不同Sap活性白假絲酵母菌對陰道上皮局部免疫的影響

邵明琨，侯夢瑤，羅丹丹，祁文瑾

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的下生殖道感染性疾病。復發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis, RVVC)是指1年內(nèi)有癥狀并經(jīng)實驗室檢查證實的VVC發(fā)作4次或以上[1]。據(jù)全球調(diào)查，75%婦女一生中至少患過1次VVC，40%～50%的女性會反復感染，5%～8%的女性會患RVVC[2]。其中，致病菌的菌種、基因型、耐藥性、分泌型天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartate protease，Sap)和磷酯酶(phospholipase，Plb)在侵襲機制中起著重要作用[3]。陰道局部的Th細胞及其炎癥免疫因子也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。

目前尚無研究對VVC和RVVC致病菌株侵襲力進行分析。該研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性；選取Sap活性有差異的白假絲酵母菌和人陰道上皮細胞共培養(yǎng),分析陰道上皮分泌細胞因子的情況；為VVC和RVVC的發(fā)病機制研究及臨床防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料所有致病白假絲酵母菌均來自昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診VVC、RVVC患者，收集時間為2018年9月—2019年3月。VVC、RVVC診斷標準以《婦產(chǎn)科學》(人民衛(wèi)生出版社，第九版)為依據(jù)。排除：妊娠期、哺乳期、患糖尿病、口服避孕藥、3個月內(nèi)接受過全身抗真菌治療或1個月內(nèi)接受過外用抗真菌藥物治療、患免疫性疾病或正在服用免疫抑制劑、混合陰道感染者。人陰道上皮組織取自在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院因“子宮肌瘤或子宮腺肌癥”行子宮全切術(shù)的患者，取切下的陰道組織約1 cm×1 cm進行實驗。實驗取得患者知情同意、通過醫(yī)院倫理委員會批準。

沙堡羅氯霉素培養(yǎng)基(法國梅里埃公司)；念珠菌顯色平板(上海安圖生物公司)；角化細胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM，美國Gibco公司)；中性蛋白酶(DispaseⅡ，美國Sigma公司)；無菌脫脂奶粉(上海生工公司)；50%卵黃乳液(青島海博生物公司)；人白細胞介素(interleukin，IL)-4、 IL-8、IL-17 ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技公司)；酵母基因組DNA提取試劑盒(Yeast DNA Kit，離心柱型，北京天根科技公司)；PCR Mix(北京天根科技公司)；氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LU)標準粉、兩性霉素(amphotericin，AMB)標準粉、伊曲康唑(itraconazole，ITR)標準粉(北京中國食品藥品檢定研究所)；Alamar Blue(英國Bio-rad有限公司)

1.2 假絲酵母菌純化、菌種鑒定假絲酵母菌純化：用無菌棉拭子將VVC/RVVC患者陰道分泌物接種到沙堡羅培養(yǎng)皿上，再用四區(qū)劃線法分離單菌落。菌種鑒定：嚴格按照安圖念珠菌顯色平板說明書進行鑒定。選取白假絲酵母菌進行下列實驗。

1.3 白假絲酵母菌的基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性檢測使用25S rDNA-PCR法對白假絲酵母菌進行基因分型[5]。標準株為白假絲酵母菌ATCC90028，購自美國細胞典藏中心。

參照CLSI推薦的M27-A3方案中適用于酵母菌的微量稀釋法,對白假絲酵母菌進行FLU、ITR、AMB的體外藥敏實驗。使用Alamar Blue顯色劑來幫助判讀結(jié)果。Alamar Blue保持藍色表示真菌生長受抑制,變?yōu)榧t色表示真菌生長無抑制。根據(jù)CLSI建立的M27-A3中的MIC折點值,將所有菌株分為敏感、非敏感菌株。

用牛奶培養(yǎng)基和蛋黃培養(yǎng)基對鑒定出的白假絲酵母菌行Sap、Plb活性測定。以PA值表示Sap活性，PA =菌落直徑/總直徑(菌落直徑+透明圈)。用PZ值表示Plb活性，PZ=菌落直徑/總直徑(菌落直徑+沉淀圈)。PA或PZ值愈低，菌株的天冬氨酰蛋白酶或Plb的活性愈強[6]。

1.4 人陰道上皮細胞分離培養(yǎng)及鑒定人陰道上皮組織來自昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，置于40 ml HANK′S液(3%雙抗)，低溫轉(zhuǎn)運。組織用含3%雙抗的0.9%氯化鈉溶液洗滌3次(每次10 ml，1 000 r/min離心3 min)，無菌條件下在10 cm皿中剔除壞死組織,于DispaseⅡ中4 ℃過夜消化，第2天將分離出的陰道上皮組織在含15%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中剪碎，PBS洗滌2次。加入兩倍體積的胰酶，37 ℃消化3 min，吸取消化液，用等體積的含血清的培養(yǎng)基中和，混勻消化后的細胞用70 μm的濾膜過濾，PBS洗滌2次。細胞用K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

