TRIM59基因沉默對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

高曉斌，武雪亮，王勝杰，孫光源，王文靜，梁 峰，趙軼峰，劉振顯

近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率及患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1-2]，盡管近年來(lái)結(jié)直腸癌的診斷和治療技術(shù)已經(jīng)取得了較大進(jìn)展，但由于在早期篩查、早期診斷上的諸多困難，部分患者失去了最佳治療時(shí)期，五年生存率并未有明顯提高[3]。因此，探究結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常迫切。三結(jié)構(gòu)域蛋白59(tripartite motif-containing 59,TRIM59)是一個(gè)新型的三結(jié)構(gòu)域蛋白家族(tripartite motif, trim)家族成員，其主要通過(guò)介導(dǎo)蛋白與蛋白間的互相作用，調(diào)控蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無(wú)序化增殖，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[4]?，F(xiàn)階段TRIM59已被證實(shí)在肝癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等腫瘤中高表達(dá)，而TRIM59在結(jié)直腸癌中的研究鮮有報(bào)道，該研究探討沉默TRIM59對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116增殖和細(xì)胞周期的影響，旨在為結(jié)直腸癌的診斷、分子治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8, CCK-8)、電化學(xué)發(fā)光試劑盒以及細(xì)胞周期試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)細(xì)胞凍存液、蛋白質(zhì)裂解緩沖液(RIPA)均購(gòu)于北京索萊寶生物有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；靶向TRIM59的干擾質(zhì)粒RNA(si-TRIM59)和陰性對(duì)照質(zhì)粒(si-NC)購(gòu)自上海吉瑪基因科技有限公司；兔抗人TRIM59單克隆抗體、CDK4、cyclinD1抗體以及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)Abcam生物公司；引物由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、SW480及人正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d更換新鮮培養(yǎng)液。次日倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶，細(xì)胞可進(jìn)行細(xì)胞傳代。細(xì)胞傳代步驟：吸凈舊的培養(yǎng)基，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液與離心管中，置于離心機(jī)中以1 000 r/min離心8 min；重新混懸細(xì)胞，并將懸液于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置TRIM59干擾組(si-TRIM59組)和陰性對(duì)照組(si-NC組)。將1×105/孔細(xì)胞量接種6孔板，培養(yǎng)12～24 h后，待細(xì)胞融合密度達(dá)到60%～70%時(shí)開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染操作說(shuō)明書，每孔轉(zhuǎn)染50 nmol/L si-TRIM59或si-NC。轉(zhuǎn)染完成后采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantity polymerase chain reaction, RT-qPCR)和Western blot驗(yàn)證質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果。

1.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)根據(jù)TRIzol操作說(shuō)明書提取HCT116細(xì)胞總RNA。使用RNA提取試劑盒提取HCT116細(xì)胞中的總RNA；利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)熒光定量試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行PCR定量反應(yīng)。引物序列分別為：TRIM59正義鏈為5′-GGACATGCTGTGTCACATCCT-3′，反義鏈為5′- CTCCTGTTGGTCTCATTTGGT-3′；GAPDH正義鏈為5′- GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反義鏈為5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG -3′。PCR反應(yīng)條件如下： PCR預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，然后60 ℃退火30 s，65 ℃延長(zhǎng)60 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因TRIM59mRNA的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞并用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。上樣后在SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入TRIM59抗體(1 ∶6 000)、cyclinD1抗體(1 ∶8 000)、CDK1抗體(1 ∶4 000)、STAT3抗體(1 ∶4 000)、p-STAT3抗體(1 ∶2 000)、JAK2抗體(1 ∶4 000)、p- JAK2抗體(1 ∶2 000)，在4 ℃下過(guò)夜。TBST漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗在孵育1 h，取出PVDF膜后再TBST漂洗，用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，計(jì)算目標(biāo)條帶的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力吸取100 μl密度為2×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后加入CCK-8試劑，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別在0、24、48、72 h時(shí)450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 克隆形成試驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染si-TRIM59和si-NC轉(zhuǎn)染后的HCT116細(xì)胞，胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，以500個(gè)細(xì)胞數(shù)目/孔接種于6孔板中，并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周。每4 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞克隆形成后，采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌細(xì)胞3～5次，獲取圖像，計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)量。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期細(xì)胞量按照5×105/孔接種在培養(yǎng)板中；待細(xì)胞融合密度達(dá)到60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞；以1 000 r/min離心5 min，取沉淀細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次；經(jīng)預(yù)冷的70%乙醇固定并低溫下孵育3 h，離心棄固定液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，加入50 μg/ml碘化丙啶(PI)染液室溫下避光反應(yīng)30 min進(jìn)行DNA染色，最后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TRIM59在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性采用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的在線網(wǎng)站GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)表明，與癌旁組織相比，TRIM59在結(jié)直腸癌組織中明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) (圖1A)；進(jìn)一步通過(guò)Kaplan-Meier分析TRIM59表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存期和無(wú)病生存期之間的關(guān)系，結(jié)果表明，TRIM59低表達(dá)組患者的總生存期和無(wú)病生存期較TRIM59高表達(dá)患者無(wú)明顯縮短，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log rankP=0.57，log rankP=0.54)(圖1B、C)。上述結(jié)果表明TRIM59在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，但與結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后無(wú)關(guān)。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析TRIM59在結(jié)直腸癌及正常結(jié)直腸黏膜組織中的表達(dá)水平及其與患者預(yù)后的相關(guān)性A：結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中TRIM59的相對(duì)表達(dá)水平；B：Kaplan-Meier生存曲線分析TRIM59表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總生存期的關(guān)系；C：Kaplan-Meier生存曲線分析TRIM59表達(dá)與結(jié)直腸癌患者無(wú)病生存期的關(guān)系

