TNF-α誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞焦亡模型的建立與評價

徐 靚，吳玉嬌，袁曉陽，張 峰，程 剛，張運芳，魏 偉，嚴(yán)尚學(xué)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變和關(guān)節(jié)腔炎癥為主要病理變化的慢性關(guān)節(jié)退變疾病[1]。軟骨細(xì)胞作為軟骨組織中唯一的細(xì)胞類型，其功能的改變在OA中發(fā)揮著不可替代的關(guān)鍵作用[2]。細(xì)胞焦亡又稱細(xì)胞炎性壞死，是一種由gasdermin蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死[3]，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放進(jìn)而激活強烈的炎癥反應(yīng)。最近研究認(rèn)為，細(xì)胞焦亡與OA病理進(jìn)展密切相關(guān)，如焦亡在滑膜變化中起關(guān)鍵作用[4]，與OA疼痛的病理機制相關(guān)[5]，并且會加劇軟骨的退化[6]。已有關(guān)于細(xì)胞焦亡方面的研究多集中于OA滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的相關(guān)研究較少。

基于細(xì)胞焦亡在OA發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探索建立軟骨細(xì)胞焦亡的細(xì)胞模型，對進(jìn)一步闡明OA的病理機制，評價和篩選OA治療藥物具有重要意義。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是參與OA的重要促炎性細(xì)胞因子，可驅(qū)動炎癥級聯(lián)反應(yīng)、誘導(dǎo)大量炎癥和分解代謝因子產(chǎn)生[7]。該研究擬采用兩步酶消化法收集大鼠軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，以不同質(zhì)量濃度TNF-α誘導(dǎo)，模擬OA微環(huán)境，篩選出穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞焦亡體外模型，為進(jìn)一步闡明OA發(fā)生機制、篩選治療OA的藥物并評價其療效及作用機制提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量約120 g，安徽省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)2017-001。本實驗已通過安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所動物實驗倫理審查委員會批準(zhǔn)(編號：PZ-2020-044)。

1.2 主要試劑Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；大鼠IL-1β、IL-18酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海酶聯(lián)公司；TNF-α購自美國Peprotech公司；抗磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65 (Phospho-NF-κB p65, P-p65)抗體及抗p65抗體為美國CST公司產(chǎn)品；抗半胱天冬酶1(caspase-1)抗體及抗gasdermin D(GSDMD)抗體為美國Proteintech公司產(chǎn)品；抗核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding and oligomerization domain-like receptor containing protein 3, NLRP3)抗體及抗β-actin抗體為美國Affinity公司產(chǎn)品；抗基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)抗體及抗Ⅱ型膠原(type Ⅱ collagen, Col Ⅱ)抗體為美國Novus公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器全波長多功能酶標(biāo)儀(型號: Infinite M1000 Pro，瑞士Tecan公司)；熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號: ImageQuant LAS 4000，美國GE公司)；激光共聚焦顯微鏡(型號：TCS SP8)、倒置LED顯微鏡(型號：DMil)(德國徠卡公司)；場發(fā)射掃描電子顯微鏡(型號：GeminiSEM 300，德國蔡司公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 使用手術(shù)刀片緩慢刮取大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，無菌眼科剪將關(guān)節(jié)軟骨剪碎至體積為1 mm×1 mm×1 mm大小，加入0.25%胰蛋白酶置于37 ℃搖箱消化40 min，用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化后，加入0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃搖箱內(nèi)繼續(xù)消化2 h，結(jié)束后將消化液吹散混勻，離心后PBS重懸，再離心，加入完全培養(yǎng)基分散細(xì)胞后轉(zhuǎn)移到普通培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，48 h后首次換液。待細(xì)胞長滿后進(jìn)行傳代處理，三代以內(nèi)原代軟骨細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4.2軟骨細(xì)胞鑒定 以甲苯胺藍(lán)染色與Col Ⅱ免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。采用爬片技術(shù)，細(xì)胞貼壁后取出蓋玻片，4 %多聚甲醛固定20 min，3 %過氧化氫室溫下孵育10 min，5% BSA封閉10 min，滴加Col Ⅱ一抗，4 ℃過夜。復(fù)溫后滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。倒置相差顯微鏡下觀察并拍照記錄。對于甲苯胺藍(lán)染色，固定后用甲苯胺藍(lán)染色5 min，梯度乙醇脫水后常溫干燥，中性樹膠封片。