人陰道上皮細胞培養(yǎng)至第2代，將細胞培養(yǎng)于6孔板中待細胞培養(yǎng)至70%，PBS洗滌3次。4%多聚甲醛固定細胞，按照角蛋白質(zhì)(廣譜)抗體試劑說明書進行細胞鑒定：采用免疫化學染色SP法，一抗為角蛋白質(zhì)(廣譜)抗體，按照1 ∶100稀釋，二抗采用通用二抗進行孵育，采用DAB進行顯色，蘇木精復染后封片，顯微鏡200倍下觀察并計數(shù)陽性細胞數(shù)。

1.5 陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后細胞因子測定按1×106個/ml濃度將細胞接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當貼壁細胞數(shù)達70%～80%時進行傳代，第3代細胞貼壁數(shù)目達70%～80%時進行共培養(yǎng)實驗。從VVC致病白假絲酵母菌中選取Sap活性最弱(Sap弱組)和最強(Sap強組)的菌株各4株，Sap強組Sap活性(PA值)分別為0.247 9、0.242 2、0.272 9和0.278 7，Sap弱組Sap活性(PA值)分別為0.731 4、0.688 3、0.665 5和0.597 4，分別用K-SFM培養(yǎng)液配置菌液濃度為1×106CFU/ml。實驗實驗以不加白假絲酵母菌的人陰道上皮細胞為對照組。分別在共培養(yǎng)后6、12、24、48 h收取上清液，使用ELISA方法測定IL-4、IL-8、IL-17表達量。

2 結(jié)果

2.1 假絲酵母菌純化、菌種鑒定結(jié)果收集VVC菌株100株，RVVC菌株92株。VVC菌株中，白假絲酵母菌有95株，非白假絲酵母菌5株。RVVC菌株中，白假絲酵母菌有86株，非白假絲酵母菌有6株。無論VVC還是RVVC組，白假絲酵母菌所占比例均最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性結(jié)果基因分型：實驗對95株VVC白假絲酵母菌株及86株RVVC白假絲酵母菌株進行基因分型，根據(jù)條帶位置及數(shù)量可將致病白假絲酵母菌分為A、B、C 3型：僅有450 bp片段者為A型，僅有840 bp片段者為B型，兩條片段均有為C型(圖1A)。研究提示，A基因型在VVC和RVVC菌株中所占比例都最高，且VVC致病菌株及RVVC致病菌株的基因型分布無統(tǒng)計學差異(表1)。

藥敏實驗：比較VVC和RVVC兩組白假絲酵母菌的48 h FLU、AMB及ITB藥敏性，分析敏感、非敏感菌株比例后顯示：FLU、AMB及ITB敏感菌株在VVC組和RVVC組中所占比例無統(tǒng)計學差異(圖1D和表1)。

Sap活性及Plb活性檢測：對VVC及RVVC白假絲酵母菌株進行Sap、Plb活性測定(圖1B、C)。VVC組菌株的Sap活性高于RVVC組(P<0.05)，但兩組菌株的Plb酶活性無顯著差異(P>0.05)。見表1。

圖1 白假絲酵母菌基因分型、藥敏實驗及Sap、Plb活性A：白假絲酵母菌基因分型結(jié)果；B：牛奶培養(yǎng)基中檢測Sap活性；黑圈：真菌生長區(qū)域；紅色外圈：Sap酶活性陽性區(qū)域；C：蛋黃培養(yǎng)基中檢測Plb活性；黑圈：真菌生長區(qū)域；紅色外圈：Plb活性陽性區(qū)域；D：體外藥敏實驗結(jié)果；陰性對照：全部保持藍色不變；陽性對照：全部變?yōu)榧t色

表1 VVC與RVVC菌株基因型、藥敏及Sap、Plb活性差異(株，n)

2.3 陰道上皮細胞培養(yǎng)人陰道上皮細胞在分離后的第0～3代都呈鋪路石樣生長，形態(tài)為多角形，輪廓清晰，折光性好。使用細胞角蛋白(廣譜)抗體(免疫組化)試劑盒檢測第2代陰道上皮細胞，陰道上皮細胞陽性比率為100%。見圖2。

圖2 光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)及免疫組化染色 ×200A1～A4：人陰道上皮細胞分離后第0～3代；B：人陰道上皮細胞免疫組化鑒定