2.2TRIM59mRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平采用RT-qPCR檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞及正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞中TRIM59mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，TRIM59mRNA在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116、SW620、SW480中表達(dá)高于正常結(jié)直腸黏膜細(xì)胞FHC，尤其是在HCT116細(xì)胞表達(dá)最高。

圖2 qRT-PCR法檢測(cè)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中TRIM59 mRNA 的表達(dá)水平

2.3TRIM59siRNA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中TRIM59mRNA及蛋白表達(dá)量的影響將si-TRIM59和si-NC轉(zhuǎn)染HCT116細(xì)胞中，結(jié)果顯示，si-TRIM59組的TRIM59mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平低于si-NC組(t=18.56，P<0.01)。si-TRIM59干擾組TRIM59蛋白相對(duì)表達(dá)水平低于si-NC組(t=16.93，P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染TRIM59 siRNA后結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中TRIM59的mRNA和蛋白表達(dá)水平A：qRT-PCR;B:Western blot;與si-NC組比較：*P<0.05

2.4 敲減TRIM59對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞克隆形成能力的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，與si-NC組相比，敲減TRIM59表達(dá)后，HCT116細(xì)胞的增殖能力下降(48 h:t=3.939，P<0.05；72 h:t=8.828，P<0.01)；細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與si-NC組相比，敲減TRIM59后HCT116細(xì)胞集落形成數(shù)目減少(t=5.18,P<0.01)，表明干擾TRIM59表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力。見(jiàn)圖4。

圖4 CCK-8和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲減TRIM59對(duì)HCT116細(xì)胞增殖和克隆形成能力的影響A:CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖；B：細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)；與si-NC組比較：*P<0.05

2.5 敲減TRIM59對(duì)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-TRIM59組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著增加，S期比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)敲減TRIM59對(duì)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞周期的影響A：si-NC組;B:si-TRIM59組；C：直方圖；與si-NC組比較：*P<0.05

2.6 敲減TRIM59對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響采用Western blot檢測(cè)敲減TRIM59對(duì)細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和CDK4表達(dá)水平，結(jié)果顯示，敲減TRIM59后HCT116中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK4和cyclin D1表達(dá)降低(t=38.41,P<0.01；t=11.65,P<0.01)。見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)干擾TRIM59對(duì)HCT116細(xì)胞周期蛋白的影響與si-NC組比較：**P<0.01

3 討論

TRIM59，又稱為Mrf1(mouse ring finger protein 1)，屬于TRIM蛋白超家族的成員之一，其主要位于人類第3號(hào)染色體上[7]。TRIM59結(jié)構(gòu)包含高度保守的RBCC結(jié)構(gòu)域和涉及蛋白跨膜定位的TM結(jié)構(gòu)域，其主要功能是參與調(diào)控TRIM59細(xì)胞內(nèi)定位[8]。TRIM59可作為原癌基因，在多種實(shí)體惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[9]。Hao et al[10]研究表明，TRIM59在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)與NSCLC患者的年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期密切性相關(guān)；此外，Cox回歸分析結(jié)果表明TRIM59是NSCLC的獨(dú)立預(yù)后因子。提示TRIM59可作為非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)和潛在的治療靶點(diǎn)。Zhou et al[11]采用qPCR和Western blot法檢測(cè)50例胃癌組織和配對(duì)正常組織中TRIM59的mRNA和蛋白水平，結(jié)果表明，胃癌組織中TRIM59mRNA和蛋白水平較癌旁組織明顯升高，且其高表達(dá)與胃癌患者生存時(shí)間縮短相關(guān)。在胰腺癌的研究中，Li et al[12]研究表明，TRIM59在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著增加，并且其高表達(dá)與胰腺癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)。Lin et al[13]研究表明TRIM59在人前列腺癌組織中高表達(dá)，干擾TRIM59表達(dá)可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和克隆形成能力，干擾TRIM59可增加S期細(xì)胞的比例，降低G2/M期細(xì)胞比例，且CDC25A、CDC2和cyclinB1三個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平下降。

與上述結(jié)果相類似，本研究結(jié)果表明，TRIM59在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中均高表達(dá)，提示TRIM59可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

以結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116為研究對(duì)象，構(gòu)建TRIM59基因siRNA載體，將此載體以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方式抑制細(xì)胞中TRIM59mRNA表達(dá)；結(jié)果顯示，敲減TRIM59的表達(dá)抑制了HCT116細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞集落形成能力，導(dǎo)致G1期比例增加，S期比例減低，提示G0/G1期細(xì)胞周期阻滯。以上研究表明，TRIM59在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。

隨后，本研究對(duì)TRIM59促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行初步探索。有研究[14-15]表明，CDK4作為細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子，它與細(xì)胞cyclin D1形成復(fù)合物后可使腫瘤細(xì)胞蛋白發(fā)生磷酸化失活，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而影響腫瘤的惡性進(jìn)程。本研究表明敲減TRIM59表達(dá)后可通過(guò)下調(diào)CDK4和cyclin D1表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。癌基因和抑癌基因的異常表達(dá)參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖。