究模型如圖5所示，Survivin、ALT、AST變量的長度代表了該因素對胃癌死亡事件的貢獻(xiàn)度，向上對應(yīng)分值標(biāo)尺中標(biāo)注的分?jǐn)?shù)，根據(jù)患者的個(gè)體化狀態(tài)，將每一個(gè)變量的分?jǐn)?shù)相加得到一個(gè)總分值，刻度線向下投射即可得出該胃癌個(gè)體的術(shù)后3年或5年的生存率預(yù)測值。

圖5 Survivin+ALT+AST聯(lián)合預(yù)測胃癌患者術(shù)后生存列線圖

2.9 多指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測胃癌患者術(shù)后生存組合的校準(zhǔn)度對本研究的最優(yōu)組合模型進(jìn)行Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，χ2=3.871，P=0.869，并繪制該組合模型的校準(zhǔn)曲線(圖6)，發(fā)現(xiàn)模型預(yù)測到的與實(shí)際觀察到的不良事件發(fā)生數(shù)量基本擬合，一致性較好，預(yù)測水準(zhǔn)較高。

圖6 多指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測模型的Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗(yàn)校準(zhǔn)曲線

3 討論

STAT3能夠通過JAK/STAT通路入核調(diào)控與腫瘤密切相關(guān)的基因，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和血管生成等[4]。本研究顯示，胃癌組織中p-Stat3的表達(dá)明顯高于癌旁組織(表1)，這與Kim et al[5]研究結(jié)果一致，提示p-Stat3可能在正常胃黏膜向胃癌的惡性轉(zhuǎn)變過程中起到了重要作用。一項(xiàng)meta分析[6]顯示，消化系統(tǒng)惡性腫瘤中p-Stat3的表達(dá)會(huì)對患者的預(yù)后造成不良后果。生存分析顯示，隨著p-Stat3表達(dá)水平的升高，胃癌患者的生存預(yù)后越差(圖3)。張傳海 等[7]發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通路的活化與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，p-Stat3有望作為肝癌預(yù)后判斷的參考指標(biāo)，本研究同樣顯示p-Stat3對于胃癌患者的生存預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值(圖4)。

Survivin是一種凋亡抑制因子，能在腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，對腫瘤細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，Survivin在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織(表1)，并且在生存分析中發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差。筆者認(rèn)為，Survivin的表達(dá)在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，并可將其作為胃癌侵襲及預(yù)測生存預(yù)后的分子標(biāo)志物，這與Krieg et al[8]的研究一致。

既往研究[9]表明，一些常見的血清學(xué)指標(biāo)是影響胃癌患者預(yù)后的因素，包括ALT和AST。本研究顯示高水平ALT患者的預(yù)后更差(圖3)，但并未發(fā)現(xiàn)AST對于預(yù)后的影響。Kunutsor et al[10]發(fā)現(xiàn)，歐洲人群中ALT較高的患者發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)可能較低，但在亞洲人群中ALT升高可能增加患癌的風(fēng)險(xiǎn)。

p-Stat3與Survivin的表達(dá)能夠在術(shù)前的活檢標(biāo)本中進(jìn)行檢測，ALT與AST的結(jié)果均可在入院時(shí)的血清學(xué)檢查中獲得，而本研究旨在通過術(shù)前多指標(biāo)聯(lián)合建立預(yù)測患者預(yù)后的模型，為臨床醫(yī)師提供參考。筆者提出假說：在胃癌患者體內(nèi)，與癌變、腫瘤進(jìn)展和患者預(yù)后的相關(guān)基因、分子及組織細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生改變，不會(huì)因外科手術(shù)而發(fā)生逆轉(zhuǎn)，所以，凡是與上述這些改變有關(guān)的分子細(xì)胞學(xué)指標(biāo)，根據(jù)其術(shù)前樣本的檢測結(jié)果應(yīng)該可以預(yù)測這些改變帶來的不良影響。本研究初步建立起一個(gè)預(yù)測價(jià)值較大并且具有臨床應(yīng)用價(jià)值的生存預(yù)后預(yù)測組合(Survivin+ALT+AST)，可作為便捷公式納入臨床中使用，并根據(jù)可視化的列線圖(圖5)，幫助臨床醫(yī)師在術(shù)前進(jìn)行手術(shù)決策、預(yù)判術(shù)后生存概率及制訂術(shù)后最佳治療方案，從而避免治療不足或過度治療帶來的風(fēng)險(xiǎn)。