2.4 細胞因子檢測結(jié)果陰道上皮細胞與白假絲酵母菌共培養(yǎng)后細胞上清液采用ELISA方法檢測IL-4、IL-8、IL-17。人陰道上皮細胞能分泌IL-4、IL-8、IL-17。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細胞能分泌更多的IL-4,且在感染第12小時達到峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強組陰道上皮細胞IL-4的表達量在感染6、12 h更高(P<0.05)(表2)。感染白假絲酵母菌后，陰道上皮細胞能分泌更高的IL-8，且在感染第6小時就達到峰值，而后保持相同水平。相比Sap弱組，Sap強組的分泌量更多(P<0.05)(表3)。陰道上皮細胞在感染白假絲酵母菌后分泌的IL-17也更高。兩個實驗組的IL-17在感染第6小時就達峰值，而后逐漸降低。相比Sap弱組，Sap強組IL-17的分泌量更高(P<0.05)(表4)。

表2 ELISA檢測細胞上清液中IL-4分泌的情況

表3 ELISA檢測細胞上清液中IL-8分泌的情況

表4 ELISA檢測細胞上清液中IL-17分泌的情況

3 討論

VVC和RVVC的發(fā)病機制包括菌株的侵襲性和局部宿主免疫兩個方面。白假絲酵母菌是VVC或者RVVC中主要的致病菌[7]，通過表達多種毒力因子幫助其入侵以及在宿主體內(nèi)定植，包括形態(tài)變化(酵母相-菌絲相的轉(zhuǎn)變)、表型轉(zhuǎn)換(白菌-灰菌的轉(zhuǎn)換)、耐藥性、基因型及分泌型毒力因子等[8]。本研究比較了VVC和RVVC致病菌株侵襲力的差異性，結(jié)果顯示，除外Sap活性，VVC和RVVC致病菌的菌種、25S rDNA-PCR基因分型、Plb活性、藥物敏感性均無差異。癥狀重、難治療的RVVC致病菌株的Sap活性反而比VVC致病菌株的更低。這些結(jié)果提示，相較于白假絲酵母菌的侵襲力，陰道宿主的免疫反應可能才是VVC、RVVC發(fā)生的主要因素。這與Jabra-Rizk et al[9]的研究近似：白假絲酵母菌侵襲宿主后，疾病的傳播主要由宿主免疫系統(tǒng)介導。本研究中RVVC致病菌株Sap弱的原因估計也跟宿主免疫反應有關(guān)。

Sap具有較高的蛋白水解酶活性，能降解黏膜表面的各種保護分子，為白假絲酵母菌的生長提供營養(yǎng)，增強黏附和侵襲能力；它還可以切斷宿主的天然免疫應答因子，在白假絲酵母菌的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[10]。此外，Sap還能在體內(nèi)誘導宿主產(chǎn)生相應的細胞因子，如IL-1β和IL-18，而IL-1β激活的CD4T細胞能在VVC和RVVC發(fā)病機制中起重要作用[11]。本實驗探討了人陰道上皮細胞分泌IL-4、IL-8、IL-17的情況。IL-4是Th2細胞的代表性細胞因子，其主要作用是誘發(fā)過敏反應，增加對感染的易感性[12]。Th1細胞能激活巨噬細胞和中性粒細胞，增強吞噬和殺菌，起到免疫保護作用。近年來，Th1的保護作用逐步被Th17取代[13]。IL-17作為Th17細胞的主要效應因子，能動員感染部位的中性粒細胞，維持黏膜上皮的完整性，促進抗菌肽β-防御素的釋放，預防白念珠菌感染[14]。中性粒細胞對于宿主抵御侵襲性真菌疾病至關(guān)重要。IL-8是中性粒細胞趨化因子，本研究中以IL-8反映中性粒細胞的募集情況。

本研究顯示，人陰道上皮細胞具有分泌IL-4、IL-8、IL-17的能力，在受到白假絲酵母菌感染后，陰道上皮分泌的IL-4、IL-8、IL-17明顯升高。無論Sap強組還是Sap弱組，3種細胞因子的含量在感染早期就達到高峰，保護性因子IL-8和IL-17分泌的時間則更早，在感染后第6小時就達到高峰。隨著感染時間延長，IL-4和IL-17出現(xiàn)了逐漸降低趨勢，而IL-8維持在相同水平。表明陰道上皮細胞在受到白假絲酵母菌侵襲時，宿主免疫能在短時間內(nèi)被激活，而且保護性因子出現(xiàn)的時間更早、維持時間更長。課題組推測，陰道內(nèi)的免疫因子可能會影響白假絲酵母菌的Sap活性，而且也是臨床中只有部分VVC患者發(fā)展為RVVC的原因之一。但是，體外實驗存在各種限制，如細胞死亡等，今后可以使用動物模型進行深入研究。

本研究還顯示Sap活性高的白假絲酵母菌刺激陰道上皮產(chǎn)生的細胞因子更高，證實了Sap有誘發(fā)宿主免疫的作用，而且這種作用與Sap的高低呈正比。實驗引起一個假想：Sap高的白假絲酵母菌雖然侵襲力強，但是誘發(fā)的宿主免疫也強，因此更容易被宿主殺滅，從而不易復發(fā)。這個假想需要進一步實驗來確定。