1.4.3CCK-8法檢測軟骨細(xì)胞的活力 制備細(xì)胞懸液，96孔板每孔加入5 000個細(xì)胞，過夜，細(xì)胞充分貼壁，給予TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激，其中TNF-α(0 ng/ml)為對照組。48 h后每孔加入10 μl CCK-8，避光孵育1.5 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度A值。細(xì)胞活力(%)=[ (A刺激組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.4.4Western blot檢測軟骨細(xì)胞焦亡信號蛋白、MMP-13及Col Ⅱ的表達(dá) 收集TNF-α(0、5、10、20、40 ng/ml)不同濃度刺激后的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入P-p65、p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD、MMP-13、Col Ⅱ、β-actin等一抗孵育過夜，加二抗37 ℃孵育2 h，洗膜顯影。ImageJ軟件分析灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4.5ELISA檢測軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18的水平 收集TNF-α(20 ng/ml )刺激組和對照組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法測定IL-1β、IL-18的濃度。

1.4.6免疫熒光檢測軟骨細(xì)胞GSDMD表達(dá) 將軟骨細(xì)胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術(shù)以4%多聚甲醛固定20 min，用5%BSA封閉1 h，加入抗GSDMD抗體4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1.5 h，以DAPI染核10 min，用抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.4.7掃描電鏡觀測軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 將軟骨細(xì)胞以TNF-α(20 ng/ml)處理48 h后，采用爬片技術(shù)以2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脫水、臨界點干燥、鍍膜、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察經(jīng)過兩步酶消化法分離得到的原代軟骨細(xì)胞為球形，呈懸浮狀態(tài)，大小均一，具有較強的折光性。貼壁后的軟骨細(xì)胞大部分呈圓形、橢圓形或短梭形，培養(yǎng)4 d后，軟骨細(xì)胞呈不規(guī)則的卵圓形或多角形，可見成簇現(xiàn)象。細(xì)胞基本爬滿瓶底后，此時軟骨細(xì)胞多為圓形，胞體豐滿，胞質(zhì)均勻，核大而圓并且互相連接成“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。傳代后細(xì)胞貼壁時間較原代細(xì)胞縮短，增殖速度加快(圖1)。

2.2 軟骨細(xì)胞鑒定3代內(nèi)的陽性軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色可見細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)紫色異染顆粒，Col Ⅱ免疫組織化學(xué)染色可見胞漿呈棕黃色。分離培養(yǎng)后二者均為陽性的軟骨細(xì)胞比例約為98%。見圖2。

圖2 大鼠軟骨細(xì)胞鑒定 ×100A：甲苯胺藍(lán)染色；B：Col Ⅱ染色

2.3 不同濃度TNF-α對細(xì)胞活力的影響以不同濃度TNF-α處理軟骨細(xì)胞48 h，CCK-8檢測結(jié)果顯示(圖3)，隨著TNF-α濃度增加，軟骨細(xì)胞活力逐漸下降。與對照組比較，TNF-α(20、40 ng/ml)可抑制軟骨細(xì)胞活力(F=4.474，P<0.05)。

圖3 不同濃度TNF-α對細(xì)胞活力的影響(n=3)與對照組比較：*P<0.05

2.4 不同濃度TNF-α對軟骨細(xì)胞焦亡信號蛋白的影響圖4結(jié)果顯示，TNF-α(5、10、20、40 ng/ml)均可促進(jìn)軟骨細(xì)胞P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達(dá)，且隨著濃度增加，蛋白表達(dá)水平逐漸升高。TNF-α(5 ng/ml)組P-p65、NLRP3、caspase-1、GSDMD的蛋白表達(dá)與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。TNF-α(10 ng/ml)組P-p65、NLRP3的蛋白表達(dá)與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。而TNF-α(20 ng/ml)和TNF-α(40 ng/ml)處理的焦亡信號蛋白表達(dá)均存在顯著性差異(P<0.05或0.01)。結(jié)合CCK-8結(jié)果，選擇TNF-α濃度為20 ng/ml進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 TNF-α對軟骨細(xì)胞焦亡信號蛋白的影響(n=3)A：GSDMD/β-actin；B：caspase-1/β-actin；C：NLRP3/β-actin；D：P-p65/p65；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.5 TNF-α對軟骨細(xì)胞MMP-13和Col Ⅱ表達(dá)的影響為進(jìn)一步了解TNF-α對軟骨細(xì)胞膠原代謝的影響，實驗檢測了TNF-α(20 ng/ml)刺激軟骨細(xì)胞后MMP-13和Col Ⅱ的表達(dá)水平。圖5結(jié)果顯示，TNF-α(20 ng/ml)可提高軟骨細(xì)胞MMP-13水平(t=4.337，P<0.05) ，降低Col Ⅱ的表達(dá)(t=4.287，P<0.05 )。結(jié)果提示TNF-α(20 ng/ml)破壞了軟骨細(xì)胞內(nèi)的基質(zhì)平衡。

圖5 TNF-α對軟骨細(xì)胞MMP-13和Col Ⅱ表達(dá)的影響(n=3)A：MMP-13/β-actin；B：Col Ⅱ/β-actin；與對照組比較：*P<0.05

2.6 TNF-α對軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18水平的影響ELISA結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-1β、IL-18水平相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激可上調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中促炎細(xì)胞因子IL-1β[(10.210±0.512)vs(24.680±0.449)，t=21.230，P<0.001]和IL-18水平[(40.000±3.408)vs(96.360±5.598)，t=8.599，P<0.01]。結(jié)果提示TNF-α(20 ng/ml)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-18的釋放。

2.7 TNF-α對軟骨細(xì)胞GSDMD表達(dá)的影響GSDMD定位于細(xì)胞質(zhì)中，炎癥環(huán)境下細(xì)胞膜上亦有表達(dá)。與對照組軟骨細(xì)胞相比，TNF-α(20 ng/ml)刺激后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞GSDMD熒光表達(dá)增強。見圖6。

圖6 TNF-α刺激對軟骨細(xì)胞GSDMD表達(dá)的影響 ×630

2.8 TNF-α對軟骨細(xì)胞焦亡形態(tài)學(xué)的影響掃描電鏡結(jié)果(圖7)顯示，對照組軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，TNF-α(20 ng/ml)刺激后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞腫脹變形，細(xì)胞膜穿孔并破裂，顯微結(jié)構(gòu)破壞。結(jié)果提示TNF-α(20 ng/ml)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生焦亡形態(tài)學(xué)變化。

圖7 掃描電鏡下軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化 ×1 000A：對照組；B：TNF-α組

3 討論

在經(jīng)典的焦亡信號中，危險信號可刺激細(xì)胞膜上的模式識別受體并與之結(jié)合，形成由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白和效應(yīng)分子caspase-1組成的NLRP3炎癥小體[8]，這些炎癥小體激活caspase-1后進(jìn)一步切割GSDMD產(chǎn)生膜孔，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹并最終溶解，釋放大量的促炎細(xì)胞因子，如IL-1β、IL-18等，這些致炎性細(xì)胞因子又進(jìn)一步促進(jìn)了焦亡的發(fā)生[9]。近年來研究[6]表明，OA患者的NLRP1和NLRP3表達(dá)水平顯著升高；在OA患者的軟骨中，未及時被吞噬的凋亡小體，可連同軟骨鈣化的增加通過繼發(fā)性細(xì)胞焦亡加重OA[10]，這些研究提示細(xì)胞焦亡與OA的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。

在本研究中，采用兩步酶消化法提取的大鼠軟骨細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)特征明顯，甲苯胺藍(lán)和Col Ⅱ染色為陽性，且純度達(dá)到98%以上，提示軟骨細(xì)胞提取分離成功。TNF-α(20 ng/ml)可抑制大鼠軟骨細(xì)胞活力，致細(xì)胞穿孔破裂、顯微結(jié)構(gòu)破壞，其焦亡特征性信號分子P-p65、NLRP3、caspase-1和GSDMD表達(dá)水平上升，且培養(yǎng)上清液中IL-1β、IL-18水平升高。這些結(jié)果表明，TNF-α(20 ng/ml)可以成功誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞焦亡模型。細(xì)胞外基質(zhì)丟失被認(rèn)為是OA軟骨損傷的主要原因之一[11-12]。在基質(zhì)組成中，Col Ⅱ與其它膠原蛋白及非膠原蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為軟骨提供拉伸強度[13]。在炎癥過程中，NF-κB途徑的激活抑制了軟骨細(xì)胞合成代謝，并誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[2]。TNF-α(20 ng/ml)通過激活NF-κB信號促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞MMP-13表達(dá)升高，誘導(dǎo)Col Ⅱ降解，導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞基質(zhì)破壞。

綜上所述，TNF-α(20 ng/ml)可模擬炎癥微環(huán)境誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞焦亡發(fā)生。該模型可廣泛用于研究OA發(fā)病機制及體外篩選治療OA的潛在藥物。